杜倩 梁素鈺 李琳 李云紅 田松巖

摘 要：本研究以豐林保護(hù)區(qū)內(nèi)椴樹紅松林0 ～ 10、10 ～ 20、20 ～ 30cm這3個(gè)深度的土壤為研究對(duì)象，對(duì)其土壤酶的活性及土壤微生物群落功能多樣性進(jìn)行研究。結(jié)果表明：土壤顏色變化率（AWCD）隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，但0 ～ 10、10 ～ 20、20 ～ 30 cm三個(gè)土層的AWCD值差異不顯著。不同土層的土壤微生物對(duì)6類碳源的利用能力基本一致，6類碳源利用能力的排序?yàn)椋?胺類>芳香類>多聚物>碳水化合物>氨基酸類>羧酸類。不同土層間土壤微生物群落多樣性指數(shù)和均勻度指數(shù)差異不顯著。從主成分分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，主要貢獻(xiàn)作用的碳源為碳水化合物類、氨基酸類和多聚物類。均勻度指數(shù)與土壤幾丁質(zhì)酶、過氧化氫酶和蔗糖酶之間的相關(guān)性達(dá)到顯著水平;Shannon-Winner指數(shù)和Simpson指數(shù)與土壤酶活性之間的相關(guān)性均不顯著。本研究為今后探討闊葉紅松林及其他林分不同土層之間土壤微生物群落功能多樣性及其對(duì)環(huán)境因子的響應(yīng)提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：土壤微生物群落;BIOLOG-ECO微孔板;功能多樣性;土壤酶

中圖分類號(hào)：S714.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-8023（2019）01-0001-07

Abstract： This experiment studied the soil enzyme activities and microbial functional diversity in 0～10， 10～20， 20～30 cm deep soils of Linden Korean pine forest in Fenglin Reserve. Results showed that the average well color development （AWCD） increased with time， but there was no significant difference in AWCD values between 0～10， 10～20， 20～30 cm soil layers. The utilization of six types of carbon sources in different soil layers was almost the same， with the order of amines>aromatics>polymers>carbohydrates>amino acids>carboxylic acids. There was no significant difference in diversity index and evenness index of soil microbial communities among different soil layers. The results of principle component analysis showed that carbohydrates， amino acids and polymers were the main contributing carbon sources. The correlation between the evenness index and soil chitinase， catalase and sucrose reached a significant level. The correlation between Shannon-Winner index， Simpson index and soil enzyme activity was not significant. This study provides a reference for the future study of soil microbial community functional diversity and its response to environmental factors in different layers of broad-leaved Korean pine forest and other forest stands.

Keywords： Soil microbial community; BIOLOG-ECO microplate; functional diversity; soil enzyme

0 引言

在闊葉紅松林土壤生態(tài)系統(tǒng)中，許多重要的生化反應(yīng)都離不開土壤微生物與土壤酶，它們?cè)谕寥赖拇x過程起著共同推動(dòng)的作用[1-2]，反映了土壤物質(zhì)轉(zhuǎn)化和能量流動(dòng)過程的強(qiáng)度和方向[3-4]，是評(píng)價(jià)土壤質(zhì)量的重要指標(biāo)。土壤酶的主要來源包括土壤微生物的新陳代謝活動(dòng)，而土壤中的碳、氮、磷和鉀等元素的轉(zhuǎn)化強(qiáng)度皆依賴于土壤酶的作用[6-8]。因此，將土壤微生物的多樣性和土壤酶活性合并研究，更好的反應(yīng)土壤的基本狀況，揭示土壤中的物質(zhì)代謝與土壤肥力。很多國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)針對(duì)土壤微生物功能多樣性開展大量的研究，研究的方法也在不斷的改進(jìn)。Biolog法是微生物通過對(duì)多種碳源的利用強(qiáng)度來反應(yīng)微生物群落功能變化的方法[9]，由于該方法測(cè)定簡(jiǎn)單、靈敏度高、分辨力強(qiáng)和獲得數(shù)據(jù)量豐富等優(yōu)點(diǎn)，受到眾多研究者的青睞[9-14]。宋賢沖[1]等人的研究結(jié)果表明隨著土層的加深，土壤平均顏色變化率（AWCD）呈下降趨勢(shì)。吳則焰等[5，16]認(rèn)為生物量、林分凋落物、土壤養(yǎng)分、微小動(dòng)物以及植物根系等多種因素的共同作用是造成土壤微生物群落多樣性隨土層深度的增加而遞減的原因。目前對(duì)于森林土壤微生物群落功能多樣性的大多數(shù)研究為闊葉紅松林的凋落物分解、森林群落動(dòng)態(tài)等 [12-15]。本研究對(duì)豐林保護(hù)區(qū)內(nèi)椴樹紅松林不同土層土壤微生物群落代謝多樣性、土壤酶活性及其與土壤理化性狀的特征進(jìn)行分析，分析椴樹紅松林林下土壤微生物群落功能多樣性及土壤酶活性在不同土層之間的差異，為探討闊葉紅松林及其他林分不同土層之間土壤微生物群落功能多樣性及其對(duì)環(huán)境因子的響應(yīng)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究地概況

豐林自然保護(hù)區(qū)在黑龍江省東北部伊春市五營(yíng)區(qū)，總面積約182km2，地理坐標(biāo)為128°58′～129°15′E，48°02′ ～ 48°12′N，主要是以紅松為主的北溫帶針闊葉混交林。土壤為山地暗棕壤，且土壤肥力較高。屬于中溫帶大陸性濕潤(rùn)季風(fēng)氣候，夏季受海洋季風(fēng)影響，多雨空氣潮濕，光照充足，冬季受蒙古高壓影響，寒冷干燥，雪量不大。年平均氣溫- 0.5 ℃，年平均降水量680 ～ 750 mm，且降水分布不均，無霜期為100 ～ 110 d。

1.2 樣品采集

在豐林保護(hù)區(qū)內(nèi)3塊10 m×20 m的固定椴樹紅松林樣地內(nèi)取樣（表1）。

利用土鉆取樣，在樣地內(nèi)按對(duì)角線蛇形取樣，每個(gè)樣地內(nèi)采集9個(gè)樣點(diǎn)。在每個(gè)樣點(diǎn)用土鉆分0 ～ 10、10 ～ 20、20 ～ 30 cm三層采集土樣。將采集的土樣帶回實(shí)驗(yàn)室，3個(gè)樣點(diǎn)做一個(gè)混合樣，分兩份保存。其中一份用于測(cè)定土壤微生物群落多樣性，需置于4 ℃冰箱保存;另一份土壤風(fēng)干后過篩，用于土壤基本理化性質(zhì)及土壤酶活性測(cè)定。

1.3 分析方法

土壤含水率采用烘干法，樣品重復(fù)測(cè)定3次。

土壤化學(xué)性質(zhì)的測(cè)定包括土壤pH值、土壤全氮、土壤全磷、土壤有機(jī)質(zhì)、土壤速效氮和微生物生物量碳。其中全氮含量采用半微量凱氏法（GB7113-87）測(cè)定;全磷含量采用鉬銻抗比色法利用紫外分光度計(jì)測(cè)定;土壤有機(jī)質(zhì)的測(cè)定采用重絡(luò)酸鉀容量法;速效氮采用堿解擴(kuò)散法;微生物生物量碳采用氯仿熏蒸法浸提;土壤pH采用水浸提電位法。每份樣品各項(xiàng)指標(biāo)重復(fù)測(cè)定3次。

土壤的微生物功能多樣性采用Biolog法對(duì)其進(jìn)行分析。10 g新鮮土壤加入100 mL生理鹽水振蕩15 min，后稀釋1 000倍，取150 μL該懸浮液接種到ECO 板中，25 ℃恒溫培養(yǎng)144 h，每隔24 h測(cè)定一次在590 nm 處的吸光值。

土壤酶活性測(cè)定包括土壤脲酶、土壤蔗糖酶、土壤多酚氧化酶、土壤過氧化氫酶和土壤幾丁質(zhì)酶，土壤脲酶采用苯酚鈉—次氯酸鈉比色法測(cè)定;土壤蔗糖酶活性采用3，5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定;過氧化氫酶活性采用高錳酸鉀滴定法;土壤多酚氧化酶活性采用鄰苯三酚比色法測(cè)定;土壤幾丁質(zhì)酶活性采用N-乙酰葡萄糖胺比色法。

利用excel和spss軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。土壤微生物群落利用碳源的整體能力用ECO板的平均顏色變化率（AWCD）表示，土壤群落功能多樣性采用Shannon-Winner指數(shù)、均勻度指數(shù)、Simpson指數(shù)表征。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤基本理化性質(zhì)

不同土層的土壤基本理化性質(zhì)存在差異（表2）。不同土層土壤 pH 值介于（5.72±0.32） ～ （5.88±0.29）之間，偏酸性且不同土層間差異不顯著。不同土層土壤全氮差異顯著，土壤含水率、有機(jī)質(zhì)、速效氮和微生物生物量碳在0 ～ 10 cm層與10 ～ 20 cm層和20 ～ 30 cm層差異顯著，在10 ～ 20 cm層與20 ～ 30cm層之間差異不顯著，土壤全磷含量在0 ～ 10 cm層與10 ～ 20 cm層差異不顯著且與20 ～ 30 cm層差異顯著，在10 ～ 20 cm層與20 ～ 30 cm層差異不顯著?？傮w來說，不同土層的pH值和容重隨著土層的加深而呈上升趨勢(shì)，土壤含水率、有機(jī)質(zhì)、全氮、速效氮、全磷和微生物生物量碳均隨著土層的加深呈下降趨勢(shì)。

2.2 土壤酶活性分析

土壤酶活性與土壤微生物活動(dòng)息息相關(guān)，在土壤碳、氮循環(huán)中起著重要的作用。不同土壤深度中4種土壤酶活性（過氧化氫酶、幾丁質(zhì)酶、蔗糖酶和脲酶）均隨土壤深度增加而呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)，多酚氧化酶隨土層的加深而升高，即：0 ～ 10 cm > 10 ～ 20 cm > 20 ～ 30 cm。經(jīng)方差分析，土壤過氧化氫酶、多酚氧化酶、幾丁質(zhì)酶、蔗糖酶和脲酶不同土層間土壤酶活性差異均不顯著（P<0.05）。

2.3 土壤微生物利用碳源的動(dòng)力學(xué)特征

2.3.1土壤微生物利用全部碳源的變化特征

平均顏色變化率（AWCD）可作為微生物的整體活性指標(biāo)反映土壤微生物利用單一碳源的能力 [11]。AWCD隨時(shí)間動(dòng)態(tài)變化的曲線可以看出，三個(gè)土層的AWCD值變化趨勢(shì)相似，培養(yǎng)48 h內(nèi)土壤微生物活性較低，AWCD值上升趨勢(shì)較慢，48 ～ 96 h內(nèi)增長(zhǎng)率增高呈快速上升趨勢(shì)，96 ～ 144 h增長(zhǎng)速率減小上升趨勢(shì)減緩，144 h后趨于平穩(wěn)。整體變化趨勢(shì)為：隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，土壤微生物利用碳源的能力逐漸上升。

分別對(duì)三個(gè)土層的AWCD值方差分析（表3），雖然不同深度土壤的AWCD值有下降趨勢(shì)，但三塊樣地內(nèi)不同土層之間的AWCD值差異并不顯著。

2.3.2 土壤微生物對(duì)不同碳源利用強(qiáng)度的分析

ECO板上的共31種碳源，可將其按化學(xué)基團(tuán)的性質(zhì)分成6類（碳水化合物類、氨基酸類、芳香類、多聚物類、胺類和羧酸類）。6類碳源隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加均呈現(xiàn)出微生物利用碳源的量逐漸增加的趨勢(shì)。表4為6類碳源的AWCD平均值。由表4可知，土壤微生物對(duì)6類不同碳源的利用強(qiáng)度存在差異， 0 ～ 10 cm層表現(xiàn)為胺類 > 氨基酸類 > 碳水化合物 > 芳香類 > 多聚物 > 羧酸類;

10 ～ 20 cm層表現(xiàn)為胺類>芳香類>多聚物>碳水化合物>氨基酸類>羧酸類;20 ～ 30 cm層表現(xiàn)為胺類>芳香類>多聚物>氨基酸類>碳水化合物>羧酸類。不同土層之間土壤微生物利用碳源的能力同樣存在差異，氨基酸類碳源利用強(qiáng)度0 ～ 10 cm土層顯著高于 10 ～ 20 cm和20 ～ 30 cm 土層;不同土層土壤微生物利用碳水化合物類、芳香類、多聚物類、胺類和羧酸類的能力差異不顯著。

2.4 碳源利用類型的主成分分析

選取培養(yǎng)96 h后的土壤微生物AWCD 值，對(duì)其利用單一碳源特性進(jìn)行主成分分析。由于其他主成分的貢獻(xiàn)率較小，因此提取與土壤微生物碳源利用相關(guān)的兩個(gè)主成分（PC1和PC2）進(jìn)行分析。第1主成分（PC1） 可解釋變量方差為30.52%，第2主成分（PC2）可解釋變量方差為16.41%，兩個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到46.92%。在PC1方向，0 ～ 10 cm有一個(gè)分散的逸出點(diǎn)，表明數(shù)據(jù)的重復(fù)性較差。0 ～ 10 、10 ～ 20、20 ～ 30 cm 土層分異明顯（圈中分散的數(shù)據(jù)點(diǎn)）。在PC2方向，0 ～ 10 cm 和 10 ～ 20 cm 分別與20 ～ 30 cm土層之間分異明顯，而0 ～ 10 cm和10 ～ 20 cm土層之間分異不明顯?？梢?，主成份1 和 主成份2 基本能夠區(qū)分不同土層土壤微生物的群落特征。對(duì)單一碳源 AWCD 值與主成分得分系數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，31種碳源中12種主要是碳水化合物類、氨基酸類和多聚物類碳源與PC1呈正相關(guān)。4種主要是氨基酸類和碳水化合物類碳源與 PC2 呈正相關(guān)?？梢娞妓衔镱?、氨基酸類和多聚物類碳源在主成分分析中起主要貢獻(xiàn)。

2.5 土壤微生物群落功能多樣性指數(shù)分析

計(jì)算培養(yǎng)96 h 后的土壤微生物群落的多樣性指數(shù)（均勻度指數(shù)、Shannon-Winner 指數(shù)和Simpson指數(shù)）（表5）。結(jié)果表明， 0 ～ 10 cm、10 ～ 20 cm和20 ～ 30 cm 三層土壤微生物群落功能多樣性存在一定的差異，土壤微生物群落功能多樣性在一定程度上隨著土壤深度的增加而下降。土壤微生物Shannon-Winner 指數(shù)在各土層之間的差異不顯著，隨著土壤深度的加深，表現(xiàn)為先下降后上升的趨勢(shì)，其中表層土壤微生物群落種類最多，但三個(gè)土層土壤微生物種類差異不大。均勻度指數(shù)隨著土層的加深，土壤微生物群落的均勻度呈下降的趨勢(shì)，但各土層之間的差異不顯著。Simpson指數(shù)可反映群落中最常見的物種，隨土層的加深呈現(xiàn)下降后略回升，20 ～ 30 cm層回升程度不大，且各層之間差異不顯著。

2.6 土壤酶活性與微生物群落功能多樣性相關(guān)性分析

對(duì)土壤酶活性與微生物群落多樣性的相關(guān)性分析，結(jié)果可知（表6），土壤幾丁質(zhì)酶與土壤微生物群落功能多樣性各指標(biāo)之間呈負(fù)相關(guān)，各多樣性指數(shù)與土壤過氧化氫酶、多酚氧化酶、脲酶和蔗糖酶之間呈正相關(guān)，其中，均勻度指數(shù)與土壤過氧化氫酶和蔗糖酶之間的相關(guān)性達(dá)到顯著水平。而均勻度指數(shù)與幾丁質(zhì)酶呈負(fù)相關(guān)且相關(guān)性達(dá)顯著水平;Shannon-Winner指數(shù)和Simpson指數(shù)與各種土壤酶活性之間的相關(guān)性不顯著。

3 結(jié)論和討論

本研究分析了豐林保護(hù)區(qū)內(nèi)椴樹紅松林不同土層土壤酶活性及微生物群落多樣性。結(jié)果表明： 不同土層土壤 pH 值差異不顯著，土壤含水率、有機(jī)質(zhì)含量、全氮含量、速效氮含量、全磷含量及微生物生物量碳含量隨著土層深度的增加呈下降趨勢(shì)。不同土層土壤多酚氧化酶活性與土層深度呈正相關(guān)，隨土層的加深而升高。其余4種土壤酶活性（過氧化氫酶、幾丁質(zhì)酶、蔗糖酶和脲酶）與土層深度呈負(fù)相關(guān)，隨土壤深度增加而降低，不同深度的各種酶活性間差異不顯著。

0 ～ 10、10 ～ 20、20 ～ 30 cm土層的AWCD值變化趨勢(shì)相似，表現(xiàn)為：隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，土壤微生物利用碳源的能力逐漸增加。培養(yǎng)48 h內(nèi)土壤微生物活性較低，AWCD值上升趨勢(shì)較慢，48 ～ 96 h內(nèi)增長(zhǎng)率增高呈快速上升趨勢(shì)，96 ～ 144 h增長(zhǎng)速率減小上升趨勢(shì)減緩，144 h后趨于平穩(wěn)。表明該區(qū)域微生物的培養(yǎng)時(shí)間至少要48 h。這與吳則焰等[5]、宋賢沖等[1]的研究結(jié)果一致，即AWCD隨著培養(yǎng)時(shí)間的延續(xù)呈現(xiàn)曲線與微生物常規(guī)生長(zhǎng)曲線基本相同。不同的研究報(bào)道中所采用的培養(yǎng)時(shí)間和方法并不統(tǒng)一，如宋賢沖等采用的是144 h的培養(yǎng)時(shí)間，張逸飛等[17-18]采用的是 72 h的培養(yǎng)時(shí)間。本研究是選取培養(yǎng)時(shí)間為96 h的光密度值進(jìn)行分析的，土壤微生物在96 h處于對(duì)數(shù)期，之后生長(zhǎng)減緩后步入穩(wěn)定期，采用96 h培養(yǎng)時(shí)間能更好的反映實(shí)際情況。雖然不同深度土壤的AWCD值有下降趨勢(shì)，但三塊樣地內(nèi)不同土層之間的AWCD值差異并不顯著。土壤微生物對(duì)6類不同碳源的利用強(qiáng)度存在差異，表現(xiàn)為，0 ～ 10 cm層：胺類>氨基酸類>碳水化合物>芳香類>多聚物>羧酸類;10 ～ 20 cm層：胺類>芳香類>多聚物>碳水化合物>氨基酸類>羧酸類;20 ～ 30 cm層：胺類>芳香類>多聚物>氨基酸類>碳水化合物>羧酸類。這一結(jié)果與吳則焰等[5]、宋賢沖[1]等的研究結(jié)果不一致，其原因可能是不同林型條件下造成其微生物群落結(jié)構(gòu)不同所引起的。不同土層土壤微生物利用單一碳源的能力同樣存在差異，0 ～ 10 cm土層氨基酸類的利用強(qiáng)度顯著高于10 ～ 20 cm和20 ～ 30 cm土層;不同土層土壤微生物利用碳水化合物類、芳香類、多聚物類、胺類和羧酸類的能力差異不顯著。主成分分析，第1主成分（PC1） 可解釋變量方差為30.52%，第2主成分（PC2）可解釋變量方差為16.41%，兩個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到46.92%。其中碳水化合物類、氨基酸類和多聚物類碳源在主成分分離中起主要貢獻(xiàn)。

不同深度土層中土壤微生物種類差異不大，0 ～ 10 cm 土層微生物群落種類最多，Shannon-Winner 指數(shù)、Simpson指數(shù)、均勻度指數(shù)最高。天然林地沒有人為干擾，且富含腐殖質(zhì)為微生物提供了較多的能源與養(yǎng)分，促使土壤微生物的生長(zhǎng)繁殖，表層土壤由于凋落物豐富，且隨著凋落物分解有機(jī)質(zhì)等養(yǎng)分含量升高，空氣流通性和溫度條件適宜，為微生物生長(zhǎng)提供良好的生存環(huán)境，因此微生物的種類和數(shù)量在0 ～ 10 cm層均最高。多樣性指數(shù)與均勻度指數(shù)分析結(jié)果表明：均勻度指數(shù)和多樣性指數(shù)與測(cè)定的土壤過氧化氫酶、土壤多酚氧化酶、土壤脲酶和土壤蔗糖酶之間呈正相關(guān)。且均勻度指數(shù)與土壤過氧化氫酶和蔗糖酶之間的呈顯著正相關(guān)，與幾丁質(zhì)酶呈顯著負(fù)相關(guān)。可見，土壤過氧化氫酶、蔗糖酶和幾丁質(zhì)酶是土壤微生物群落物種的均勻度差異的主要原因。

雖然Biolog方法操作便捷，通過微生物對(duì)碳源的利用能力反映微生物群落的總體代謝特征[18]，但是只有能夠利用板上碳源的可培養(yǎng)微生物才能被反映出來，另外，多種微生物在Biology微孔板的孔中混合培養(yǎng)后，可能會(huì)產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)或措抗效應(yīng)，最后微孔板內(nèi)顯示的顏色不一定是各種微生物單獨(dú)產(chǎn)生顏色的簡(jiǎn)單總和。今后應(yīng)該結(jié)合多種分析方法來評(píng)價(jià)椴樹紅松林不同土層土壤微生物的群落功能多樣性變化。

【參 考 文 獻(xiàn)】

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