常 璐,牛志剛,王 剛,肉司旦·有力瓦司,艾山·買買提,林嘉鵬,史洪才*

(1.石河子大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院,新疆 石河子 832003;2.新疆畜牧科學(xué)院 農(nóng)業(yè)部家畜繁育生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室,新疆 烏魯木齊 830026;3.新疆五征綠色農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司,新疆 麥蓋提 844600;4.新疆麥蓋提縣畜牧獸醫(yī)站,新疆 麥蓋提 844600;5.新疆麥蓋提縣種羊場(chǎng),新疆 麥蓋提 844600)

0 前言

綿羊的繁殖力是一個(gè)極其復(fù)雜的性狀,受遺傳、環(huán)境和飼養(yǎng)管理?xiàng)l件等多種因素的影響,其中遺傳是最主要的影響因素,內(nèi)分泌也起到重要作用。研究者發(fā)現(xiàn)骨骼形態(tài)發(fā)生蛋白受體IB基因(bone morphogenetic protein-IB,FecB)是綿羊多胎的主效基因[1]。在FecB基因外顯子6上發(fā)生A746G突變,這個(gè)突變?cè)斐删幋a蛋白質(zhì)的氨基酸發(fā)生了改變,影響了下游控制卵泡發(fā)育基因的表達(dá),從而影響母羊卵巢中大量有腔卵泡早熟及排卵數(shù)增加[2]。在哺乳動(dòng)物的發(fā)情過程中,控制卵泡的發(fā)育是調(diào)節(jié)動(dòng)物發(fā)情周期的關(guān)鍵因素。雌性動(dòng)物的性周期和生殖活動(dòng)受下丘腦-垂體-促性腺激素軸的調(diào)控。不同繁殖時(shí)期的生殖激素分泌水平不同,而生殖激素水平的差異影響動(dòng)物的繁殖力[3]。

多浪羊是新疆南疆地區(qū)的一個(gè)優(yōu)良的肉脂兼用型地方綿羊品種,具有體格大、早熟、產(chǎn)肉率高的特點(diǎn)。多浪羊母羊在四季均可發(fā)情,平均產(chǎn)羔率為113%～130%。羔羊在早期生長(zhǎng)發(fā)育快,周歲時(shí)期的單、雙羔羊體重幾乎沒有差異,是典型的適宜農(nóng)區(qū)生產(chǎn)的理想品種。多浪羊群體存在多胎主效基因FecB突變,該突變引起了多浪羊產(chǎn)羔數(shù)的增加[4]。近年來,利用同期發(fā)情技術(shù)能有效提高繁殖率和生產(chǎn)管理水平,使母羊在一定時(shí)間內(nèi)集中發(fā)情、集中配種、集中產(chǎn)羔。但關(guān)于多浪羊同期發(fā)情后相關(guān)激素水平的測(cè)定暫時(shí)未見相關(guān)報(bào)道。我們?cè)诜欠敝臣竟?jié)研究了FecB不同基因型多浪羊,在外源激素同期發(fā)情處理的基礎(chǔ)上比較了FecB不同基因型母羊同期發(fā)情效果,測(cè)定了與綿羊繁殖有緊密關(guān)系的E2、P4、LH、FSH的濃度,以期為合理利用FecB基因培育多浪羊高繁殖力品系提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)羊的選擇、管理和分組

于2018年7～9月,在新疆喀什麥蓋提縣多浪羊良種繁育中心挑選健康、膘情中等的多浪羊母羊174只,年齡1～2歲。其中B+型母羊49只,++型母羊125只。種公羊選2歲以上、健康、性欲旺盛、精液質(zhì)量好的成年公羊;試情羊選用有配種史、性欲旺盛的本地公羊。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品和材料

羊用孕酮海綿栓(CIDR,新西蘭Inter Greaulane公司)、注射用絨促腺素(HCG,寧波市三生藥業(yè)有限公司)、孕馬血清促性腺激素(PMSG,寧波市三生藥業(yè)有限公司)。生理鹽水、酒精、碘酒、高錳酸鉀粉、青霉素、新潔爾滅、采精內(nèi)胎和外殼、開膣器、輸精槍、1 mL注射器等均為國(guó)產(chǎn)。根據(jù)ELISA試劑盒說明書(Abcam,上海)進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 同期發(fā)情實(shí)驗(yàn)羊的處理

本試驗(yàn)采用單因素設(shè)計(jì),共設(shè)2個(gè)組,在母羊生殖道內(nèi)均埋置海綿栓,在放栓期間觀察母羊陰道有無(wú)炎癥反應(yīng),若有膿性分泌物并伴有黏膜潮紅和出血現(xiàn)象時(shí),則應(yīng)給予治療。在第11天于臀部肌肉注射孕馬血清330 IU/只；在第13天早上撤栓；在發(fā)情12 h后于臀部肌肉注射人絨毛促性腺激素0.1 mg/只。

1.4 母羊發(fā)情的鑒定

在早上和傍晚氣溫較低時(shí),將戴有試情布的多浪羊公羊放到母羊圈各試情1次,如果母羊出現(xiàn)搖尾、外陰部腫脹、接受爬跨、分泌黏液則為發(fā)情表現(xiàn)；每間隔12 h試情1次,連續(xù)試情3 d；在60 h內(nèi)發(fā)情視為同期處理有效,記錄每只羊從撤栓到發(fā)情的時(shí)間間隔,集中飼養(yǎng)。

1.5 人工授精

采集健康公羊的精液,進(jìn)行質(zhì)量檢查。分別在母羊發(fā)情后的12 h和24 h，采用開膣器法,于子宮頸口輸入鮮精0.1 mL。

1.6 母羊妊娠的鑒定

在發(fā)情母羊人工授精60 d后，用獸用B超直腸檢查進(jìn)行妊娠診斷，判定是否受孕,統(tǒng)計(jì)受胎率。

1.7 血樣采集和激素濃度的測(cè)定

挑選發(fā)情癥狀明顯的多浪羊母羊89只,其中B+基因型32只,++基因型57只,對(duì)每只母羊在撤栓、發(fā)情0 h、發(fā)情12 h和發(fā)情24 h時(shí)空腹靜脈采取血樣2 mL,在室溫下靜置4～6 h,以3000 r/min離心15 min,分離上層血清于1.5 mL的離心管中,應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)測(cè)定發(fā)情期經(jīng)產(chǎn)母羊血清中雌二醇(Estradiol, E2)、卵泡刺激素(Follicle stimulating hormone, FSH)、促黃體素(Luteinizing hormone, LH)和孕酮(Progesterone, P4)的濃度。根據(jù)ELISA試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS 22.0 (SPSS, Inc, Chicago, IL, USA)對(duì)發(fā)情率、受胎率數(shù)據(jù)進(jìn)行卡方檢驗(yàn);應(yīng)用SPSS 22.0中的重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)分析和單因素ANOVA分析方法對(duì)不同F(xiàn)ecB基因型綿羊外周血中E2、FSH、LH和P4濃度的測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性評(píng)估,結(jié)果以平均值表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同F(xiàn)ecB基因型母羊在各時(shí)間段內(nèi)同期發(fā)情效果

在埋栓過程中,均沒有出現(xiàn)掉栓現(xiàn)象。由表1可知：B+和++型多浪羊組在60 h內(nèi)的總發(fā)情率分別為83.67%和85.60%,差異不顯著；B+型多浪羊的發(fā)情時(shí)間集中在24～48 h內(nèi),期間內(nèi)的發(fā)情率為73.46%；++型多浪羊的發(fā)情時(shí)間集中在24～36 h,發(fā)情率為75.2%。

2.2 多浪羊人工授精受胎率情況

由表2可見,經(jīng)人工授精后，++型多浪母羊的受胎率為67.29%,B+型母羊的受胎率為65.85%,差異不顯著。

2.3 不同F(xiàn)ecB基因型多浪羊血清中FSH、LH、E2和P4濃度的比較

2.3.1 FSH濃度的比較 從表3可以看出:在撤栓、發(fā)情0 h、12 h和24 h時(shí),不同F(xiàn)ecB基因型多浪羊在4個(gè)時(shí)間點(diǎn)血清中FSH濃度均表現(xiàn)為B+型高于++型,但差異均不顯著。

表1 不同F(xiàn)ecB基因型母羊在各時(shí)間段內(nèi)同期發(fā)情效果 %

注:受試B+和++型多浪母羊的總數(shù)分別為49和125只。同一列數(shù)據(jù)后附相同字母表示差異不顯著，附不同小寫字母表示差異顯著(P<0. 05),附不同大寫字母表示差異極顯著(P<0. 01)，下同。

表2 多浪母羊經(jīng)人工授精后受胎率情況

表3 B+型與++型多浪羊血清中FSH濃度的比較 IU/L

2.3.2 LH濃度的比較 從表4可以看出：各時(shí)間點(diǎn)血清中LH濃度均表現(xiàn)為B+型高于++型,但在不同基因型組間均無(wú)顯著性差異。

表4 B+型與++型多浪羊血清中LH濃度的比較 ng/L

2.3.3 E2濃度的比較 由表5可知：B+型在觀察期內(nèi)4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的分泌水平都高于++型,其中在撤栓和發(fā)情0 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn),B+型血清中E2濃度極顯著高于++型的(P< 0.01)；B+型血清中在4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的平均E2濃度也極顯著高于++型的(P<0.01)。

表5 B+型與++型多浪羊血清中E2濃度的比較 ng/L

2.3.4 P4濃度的比較 由表6可知：在發(fā)情0 h、12 h和24 h時(shí)，B+型血清中的P4濃度均高于++型的,但差異不顯著；在撤栓時(shí)B+型血清中的P4濃度極顯著高于++型的(P<0.01);對(duì)4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的平均P4濃度而言,B+型顯著高于++型的(P<0.05)。

表6 B+型與++型多浪羊血清中P4濃度的比較 pmol/L

3 討論

3.1 FecB不同基因型多浪羊同期發(fā)情效果比較

綿羊FecB基因?qū)嶋H上為骨骼形態(tài)蛋白IB型受體(FecB)基因。研究表明,由于Q249R氨基酸替代使FecB與其配體結(jié)合能力降低,導(dǎo)致其功能部分喪失,最終導(dǎo)致綿羊排卵率和產(chǎn)羔數(shù)的增加[5]。史洪才等在2011年首次在新疆多浪羊群體中發(fā)現(xiàn)了FecB突變并且驗(yàn)證了其與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)性,發(fā)現(xiàn)B+型多浪羊的產(chǎn)羔數(shù)均值比++型多0.51只(P<0.01)[4]。本研究選取空懷多浪羊母羊174頭做同期發(fā)情處理,其中B+型多浪羊49只,結(jié)果顯示：B+和++型多浪羊在60 h內(nèi)的總發(fā)情率分別為83.67%和85.60%,前者略低于后者,但差異不顯著；與++型多浪羊相比,B+型多浪羊的發(fā)情時(shí)間長(zhǎng)。因此對(duì)多浪羊進(jìn)行海綿栓配合激素實(shí)施同期發(fā)情處理時(shí),建議延長(zhǎng)B+型多浪羊的配種時(shí)間。此外，++型母羊的受胎率為67.65%,B+型母羊的受胎率為65.85%,說明受胎率不受FecB基因突變的影響。B+型個(gè)體作為父、母本往往在育種過程中被選用于擴(kuò)繁群體,因此在生產(chǎn)實(shí)踐中畜牧工作者需要針對(duì)B+型個(gè)體的特殊情況來制定不同的配種和繁殖策略。

3.2 多浪羊FecB不同基因型同期發(fā)情激素濃度的變化

生殖激素與綿羊性器官、性細(xì)胞、性行為的發(fā)生和發(fā)育以及發(fā)情、排卵、妊娠、胚胎發(fā)育、分娩、泌乳等生殖活動(dòng)有著密不可分的聯(lián)系。FSH和LH是參與并調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育和竇狀卵泡排卵的重要激素[6]。2008年高立坤等發(fā)現(xiàn)高繁殖力的濟(jì)寧青山羊血漿中FSH濃度較高,在全年各月份和4個(gè)季節(jié)中均高于低繁殖力的沂蒙黑山羊，但差異不顯著[7]。不同F(xiàn)ecB基因型母羊的外周血中LH濃度沒有顯著性差異,但BB型母羊的LH脈沖幅度有時(shí)較高,而在不同基因型綿羊間LH脈沖頻率相似,因而BB型母羊仍傾向于具有較高的LH水平[8]。本試驗(yàn)在多浪羊群體中發(fā)現(xiàn),B+型在觀測(cè)期任何時(shí)間點(diǎn)的FSH和LH濃度都高于++型,但在兩種FecB基因型群體間差異不顯著。FSH和LH是促進(jìn)卵泡發(fā)育和排卵的主要激素,其中LH在卵泡選擇性發(fā)育過程中起主要作用,血液中LH基礎(chǔ)濃度的高低與母羊排卵數(shù)的多少有關(guān)系[9-11]。由于不同的FecB基因型綿羊在排卵數(shù)表型上表現(xiàn)差異顯著,推測(cè)FecB基因突變后可能會(huì)導(dǎo)致FSH和LH激素的大量分泌。后來,研究者們又證明了FecB基因突變并不一直影響FSH和LH的分泌[12-13]。FecB不同基因型多浪羊血清中的FSH和LH濃度均差異不顯著,說明攜帶FecB基因的綿羊可能對(duì)FSH和LH激素更為敏感[14-15]。

E2是卵巢分泌的一種類固醇激素,與卵泡發(fā)育密切相關(guān)。卵子發(fā)育對(duì)發(fā)情時(shí)的E2高濃度水平有積極的反饋?zhàn)饔?而E2濃度的下降對(duì)配種后促進(jìn)胚胎著床和維持正常妊娠活動(dòng)有重要作用。Bartlewski等[16]研究發(fā)現(xiàn)高繁殖力Finn羊相比于低繁殖力Finn羊,血清中存在更高的E2濃度,且差異極顯著(P<0.01)。楊華等[17]對(duì)FecB不同基因型多胎薩福克羊外周血中生殖激素水平進(jìn)行測(cè)定時(shí)發(fā)現(xiàn),發(fā)情期多胎薩?？四秆虻腇ecB基因突變使E2水平升高。本試驗(yàn)結(jié)果表明B+型多浪羊群體在觀察期的E2濃度極顯著高于++型群體的,與上述研究結(jié)果一致。

P4是由黃體和胎盤產(chǎn)生的類固醇類激素,與E2協(xié)同作用促使母畜表現(xiàn)出發(fā)情。FecB基因編碼區(qū)突變,改變了骨骼形態(tài)發(fā)生蛋白在綿羊卵巢中的信號(hào)傳遞機(jī)制,影響其天然配體BMP4和GDF5對(duì)孕酮產(chǎn)生抑制的作用,相比于++型,B+型的顆粒細(xì)胞對(duì)于GDF-5和BMP-4的刺激敏感度較低,導(dǎo)致分泌更高的孕酮水平[18],結(jié)果導(dǎo)致顆粒細(xì)胞的分化速度加快,進(jìn)而促進(jìn)卵泡成熟,排卵數(shù)增加[19]。McNatty等[20]發(fā)現(xiàn)不同F(xiàn)ceB基因型中BB型母羊的血清中P4水平較高。我們選擇的母羊沒有BB型,但B+型P4濃度較高。在山羊卵巢中P4濃度高,更容易產(chǎn)生小卵泡[21-23]。在本試驗(yàn)中,FecB不同基因型多浪羊血清中P4水平呈顯著差異,推測(cè)B+型在發(fā)情周期的卵泡發(fā)育中起到重要作用,使卵巢可能傾向于產(chǎn)生更多的成熟體積較小的卵泡。

4 結(jié)論

在非繁殖季節(jié),對(duì)不同F(xiàn)ecB基因型多浪羊用CIDR+PMSG+HCG進(jìn)行同期發(fā)情處理,同期發(fā)情效果及受胎率不受FecB基因突變的影響。FecB基因突變對(duì)不同基因型多浪羊外周血中生殖激素E2、P4的分泌水平有顯著的影響,但不影響FSH、LH的分泌。FecB基因突變研究結(jié)果可為合理利用FecB基因培育多胎肉羊提供科學(xué)依據(jù)。