郭莉 何軼群 盧建 鐘銀環(huán) 任叢勉 鄭來(lái)萍 尹愛(ài)華

廣東省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心，廣東省婦幼代謝與遺傳病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（廣州511442）

Wolf-Hirschhorn 綜合征（Wolf-Hirschhorn syndrome，WHS）是一類嚴(yán)重出生缺陷的疾病，患者具有典型的面部特征，常伴有生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、智力低下和癲癇發(fā)作［1］。WHS是由于4號(hào)染色體短臂（4p）末端部分缺失引起的多種先天性異常，1965年由WOLF和HIRSCHHORN 首次報(bào)道。WHS 在活產(chǎn)兒發(fā)病率為1/50 000 至1/20 000，女性多見(jiàn)［2］。由于WHS 發(fā)病率低，以往報(bào)道多是針對(duì)出生后患兒的個(gè)案［3］，單個(gè)機(jī)構(gòu)產(chǎn)前診斷為WHS 胎兒的報(bào)道較少，產(chǎn)前胎兒臨床特點(diǎn)總結(jié)較少，導(dǎo)致產(chǎn)前診斷相對(duì)困難。因此，WHS 準(zhǔn)確的產(chǎn)前診斷對(duì)出生缺陷防治具有重要意義。一直以來(lái)，染色體疾病診斷金標(biāo)準(zhǔn)是傳統(tǒng)染色體G 顯帶技術(shù)，尤其是介入性產(chǎn)前診斷。與傳統(tǒng)技術(shù)相比CMA技術(shù)具有分辨率高、不平衡染色體易位定位準(zhǔn)確、無(wú)需細(xì)胞培養(yǎng)、高通量等優(yōu)點(diǎn)，并逐步推廣至產(chǎn)前染色體疾病診斷。本研究通過(guò)傳統(tǒng)染色體G 顯帶，結(jié)合CMA分析，對(duì)高危孕婦進(jìn)行產(chǎn)前診斷，并結(jié)合超聲檢查、唐氏生化篩查、父母染色體G 顯帶檢查、孕婦年齡和妊娠結(jié)局隨訪等綜合分析，探討WHS 胎兒臨床診斷和特點(diǎn)，為產(chǎn)前遺傳咨詢提供依據(jù)。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象2013年1月至2018年12月在廣東省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心就診或外院轉(zhuǎn)診的孕婦，因高齡、產(chǎn)前超聲篩查異常、唐氏生化篩查高風(fēng)險(xiǎn)、無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢查（noninvasive prenatal testing，NIPT）高風(fēng)險(xiǎn)、不良生育史、夫婦雙方之一染色體異常等需介入性產(chǎn)前診斷，行傳統(tǒng)染色體G 顯帶或CMA 檢測(cè)共34 956例，術(shù)前均經(jīng)充分知情并簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 唐氏生化篩查/NIPT孕9～13+6周行唐氏Ⅰ期（妊娠相關(guān)血漿蛋白-A+人絨毛膜促性腺激素）/孕15～20+6周行唐氏Ⅱ期（人絨毛膜促性腺激素+游離雌三醇+血清甲胎蛋白），或孕12 周后胎兒染色體非整倍體的NIPT 篩查。

1.2.2 染色體G 顯帶分析超聲引導(dǎo)下采集樣本，孕16～24 周取羊水，孕25～32 周取臍靜脈血。按常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行胎兒細(xì)胞培養(yǎng)、收獲、制片、G 顯帶及核型分析。核型命名依據(jù)《人類遺傳學(xué)國(guó)際命名體制ISCN（2016）》。胎兒染色體異常，建議父母外周血染色體檢測(cè)。

1.2.3 CMA 分析CMA 檢測(cè)采用美國(guó)Agilent 公司8 × 60k 微陣列芯片或美國(guó)Affymetrix 公司Cyto-ScanTMHD 芯片，按實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格進(jìn)行DNA 提取、雜交和全基因組掃描等操作并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，查詢OMIM、UCSC、ISCA、DGV、DECIPHER等數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.2.4 產(chǎn)前超聲篩查使用彩色多普勒超聲診斷儀，腹部凸陣探頭，對(duì)胎兒進(jìn)行產(chǎn)前系統(tǒng)的超聲掃查，包括胎兒頭顱、心臟、消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、脊柱、四肢等，記錄異常數(shù)據(jù)并比較。

2 結(jié)果

2.1 一般情況診斷WHS 共14例，在所有介入診斷病例中發(fā)生率為1/2 500。其中12例為單純4p 末端缺失，2例為染色體隱匿性不平衡易位。孕婦平均年齡30.1±5.9歲（20～40歲），平均孕周27.9±3.5 周（21～35 周），羊水6例，臍帶血8例。除4例在中孕期診斷外，其他大多在晚孕期。明確診斷后孕婦和家屬均要求終止妊娠。

2.2 唐氏生化篩查/NIPT除2例孕期未進(jìn)行篩查，2例直接做NIPT，其余10例均進(jìn)行唐氏生化篩查（表1）。唐氏生化篩查5例提示高風(fēng)險(xiǎn)，5例低風(fēng)險(xiǎn)。NIPT 檢測(cè)4例，結(jié)果均提示低風(fēng)險(xiǎn)。

2.3 胎兒染色體G 顯帶G 顯帶分辨率約450 條，檢出13例4p 末端部分缺失，缺失位點(diǎn)不盡相同（表1、圖1）。其中4p15.3 缺失病例數(shù)最多見(jiàn)，有5例（病例4 至病例8）；隱匿性不平衡易位導(dǎo)致4p16.1 缺失2例（病例13和14），易位重接在4p16.1 末端斷點(diǎn)，極容易漏診。2例遺傳自母親不平衡易位染色體（病例4和病例13）。1例G 顯帶正常，而CMA 提示微缺失（病例1）。

圖1 正常4 號(hào)染色體和WHS 異常4p 末端G 顯帶核型比較Fig.1 Comparison of G banding karyotype between normal chromosome 4 and abnormal 4p distal of WHS

2.4 胎兒CMA 分析檢出14例WHS，包括G 顯帶檢出所有病例，并額外檢出1例G 顯帶正常的病例（病例1）。檢出的缺失在4p15.1～4p16.3 之間，缺失片段大小為6.5～34.7 Mb（圖2）。病例1 缺失片段為3.4 Mb，在常規(guī)G 顯帶不能檢出；該例胎兒雙親外周血CMA 檢測(cè)正常，提示胎兒異常為新發(fā)。此外，病例4 至8（共5例）G 顯帶均為4p15.3 缺失（圖1），但CMA 提示缺失位點(diǎn)不一，缺失片段從10.9 Mb到18.2 Mb不等，相差最大達(dá)7.3 Mb（圖2）。

2.5 產(chǎn)前超聲檢查14例WHS 胎兒超聲均提示異常，13例在中/晚孕期發(fā)現(xiàn)。其中，最多表現(xiàn)為胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限（intrauterine growth restriction，IUGR）（12例）；其次為腎發(fā)育異常（9例），主要表現(xiàn)為腎臟輪廓模糊、皮髓質(zhì)分界不清、腎盂擴(kuò)張、腎臟體積小于孕周、腎位置低等（圖3）。此外，鼻骨發(fā)育異常、心血管異常各5例，唇腭裂、單臍動(dòng)脈各3例，顏面異常、羊水過(guò)少各2例，NT 增厚、小下頜、室管膜下囊腫、側(cè)腦室增寬、膈疝、股骨發(fā)育不良、脊柱異常各1例。

圖2 CMA 檢出14例產(chǎn)前胎兒WHS 缺失4p 末端片段大小與正常4p 末端片段模式圖比較（Mb）Fig.2 Compared the size of 4p terminal fragment deletion of 14 cases by CMA and normal 4p pattern（Mb）

3 討論

WHS 患者臨床特點(diǎn)是典型的顱面特征，包括形如“希臘武士頭盔”（鼻梁過(guò)寬，延續(xù)至前額），小頭畸形、眼距增寬、小頜畸形、短人中、眉弓高拱、嘴角向下等，其他癥狀包括生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、智力低下、癲癇、腦結(jié)構(gòu)異常、骨骼異常、先天性心臟病、聽(tīng)力缺陷等［1］。大多患兒自出生第一年起即發(fā)育遲緩，青春期后體重增長(zhǎng)極差；嚴(yán)重智力低下占65%，中度和輕度分別占25%和10%［4］。產(chǎn)前WHS可胎死宮內(nèi)，或出生后第一年內(nèi)死亡，給孕產(chǎn)婦及其家庭帶來(lái)沉重的身心傷害和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。大多數(shù)胎兒由于嚴(yán)重的IUGR 伴或不伴其他超聲異常，或因家族性染色體易位而發(fā)現(xiàn)［5］。因此，對(duì)WHS的早期產(chǎn)前診斷顯得尤為重要。

圖3 WHS 胎兒腎發(fā)育異常超聲特點(diǎn)Fig.3 Ultrasound features of fetal renal dysplasia in WHS

在本研究IUGR 是最多見(jiàn)的超聲特征，大多數(shù)病例早期不明顯，中/晚孕期才出現(xiàn)，胎兒發(fā)育均低于第10 百分位數(shù)。其次，腎發(fā)育異常超過(guò)半數(shù)（9/14），高于文獻(xiàn)［6］報(bào)道，考慮文獻(xiàn)報(bào)道中該分類僅以腎發(fā)育不良作為指標(biāo)，本研究將胎兒腎的各種發(fā)育異常歸為一類，包括腎發(fā)育不良、腎臟輪廓模糊、皮髓質(zhì)分界不清、腎盂擴(kuò)張、腎臟體積明顯小于孕周、腎位置低等。因此本研究提示胎兒腎的各種發(fā)育異?？赡苁钱a(chǎn)前WHS 重要表現(xiàn)之一，而且往往在早期僅僅表現(xiàn)腎臟偏小，孕早期容易錯(cuò)過(guò)診斷，到孕晚期伴隨腎發(fā)育不良、羊水過(guò)少。此外，也有報(bào)道［7］稱羊水過(guò)少可作為WHS 唯一發(fā)現(xiàn)，提示胎兒腎功能受到嚴(yán)重影響可能。所以，產(chǎn)前超聲篩查孕早期提示胎兒腎臟偏小等發(fā)育異常，需引起注意并繼續(xù)監(jiān)測(cè)腎臟大小、羊水量和是否合并IUGR 以排除WHS。本研究發(fā)現(xiàn)鼻骨發(fā)育異常5例，較文獻(xiàn)報(bào)道［8］高，考慮本院較早將鼻骨作為產(chǎn)前篩查指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)更多的WHS 胎兒鼻骨異常。因此，孕早期發(fā)現(xiàn)鼻骨異常，如鼻骨缺失和發(fā)育不良，合并上述腎發(fā)育異常，應(yīng)考慮WHS 早期表現(xiàn)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)心血管異常5例，單臍動(dòng)脈、唇腭裂各3例；顏面異常、羊水過(guò)少各2例。XING等［8］對(duì)10例產(chǎn)前WHS研究發(fā)現(xiàn)IUGR（97.7%）和典型的面部表現(xiàn)（82.9%）最為常見(jiàn)，其他較不常見(jiàn)的包括腎發(fā)育不全（36.2%）、心臟畸形（29.8%）、唇腭裂（25.5%）、大腦異常（25.5%）、骨骼異常（21.3%）和鼻骨發(fā)育異常（12.8%）。相比之下，本研究胎兒顏面異常發(fā)現(xiàn)率較低，考慮超聲篩查顏面容易受擋、異常不典型引起。因此，本研究認(rèn)為超聲未發(fā)現(xiàn)胎兒顏面異常不能排除WHS。

表1 14例產(chǎn)前診斷WHS 胎兒臨床特點(diǎn)和染色體核型分析Tab.1 Clinical characteristics and karyotype analysis of 14 cases of prenatal diagnosis of WHS

WHS 被認(rèn)為是4p 部分缺失引起的一種連續(xù)基因綜合征，基因組的復(fù)雜性是表現(xiàn)多樣的原因之一，被認(rèn)為是一種臨床表型多樣的疾?。?］。目前WHS 可分為3 類：（1）缺失片段3.5Mb 以內(nèi)，定位在4p16 至4p 末端，表現(xiàn)輕微；該類往往由于傳統(tǒng)G 顯帶分辨率局限容易被漏診；（2）缺失片段在（5～18）Mb 之間，具有典型的WHS 表型；（3）缺失片段大于22 Mb，常表現(xiàn)為嚴(yán)重畸形。本研究中12例為單純4p 末端缺失，2例不平衡易位。按上述分類，第一類有1例，早孕期僅表現(xiàn)為NT 增厚；第二類有9例，其中6例在晚孕期發(fā)現(xiàn)，多表現(xiàn)為IUGR、腎發(fā)育異常、軟指標(biāo)異常等，并發(fā)現(xiàn)早/中孕期超聲異常不典型而錯(cuò)過(guò)產(chǎn)前診斷最佳時(shí)機(jī)；第三類有4例，其中3例在中孕期發(fā)現(xiàn)，為較嚴(yán)重的IUGR和多發(fā)結(jié)構(gòu)異常。總的來(lái)說(shuō)，缺失片段越大、癥狀越嚴(yán)重者可較早發(fā)現(xiàn)。但也有例外，如病例1 缺失片段3.4 Mb，早孕期僅表現(xiàn)NT 增厚，但中孕期表現(xiàn)IUGR和腎發(fā)育不良，臨床表現(xiàn)如上述第二類較嚴(yán)重者；在第二類中2例比同類嚴(yán)重，如病例5的脊柱異常和病例8的主動(dòng)脈瓣反流、雙側(cè)室管膜下囊腫、唇腭裂等；第三類中有3例均表現(xiàn)為嚴(yán)重結(jié)構(gòu)異常，包括雙側(cè)腦室增寬、腭裂、膈疝、心臟增大、股骨發(fā)育不良、顏面部異常、鼻骨發(fā)育不良、單臍動(dòng)脈等，但病例10 卻相對(duì)較輕相當(dāng)于第二類的表現(xiàn)。特征性顏面異常只有2例，提示胎兒顏面特征不如出生后患者明顯，產(chǎn)前病例不能僅從顏面異常來(lái)除外WHS。因此，不能通過(guò)超聲異常程度判斷4p 末端缺失片段大小，早孕期缺乏超聲表現(xiàn)，中孕期異常不典型也易被忽略，往往在晚孕期發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重異常時(shí)錯(cuò)過(guò)最佳診斷時(shí)機(jī)。

由于WHS 關(guān)鍵區(qū)在4p 末端5 Mb 大小以內(nèi)，目前報(bào)道涉及4p16.3 末端至少68 kb 大小缺失［1］，該區(qū)域缺失即可引起臨床癥狀。多年來(lái)傳統(tǒng)染色體G 顯帶技術(shù)是介入性產(chǎn)前診斷檢測(cè)核型的金標(biāo)準(zhǔn)。但受該技術(shù)分辨率局限，G 顯帶很難檢測(cè)5～10 Mb 以內(nèi)的單純?nèi)笔Ш碗[匿性易位，甚至在G 顯帶上缺失位點(diǎn)相同，而實(shí)際可達(dá)數(shù)十Mb 差別。本研究病例1的G 顯帶正常，CMA 發(fā)現(xiàn)4p 有3.4 Mb缺失。病例4 至8的G 顯帶示4p15.3 缺失，但CMA提示該5例缺失片段從10.9 Mb 到18.2 Mb 不等，相差最大達(dá)7.3 Mb，提示CMA 定位更為準(zhǔn)確。此外，本研究中病例13和病例14 為隱匿性不平衡易位，易位片段較小，僅從G 顯帶很難判斷是否異常，不能判斷易位小片段的來(lái)源，需結(jié)合CMA 才能明確判斷。所以，診斷WHS僅靠傳統(tǒng)G顯帶存在少部分病例漏診或誤診，實(shí)際WHS 發(fā)生率可能高于目前報(bào)道，因?yàn)橐酝\斷WHS 多采用傳統(tǒng)G 顯帶檢測(cè)。因此，CMA 在診斷小片段缺失或隱匿性易位的WHS具有非常重要的作用。如果胎兒G顯帶正常，臨床上懷疑WHS的應(yīng)進(jìn)一步行CMA 檢測(cè)。本研究10例唐氏生化篩查，5例提示高風(fēng)險(xiǎn)，包括3例18-三體高風(fēng)險(xiǎn)和2例21-三體高風(fēng)險(xiǎn)，表明該篩查對(duì)WHS 具有一定的提示作用，尤其早期9～13+6周篩查，可更早提示W(wǎng)HS 風(fēng)險(xiǎn)。除唐氏生化篩查外，近年推廣的NIPT 主要應(yīng)用二代測(cè)序技術(shù)，通過(guò)孕婦外周血提取胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞DNA 來(lái)篩查胎兒是否患21、18、13 三種常見(jiàn)染色體三體綜合征。在本研究4例中，NIPT 結(jié)果低風(fēng)險(xiǎn)，考慮檢測(cè)范圍不包括WHS 以及技術(shù)本身的局限性。但隨著技術(shù)發(fā)展和測(cè)序的深入，NIPT作為篩查WHS具有廣闊前景。

確定胎兒4p 缺失的來(lái)源對(duì)遺傳咨詢和再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估至關(guān)重要，可以有效降低WHS 患兒出生。有報(bào)道［9］50%～60%的WHS 由單純4p 末端部分缺失引起，40%～45%伴有不平衡易位染色體，包括新發(fā)異?；蜻z傳自家族不平衡易位染色體。本研究中大多數(shù)（12/14）病例為新發(fā)異常，孕婦大多為初次妊娠，或之前已分娩一正常孩子，估計(jì)再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)較低，但不能排除生殖腺鑲嵌體的可能；2例遺傳自母親不平衡易位染色體，其再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)增加，或?qū)е聫?fù)發(fā)性流產(chǎn)，應(yīng)建議下次妊娠及早產(chǎn)前診斷或第三代試管嬰兒技術(shù)。本研究大多數(shù)（9/14）的孕婦為低齡，提示孕婦高齡并非WHS 主要因素，近年本中心對(duì)微缺失綜合征的研究提示也未發(fā)現(xiàn)高齡因素［10］。

綜上所述，WHS 早期產(chǎn)前超聲篩查不易發(fā)現(xiàn)，孕中/晚期主要表現(xiàn)為IUGR，本研究提示胎兒鼻骨發(fā)育不良和腎發(fā)育異常可能是最早表現(xiàn)之一，應(yīng)注意鑒別。唐氏生化篩查高風(fēng)險(xiǎn)對(duì)WHS 有一定提示作用，需結(jié)合超聲判斷是否進(jìn)一步介入性產(chǎn)前診斷。懷疑WHS 時(shí)需及時(shí)介入性產(chǎn)前診斷，染色體G 顯帶和CMA 檢測(cè)均可確診，但少部分WHS涉及4p 末端缺失片段較小，僅憑G 顯帶可能漏診，應(yīng)行CMA 進(jìn)一步明確。CMA 對(duì)染色體4p 末端缺失具有準(zhǔn)確定位的作用，對(duì)隱匿性不平衡易位和微小片段缺失的WHS 具有重要診斷意義。