郝軍莉 章英 楊天兵 王婷 楊宇 王丹

摘要：以羰基還原酶基因工程菌全細胞為催化劑，探討不對稱合成（R）-苯乙醇的各種影響因素，優(yōu)化其產(chǎn)酶和轉化條件。結果表明，優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基為甘油10g/l、蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L（NH4）2SO45g/L、NaCl l0g/L，氨芐青霉素50ug/mL，pH 7.2;誘導劑IPTG的濃度為0.25mmol幾，誘導時間為20h，誘導溫度為18℃，此條件下測得基因工程菌粗酶活最高為6.65u/mL。建立的最佳轉化條件：羰基還原酶基因工程菌發(fā)酵20h后的細胞濃度為03g/mL，轉化體系初始pH為7.0，溫度為37℃，輔助底物異丙醇濃度為10%，底物終濃度為60mmol/L，轉化時間為24h。此時底物轉化率最高可達98.88%，產(chǎn)物對映體過量值（e.e、值）為99.43%。反應體系擴增至3000mL后，產(chǎn)物e.e.值仍保持在99.0%左右，底物轉化率可為92%以上，（R）-苯乙醇的產(chǎn)量也可達到6.67g/L。

關鍵詞：羰基還原酶;基因工程菌;不對稱合成;產(chǎn)酶條件;轉化條件

中圖分類號：Q936文獻標志碼：A 文章編號：1674-5124（2019）-04-0073-07

0引言

手性仲醇作為合成手性藥物、天然產(chǎn)物的重要中間體，可衍生出幾十種制藥行業(yè)急需的手性化合物，如光學活性純的苯乙醇及其衍生物可進一步合成（L）-氯丙那林、（R）-地諾帕明等重要手性藥物。利用微生物或其體內的酶，不對稱合成手性仲醇及其衍生物的方法屬于生物催化法。近年來，生物催化因反應條件溫和、產(chǎn)物立體選擇性高以及對環(huán)境友好等已成為不對稱合成領域的研究熱點。

研究證實微生物基因組中有多個還原酶基因，它們可相互干擾，有的甚至對映體選擇性完全相反。如Napora等在—株解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica的基因組中發(fā)現(xiàn)了5個編碼羰基不對稱還原的還原酶基因，這5個蛋白就被視為假定還原酶（或潛在還原酶）。在此研究背景下，若直接從產(chǎn)酶微生物中分離、純化酶蛋白，將無法精確分離到催化性能優(yōu)良的還原酶。因此，前期采用基因組狩獵策略，對從自然界中篩選到的一株可將模式底物苯乙酮不對稱還原成（R）-苯乙醇的Yarrowia lipolytica cmq6-8的基因組進行搜索分析，構建了一個由31個羰基還原酶基因組成的重組羰基還原酶庫。從該酶庫中篩選到一個催化活性穩(wěn)定且催化效率相對較高的重組羰基還原酶Ylcmq6-8CR。鑒于該重組羰基還原酶在純化過程中酶活損失較大，相比之下全細胞催化具有更好的穩(wěn)定性且基因工程菌體細胞中的確定酶源及誘導調控機制可確保催化過程的高度立體選擇性及底物轉化率，同時基因工程菌自身具備羰基還原酶所必需的輔酶再生功能，可為全細胞催化不對稱合成反應提供所需的輔酶，降低了生產(chǎn)成本。因此，本文以羰基還原酶基因工程菌全細胞為催化劑，探討不對稱合成（R）-苯乙醇的各種影響因素，確定其產(chǎn)酶和不對稱合成（R）-苯乙醇的最佳條件，旨為該方法的工業(yè)化應用提供理論和實驗依據(jù)。

1材料與儀器

1.1藥品與試劑

苯乙酮及其衍生物、（R/S）-苯乙醇均購自中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司，純度為99%;（s）-苯乙醇、（R）-苯乙醇等標準品購自Sigma-Aldrich，ChiraSelect，≥99.0%（sum of enantiomers，GC）;異丙基-β-D硫代半乳糖苷（IPTG），上海美季生物技術有限公司;氨芐青霉素購自BIOSHARP公司;其他試劑均為市售分析純或生物試劑。

1.2菌株及各種培養(yǎng)基

羰基還原酶基因工程菌E.coliBL（DE3）/pET32a-vlcmq6-8cr為課題組自建。斜面培養(yǎng)基（LA固體培養(yǎng)基）：蛋白胨10.0g/L，酵母浸出粉5.0g/L，NaCl10.0g/L，氨芐青霉素0.05g/L，瓊脂粉17.0gm，pH7.2;種子和初始發(fā)酵培養(yǎng)基均為LA液體培養(yǎng)基。上述培養(yǎng)基的滅菌條件均為121℃、20min。

1.3儀器設備

超聲破碎儀（上海五相儀器儀表有限公司JY一1800L）;氣相色譜儀（上海海欣色譜儀器有限公司，GC960），HP Chiral 10%3-Cyclodextrin手性色譜柱（30m×0.32mm×0.25um）;高速冷凍離心機（常州市萬豐儀器有限公司TG-16G）;低速離心機（北京醫(yī)用離心機廠），等。

2方法

2.1羰基還原酶基因工程菌的誘導表達

從羰基還原酶基因工程菌的保藏斜面上刮一環(huán)菌苔于種子培養(yǎng)基37℃、170r/min搖床培養(yǎng)12h;再按10%的接種量轉人發(fā)酵培養(yǎng)基，37℃、170r/mm搖床培養(yǎng)，待發(fā)酵液OD₆₀₀達到0.6～0.8時，添加0.25mmol/LIPTG誘導10h。

2.2粗酶液的酶活測定

收集誘導后菌體細胞，超聲破碎后取上清液，制備粗酶液。根據(jù)NAD（P）H在340nm波長下有特異性吸收，利用分光光度計檢測340nm吸收值的變化確定其酶活性，反應體系如表1所示。酶活力單位定義：測定條件下每分鐘消耗1umol的NAD（P）H所需的酶量。酶活力計算公式如下：

2.3產(chǎn)酶條件優(yōu)化

2.3.1碳源、氮源及其配比

利用單因素方法，在初始發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎上考察碳源如葡萄糖、蔗糖、甘油，以及復合氮源及其劑量對羰基還原酶基因工程菌的生物量和粗酶活性的影響。

2.3.2誘導條件

探討誘導劑IPTG的濃度（0.25，0.5，0.75，1mmol/L）、誘導溫度（37，18℃）、誘導時間（0，6，10，16，20h）等因素對誘導酶表達量的影響。

2.4基因工程菌菌體細胞的培養(yǎng)及其轉化

從菌種斜面上刮1環(huán)菌苔接種于20mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、170r/rain搖床培養(yǎng)24h后收集發(fā)酵液，于6000r/min、4℃離心10min獲得菌體細胞，再用pH 6.8的磷酸鹽緩沖溶液洗1次后進行稱重，并稱取2g濕菌體轉接人20mL pH 6.8的磷酸鹽緩沖溶液中，按終濃度為45mmol/L加入底物苯乙酮，30℃、170r/mm，轉化24h。

2.5產(chǎn)物GC分析

還原反應結束后，反應液用乙酸乙酯萃?。?：1，v/v），再用無水MgSO4干燥后使用GC-960氣相色譜儀進行產(chǎn)物分析。檢測條件：載氣為氮氣，進樣器、色譜柱和FID檢測器溫度分別為220℃、110℃和200℃;分流比為l：100;進樣量為0.1mL。分別以底物轉化率（Conversion）和產(chǎn)物的對映體過量值（e.e.value）表示反應的轉化程度和立體選擇性，其表達式如下：

式中：co—一底物的初始濃度;

C苯乙醇——反應終止時的產(chǎn)物濃度;

CR，Cs——（R）型和（s）型產(chǎn)物的濃度。

2.6轉化條件優(yōu)化

以Conversion（%）及產(chǎn)物e.e.值為考察指標，利用羰基還原酶基因工程菌全細胞為催化劑，單因素方法探究影響不對稱還原反應的主要因素，包括轉化時間（2，4，6，12，16，20，24，28，32，36h），輔助底物種類（正丁醇、甲醇、異丙醇、乙醇、甘油、葡萄糖）及最適輔助底物濃度（2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%、18%、20%），反應體系初始pH（4、5、6、6.2、6.6、6.8、7、8、9），轉化溫度（20，24，28，32，34，37，40，42，45，50℃），底物濃度（35，40，45，50，55，60，65，70，75，80mmol/L），菌體細胞濃度（0.1，0.15，0.2，0.25，0.3，0.35，0.4，0.45，0.5，0.55，0.6g/ml）等，最終建立最佳轉化條件。

2.7反應體系放大實驗

在最佳轉化條件的基礎上，逐級放大轉化體系：50，100，250，500，l 000，2000，3000mL，以（R）-苯乙醇的產(chǎn)量g/L為評價指標，考察反應體系的穩(wěn)定性。（R）-苯乙醇的實際產(chǎn)量計算方法如下：

式中：y——產(chǎn)物（R）-苯乙醇的實際產(chǎn)量;

Conversion（%）——底物轉化率;

ER——（R）-苯乙醇的對映體過量值;

Es——（s）-苯乙醇的對映體過量值;

Yo——物的理論產(chǎn)量，即底物全部轉化成產(chǎn)物的質量。

3結果

3.1發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

3.1.1最佳碳源及配比

和初始發(fā)酵培養(yǎng)基相比，添加不同劑量的葡萄糖、蔗糖、甘油作為唯一碳源時，工程菌的菌體生物量和粗酶活性均有所提升，見表2。其中以10g甘油為唯一碳源時，菌體生物量和粗酶活性均最高。因此，發(fā)酵培養(yǎng)基中確定添加甘油為唯一碳源，添加劑量為10gm。

3.1.2最佳氮源組合及添加劑量

在碳源考察結果的基礎上，進一步考察復合氮源對菌體細胞的生長和粗酶活性的影響。結果如表3所示，發(fā)酵培養(yǎng)基中含有復合氮源時，菌體細胞的生物量和粗酶酶活性明顯高于只含有機氮源的培養(yǎng)基。因此，發(fā)酵培養(yǎng)基確定添加復合氮源，即10gm蛋白胨、5gm酵母浸粉、5g/L（NH4）SO4。

3.2誘導條件優(yōu)化

3.2.1IPTG最適濃度

如圖1所示，添加IPTG后目的蛋白表達量明顯增多，并具有一定的濃度依賴性。但考慮到IPTG濃度過大會對菌體細胞產(chǎn)生毒副作用，最終確定IPTG的濃度為0.25mmol/L。

3.2.2最佳誘導時間

如圖2所示，重組羰基還原酶表達量隨誘導時間的延長而增加，誘導20h后酶的表達量最高，故確定最佳誘導時間為20h。

3.2.3最佳誘導溫度

如圖3所示，經(jīng)37℃誘導大部分目的蛋白以包涵體形式存在;當誘導溫度降為18℃時，不僅目的蛋白的表達量增加，且大部分以可溶形式存在于細胞破碎液中。原因可能是低溫可減慢菌株的生長和代謝速度，從而有利于目的蛋白的正確折疊，有效降低包涵體的形成量，使目的蛋白多以可溶性形式存在。最佳產(chǎn)酶條件下，羰基還原酶基因工程菌的粗酶活最高可達6.65U/mL，是優(yōu)化前最高值

3.44U/mL的1.93倍。

3.3轉化條件優(yōu)化

3.3.1最佳轉化時間

如圖4所示，隨轉化時間的延長，底物轉化率逐漸增加;24h時，底物轉化率趨于平穩(wěn)。此時，延長反應時間對提高底物轉化率無明顯作用。分析原因可能是底物苯乙酮和不斷累積的產(chǎn)物苯乙醇均為有機化合物，它們過量時均可抑制微生物菌體細胞的生長，從而導致細胞內的羰基還原酶活性降低，此時再延長轉化時間，對底物轉化率及產(chǎn)物e.e值的影響不大，最終確定最佳轉化時間為24h。

3.3.2最佳輔助底物及其最適濃度

如圖5所示，反應體系中未加輔助底物時，羰基還原酶基因工程菌仍可不對稱還原部分苯乙酮。原因在于基因工程菌在發(fā)酵過程中利用培養(yǎng)基提供的甘油為碳源進行生長時，甘油作為能源物質經(jīng)菌體細胞的分解代謝可產(chǎn)生羰基還原酶所必需的輔酶NAD（P）H，因此菌體細胞內累積了一定量的輔酶，它們與胞內羰基還原酶的共同作用實現(xiàn)了底物苯乙酮的不對稱還原。因此，為實現(xiàn)輔酶的再生需向反應體系中額外添加甘油等輔助底物。當以2%異丙醇為輔助底物時，獲得底物轉化率最大，葡萄糖和乙醇次之，而產(chǎn)物e.e值相差不大，故確定異丙醇為最適輔助底物。

如圖6可知，未添加輔助底物時，由于沒有后續(xù)能源物質補給，細胞中還原型輔酶數(shù)量逐漸減少甚至消失，所以底物轉化率較低。隨著添加的輔助底物異丙醇的濃度增加，底物轉化率也隨之增加，當濃度達到10%時，底物轉化率達到最大值，若再增加異丙醇的濃度，底物轉化率不增反降?？紤]到異丙醇濃度對產(chǎn)物e.e值影響較小，最終確定輔助底物異丙醇的最適合濃度為10%。

3.3.3反應體系最適初始pH及溫度

如圖7所示，轉化體系初始pH為7.0時底物轉化率和產(chǎn)物e.e值最大，故確定反應體系的最適初始pH為7.0。隨著溫度的增加獲得的底物轉化率也不斷加大，當溫度達到37℃時，獲得的底物轉化率最大，若溫度繼續(xù)增高，底物轉化率反而下降，見圖8。這是由于過高的溫度會使化學本質為蛋白質的酶變性失活，考慮到溫度對產(chǎn)物e.e值的影響不大，故確定轉化最適溫度為37℃。

3.3.4最適底物濃度

為獲得更多產(chǎn)物，嘗試不斷增大轉化體系中的底物濃度。如圖9所示，隨著底物濃度的增加，獲得的底物轉化率也增大。當?shù)孜餄舛仍黾拥?0mmol/L時獲得的底物轉化率達到最大值，若再進一步增加底物濃度，底物轉化率不增反降，原因在于底物濃度過大會抑制菌體細胞生長以及細胞內的氧化還原酶活性，因此確定最適底物濃度為60mmol/L。

3.3.5最適細胞濃度

如圖10所示，反應體系中基因工程菌細胞含量逐漸增加，底物轉化率也逐漸增高。這是因為當?shù)孜餄舛炔蛔儠r，增加菌體細胞的量相當于增加反應體系中催化劑的數(shù)量，進而加快了轉化進程，底物轉化率增加。當細胞濃度增加到0.3g/mL時，底物轉化率最大，若再增加菌體細胞的含量，底物轉化率變化不大。分析原因可能是反應體系中過多的菌體細胞，不能很好地分散在磷酸鹽反應體系中，有的菌體細胞在振搖過程中還發(fā)生貼壁現(xiàn)象，導致發(fā)揮催化作用的細胞含量實際并沒有增加，甚至減少了。考慮到細胞濃度對產(chǎn)物e.e.值的影響不大，故轉化反應的最適細胞濃度為0.3g/mL。

3.4反應體系放大實驗

最佳轉化條件下反應體系擴大至3000mL，產(chǎn)物e.e值仍保持在99.0%左右，底物轉化率為92%以上，（R）-苯乙醇的產(chǎn)量也可達6.67g/L，見表4。

4結束語

本文利用前期構建的羰基還原酶基因工程菌全細胞為催化劑，探討發(fā)酵培養(yǎng)基、誘導條件等因素對重組羰基還原酶活性的影響，建立最佳產(chǎn)酶條件，羰基還原酶基因工程菌粗酶活最高達6.65U/mL，是優(yōu)化前的1.93倍。鑒于重組羰基還原酶在純化過程中酶活性損傷較大，故利用羰基還原酶基因工程菌全細胞為催化劑，深入探究了轉化時間、溫度、pH等多種因素對轉化反應影響，建立最佳轉化條件，在此基礎上將反應體系擴大至3000mL，產(chǎn)物e.e.值仍保持在99.0%左右，底物轉化率為92%以上，（R）-苯乙醇的產(chǎn)量也可達6.67g/L。后續(xù)為獲得穩(wěn)定的羰基還原酶制劑，將進一步研究酶的純化工藝，以提高其催化活性的穩(wěn)定性。同時，還將嘗試細胞固定化等方法，解決生物催化劑回收和重復利用等技術問題，為該方法的工業(yè)化應用奠定基礎。