張洪川 張玉璽 段叢迪

原發(fā)性肝癌是我國常見惡性腫瘤之一[1]。骨橋蛋白是一種帶負(fù)電的非膠原性骨基質(zhì)糖蛋白，廣泛的分布于多種組織和細(xì)胞中[2-3]。骨橋蛋白被認(rèn)為與腫瘤的發(fā)生具有一定的相關(guān)性[4]。Ezrin蛋白是細(xì)胞骨架與細(xì)胞膜之間的連接蛋白,參與了微絨毛的形成并與細(xì)胞形態(tài)的維持、運(yùn)動(dòng)、黏附及生存有關(guān)[5]。近年來骨橋蛋白和Ezrin蛋白在早期細(xì)胞免疫應(yīng)答、肉芽腫炎癥、腫瘤發(fā)生與轉(zhuǎn)移的作用中倍受關(guān)注[6]。本研究探討骨橋蛋白和Ezrin蛋白在原發(fā)性肝癌組織中的表達(dá)及其與臨床特征和預(yù)后的相關(guān)性，旨在為原發(fā)性肝癌患者的治療提供理論依據(jù)。

資料與方法

一、一般資料

將2013年1月至2016年12月于濮陽市油田總醫(yī)院治療的原發(fā)性肝癌手術(shù)切除標(biāo)本46例作為研究對(duì)象(A組)，同時(shí)選取不典型增生肝組織標(biāo)本46例(B組)以及正常肝組織標(biāo)本46例(C組)。共選取138例存檔石蠟包埋標(biāo)本，年齡在27～76歲，平均年齡為(45.21±9.34)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均經(jīng)手術(shù)切除治療，術(shù)后病理學(xué)確診為肝癌，患者臨床資料齊全，具有術(shù)后隨訪資料；本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)存在原發(fā)性腎功能障礙者；(2)存在其他系統(tǒng)組織器官惡性腫瘤者；(3)患者術(shù)前接受過放化療治療等。

二、研究方法

(一)免疫組化試劑 濃縮型屬鼠抗人骨橋蛋白單克隆抗體購自美國Santa Cruz生物科技公司；鼠抗人Ezrin基因蛋白單克隆抗體購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；免疫試劑盒購自基因科技有限公司。所有操作方式均按照試劑盒說明執(zhí)行。

(二)免疫組化SP法 按照1∶100稀釋骨橋蛋白和Ezrin蛋白抗體，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。一抗用PBS緩沖液代替作為空白對(duì)照。棕黃色信號(hào)表示陽性，定位于細(xì)胞與胞質(zhì)中。

(三)原位雜交步驟 先在無RNA酶的環(huán)境中進(jìn)行操作，用二甲苯組織切片進(jìn)行脫蠟處理，再經(jīng)過梯度乙醇水化，在37℃下蛋白酶消化30 min，在無水乙醇中脫水10 s，分別滴一滴探針溶液于各切片上，蓋上蓋玻片，保持37℃室溫不變過夜。

(四) TBS浸泡步驟 先打開蓋玻片，TBS洗片3次3 min。同時(shí)于37℃下滴2～3滴高辛抗體等待30 min。TBS浸泡3 min。DAB顯色，蘇木素復(fù)染。如果出現(xiàn)棕黃色顆粒信號(hào)表示雜交陽性，定位于細(xì)胞質(zhì)，以TBS緩沖液代替探針作陰性對(duì)照，原發(fā)性肝癌中骨橋蛋白與Ezrin蛋白陽性于細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，DAB顯色，呈棕黃色顆粒，肝癌組織中蛋白質(zhì)免疫組化染色位于細(xì)胞膜與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，呈棕黃色。參照染色強(qiáng)度和陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)來確定判定結(jié)果。

三、術(shù)后隨訪

隨訪方式采用電話、上門、門診或住院等方式進(jìn)行，記錄肝癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移以及死亡情況。

四、統(tǒng)計(jì)方法

結(jié) 果

一、骨橋蛋白在三組標(biāo)本中的表達(dá)情況比較

A組患者骨橋蛋白陽性率為76.09%(35例)、Ezrin蛋白陽性表達(dá)率為73.91%(34例)明顯高于B組的39.13%(18例)、50.00%(23例)與C組的19.57%(9例)、21.74%(10例)(P<0.05)，B組患者骨橋蛋白和Ezrin蛋白陽性表達(dá)率高于C組(P<0.05)。

二、骨橋蛋白和Ezrin蛋白在肝癌組織中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

骨橋蛋白和Ezrin蛋白表達(dá)水平與患者性別、年齡、HBsAg的陽性表達(dá)、有無肝硬化、腫瘤大小、腫瘤分化程度、AFP水平、腫瘤數(shù)目、TNM分期等臨床病理特征無明顯相關(guān)性(P>0.05)，而在發(fā)生轉(zhuǎn)移與癌組織累及肝被膜患者中骨橋蛋白的陽性表達(dá)率明顯高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移與未累及肝被膜患者(P<0.05)，且腫瘤越大 Ezrin蛋白在癌組織中的陽性表達(dá)率越高(P<0.05)。見表1。

表1 骨橋蛋白與臨床特征的關(guān)系(例，%)

注：與無轉(zhuǎn)移比較，aP<0.05，與未累及肝被膜比較，bP<0.05，與腫瘤≤5 cm比較，cP<0.05

三、骨橋蛋白與患者預(yù)后狀況相關(guān)性分析

骨橋蛋白在陽性患者中位生存時(shí)間為32.10個(gè)月，陰性患者平均生存時(shí)間為37.10個(gè)月，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

四、Ezrin蛋白與患者預(yù)后狀況相關(guān)性分析

Ezrin蛋白在陽性患者中位生存時(shí)間為30.10個(gè)月，陰性患者平均生存時(shí)間為38.10個(gè)月，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

討 論

骨橋蛋白是目前臨床上新提出的一種監(jiān)測(cè)肝癌轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)的指標(biāo)[7]。白治苗等[8-9]研究了骨橋蛋白在子宮內(nèi)膜異位中的表達(dá)情況，結(jié)果證實(shí)骨橋蛋白在子宮內(nèi)膜異位癥中具有較高表達(dá)水平，并且是誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生的關(guān)鍵，為子宮內(nèi)膜異位癥的治療提供了一種新的治療思路。胡雪等[10]研究證實(shí)，骨橋蛋白也參與胃癌的發(fā)病，可較好預(yù)測(cè)胃癌的生長(zhǎng)/浸潤(rùn)以及轉(zhuǎn)移過程所發(fā)生的基因以及分子變化。本研究結(jié)果顯示，骨橋蛋白在肝癌組織中的陽性表達(dá)率明顯高于正常組織與不典型增生患者，提示骨橋蛋白在肝癌的預(yù)測(cè)中具有一定作用，并且參與肝癌的轉(zhuǎn)移，這與以上研究結(jié)果相似。且骨橋蛋白陽性表達(dá)率越高越影響肝癌患者的預(yù)后，這與李穎利[11]、李欣遙等[12]學(xué)者的研究結(jié)果相似。本研究結(jié)果證實(shí)，肝癌患者可通過檢測(cè)骨橋蛋白的表達(dá)情況來判斷腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)以及預(yù)后情況。

Ezrin蛋白是一種細(xì)胞骨架連接蛋白，其對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞活動(dòng)，如生存、黏附、遷移等具有重要作用[13]。本研究結(jié)果顯示，Ezrin蛋白在肝癌組織中表達(dá)率明顯上升，并且在術(shù)后的隨訪中發(fā)現(xiàn)，患者的生存時(shí)間與Ezrin蛋白的表達(dá)情況有密切相關(guān)性，這與黃濤等[16]研究結(jié)果一致。證實(shí)了Ezrin蛋白在肝癌的發(fā)生、發(fā)展具有重要意義，對(duì)肝癌的治療起到一定的指導(dǎo)意義。