蘇金良 陳慧 朱莉 陸敏嘉 李明

乙型肝炎病毒相關慢加急性肝衰竭(HBV-related acute-on-chronic liver failure，HBV-ACLF)是在慢性乙肝基礎上短時間內發(fā)生的一種嚴重急性肝功能失代償，疾病進展迅速，救治十分困難。根據(jù)HBV-ACLF發(fā)病機制及疾病進程，慢性乙肝從開始急性加重至肝衰竭常有一段時間，這一段短暫時間為乙肝重癥化或稱為肝衰竭前期(acute-on-chronic-pre-liver failure，pre-ACLF)。目前國內臨床診斷pre-ACLF是根據(jù)我國2012年《肝衰竭診治指南》[1]中肝衰竭前期概念進行診斷，包括消化道癥狀、黃疸及凝血酶原活動度等。然而，肝衰竭前期疾病進程與臨床表現(xiàn)復雜多樣，依據(jù)這些指標存在一定的局限性，預測肝衰竭的發(fā)生率低于25%[2-3]。特異性或非特異性免疫反應在HBV所致肝衰竭的發(fā)病機制中起著十分關鍵的作用，其中Toll樣受體(Toll like receptor，TLR)既參與非特異性免疫，又可以激活特異性免疫應答，導致大量炎性因子的瀑鏈式釋放，引發(fā)肝臟局部和全身炎性反應。Toll樣受體3(TLR3)能識別HBV復制的中間產物雙鏈RNA(dsRNA)，在抗HBV免疫過程中具有重要作用；Toll樣受體4(TLR4)可識別脂多糖內毒素(lipopolysaccharide，LPS)，在肝衰竭發(fā)生時腸道來源的LPS進入血中，是促發(fā)肝衰竭的重要因素之一[4-5]。因此，本文通過檢測pre-ACLF患者TLR3和TLR4的變化，分析其對pre-ACLF的診斷價值。

資料與方法

一、病例來源

選擇2016年12月至2018年6月蘇州市第五人民醫(yī)院住院患者60例，男性46例，女性14 例，年齡26～71歲。其中HBV-ACLF前期患者30例、慢性乙肝患者30例。另選健康對照者15名，男8名，女7名，年齡27～50歲，均系健康獻血員。所有患者均為慢性HBV感染者，排除HCV、HDV感染，病史超過3 年。慢加急性肝衰竭(ACLF)前期診斷參照2012年中華醫(yī)學會肝病學分會、感染病學分會制定《肝衰竭診治指南》[1]的標準；慢性乙型肝炎診斷參照2005年中華醫(yī)學會肝病學分會、感染病學分會制定《慢性乙型肝炎防治指南》[6]的標準。

二、主要試劑和儀器

使用美國BD公司的流式細胞儀檢測外周血單個核細胞中TLR3和TLR4表達水平。單個核細胞TLR3和TLR4表達檢測分別采用FITC-anti-TLR3單克隆抗體和PE-anti-TLR4單克隆抗體，同型對照抗體分別為FITC-mouse IG 2a和PE-mouse IG 2a，上述試劑均為美國BD公司產品。

三、 流式細胞儀檢測外周血單個核細胞表面的TLR3、TLR4

取EDTA抗凝血細胞懸液100 μL，分別依次加入APC-anti-CD14抗體10 μL，F(xiàn)ITC-anti-TLR3抗體10 μL，PE-anti-TLR4抗體10 μL，EDTA抗凝全血100 L，震蕩充分混勻，避光溫育30 min；然后加溶血素2 mL，溶血20 min，離心，棄液體成分；以PBS洗滌2次后，再以PBS配成約106/mL液，然后用BD FACS Calibur流式細胞儀檢測。以APC-CD14陽性設門，壞死細胞和碎片等根據(jù)側向散射特征予以排除，門內細胞即為CD14+單個核細胞，共獲取門內10 000個單個核細胞。對上述10 000個單核細胞的數(shù)據(jù)，經Cellquest統(tǒng)計軟件分析，獲取直方圖，以平均免疫熒光強度(mean fluorescence intensity，MFI)分別表示TLR3和TLR4的表達強度。FITC-mouse IG 2a，kappa 10 μL代替FITC-anti-TLR3，PE-mouse IG 2a，kappa 10 μL代替PE-anti-TLR4抗體作為同型對照。實驗所用抗體均為美國Ebioscience公司產品。

四、生化指標檢測

血清TBil、ALT、AST、PTA、C反應蛋白(C-reactive protein, CRP)等采用常規(guī)實驗室檢查方法檢測。HBV DNA采用實時熒光定量PCR法測定，儀器用美國GeneAmp PE9600型PCR儀。嚴格按產品說明書操作，檢測靈敏度為102cps/mL。

五、統(tǒng)計學分析

結 果

一、一般臨床資料及生化指標

各組患者的一般情況以及臨床生化指標見表1。ACLF前期組患者TBil、ALT、PTA和CRP均明顯升高，與慢性乙肝組和健康對照組比較，均差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。健康對照組與慢性乙肝組比較TBil、ALT、PTA和CRP均差異無統(tǒng)計學意義 (P>0.05)。

二、外周血中TLR3和TLR4表達水平

各組患者外周血中TLR3和TLR4表達水平見表2。ACLF前期組患者外周血中TLR3的MFR明顯升高，分別與慢性乙肝組、健康對照組比較，均差異有統(tǒng)計學意義 (P<0.05)。同時，ACLF前期組患者外周血中TLR4的MFR也明顯上升，分別與慢性乙肝組、健康對照組比較，也均差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而慢性乙肝組患者與健康對照組比較，外周血中TLR4表達水平差異無統(tǒng)計學意義 (P>0.05)。

表1 各組一般臨床資料及生化指標的比較(±s)

注： BMI為體質指數(shù)；TBil為總膽紅素；ALT為丙氨酸轉氨酶；AST為天冬氨酸轉氨酶；PTA為凝血酶原活動度；CRP為C反應蛋白. MELD評分為終末期肝病模型

表2 各組外周血中TLR3和TLR4表達水平的

注：a同組內與健康對照組比較，P<0.05；b同組內與慢性乙肝組比較，P<0.05

三、TLR3和TLR4診斷預警價值

外周血TLR3診斷ACLF前期ROC曲線下的面積(AUC)為 0.830(95%CI為0.728～0.932 ) ,標準誤為0.052;外周血TLR4診斷ACLF前期的ROC曲線曲線下面積為0.977(95%CI為0.948～1.000)，標準誤為0.014。見圖1。

圖1 TLR3和TLR4診斷HCC的ROC 曲線

四、ACLF前期患者4周內發(fā)生ACLF的情況

30例ACLF前期患者中4周內發(fā)生ACLF有7例，未發(fā)生ACLF有23例。發(fā)生ACLF患者外周血中TLR3的MFR為32.37±3.55，而未發(fā)生ACLF患者組外周血中TLR3的MFR為24.56±7.09，二者比較差異有統(tǒng)計學意義 (P<0.05)；同時，與未發(fā)生ACLF患者外周血中TLR4的MFR(13.94±4.95)比較，發(fā)生ACLF患者外周血中TLR4的MFR (22.17±3.51)也有顯著升高 (P<0.05)。

討 論

肝衰竭的發(fā)生發(fā)展及預后取決于肝細胞的壞死和(或)凋亡程度、殘存肝細胞的數(shù)量和功能、肝細胞的再生能力、肝臟的基礎情況(包括纖維化程度) 、并發(fā)癥以及綜合治療是否恰當?shù)?，而TLR參與了肝衰竭各個主要環(huán)節(jié)，與肝衰竭發(fā)展及預后密切相關[7-8]。TLR3可識別各種形式的雙鏈(ds)RNA，包括病毒dsRNA和dsRNA的合成模擬物多聚肌苷酸-多聚胞苷酸 (polyinosinicacid：Polycytidylic acid，polyI:C)。poly I:C作為TLR3的激動劑可以激活TLR3，促進核因子-κB(NF-κB)和干擾素調節(jié)因子3(IRF3)入細胞核，分泌大量干擾素 (interferon，IFN )-γ、IFN-β和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF )-α，導致肝臟炎癥發(fā)生、肝細胞出現(xiàn)大量壞死或凋亡[5,9]。也有研究發(fā)現(xiàn)，TLR3激活在對乙酰氨基酚(aceta-minophen，APAP )所致小鼠肝損傷中起關鍵作用，是APAP誘導所致肝衰竭的必要條件。TLR3激活導致TNFα等明顯增加、顯著促進APAP引起肝臟細胞壞死和炎癥，而TLR3基因缺陷小鼠對APAP的肝組織損傷顯著減輕、TNFα明顯減少[10]。另一方面，肝衰竭發(fā)生時，腸道內革蘭陰性細菌易位，其LPS大量進入血中。LPS 是TLR4的識別受體，TLR4激活后通過髓樣分化因子88(MyD88)依賴途徑啟動NF-κB信號通路及其相關信號級聯(lián)反應，導致TNF-α等大量炎癥因子的瀑鏈式釋放，促進肝衰竭發(fā)生和發(fā)展[11]。研究發(fā)現(xiàn)，二型組蛋白去乙酰酶抑制劑CAY10683通過保護急性肝衰竭大鼠模型中的腸黏膜屏障，控制LPS入血液從而減少對TLR4激活，并下調或抑制LPS/TLR4/MyD88通路，從而減輕肝細胞進一步壞死和炎性細胞浸潤，同時ALT、AST 和TBil水平均有顯著下降[12]。TLR4在APAP誘導的急性肝功能衰竭(ALF)發(fā)生中有重要作用,TLR4基因缺陷的小鼠或經TLR4拮抗劑：e5564處理的小鼠對APAP給藥后72 h的促炎基因表達較少、肝組織炎癥和肝細胞壞死程度較輕，存活率也更高[13]。因此,TLR3和TLR4參與了早期肝衰竭發(fā)生發(fā)展的多個重要環(huán)節(jié)，TLR3和TLR4的表達低下或障礙可能使HBV慢性感染者不能有效地啟動機體免疫反應和肝臟炎癥損害。本文通過檢測HBV-ACLF前期外周血單個核細胞表面的TLR3、TLR4表達后發(fā)現(xiàn)，ACLF前期患者外周血中TLR3和TLR4明顯升高；根據(jù)TLR3和TLR4檢測結果分別繪制ROC曲線, TLR3和TLR4診斷ACLF前期ROC曲線下的面積(AUC)分別為 0.830和0.977。提示ACLF前期患者TLR3和TLR4的變化有助于對ACLF前期的診斷。

綜上所述，臨床上僅僅依靠TBil、PTA等指標對ACLF前期進行早期精準診斷尚不令人滿意，而從HBV所致肝衰竭的發(fā)病機制中進行探索研究、尋找新的可靠的臨床指標很有價值。通過監(jiān)測HBV-ACLF前期患者TLR3和TLR4等變化可了解疾病的進展，有助于對ACLF前期進行早期診斷。本研究臨床病例數(shù)偏少，今后可繼續(xù)擴大樣本量，開展大規(guī)模前瞻性探索性研究和驗證，包括其動態(tài)變化的數(shù)學預測模型或評分系統(tǒng)等，為臨床診療提供更多的理論依據(jù)。