1.中國林業(yè)科學院資源昆蟲研究所，云南 昆明 650233；2.玉溪師范學院化學生物與環(huán)境學院，云南 玉溪 653100

脫發(fā)已經(jīng)成為一個世界性的難題，它嚴重影響患者的自尊心。脫發(fā)藥物的研究與開發(fā)成為當今研究熱點。文獻報道延長毛囊生長期能有效的阻止毛發(fā)的脫落[1]。提高毛囊營養(yǎng)供應和阻止毛囊由生長期進入退休期是阻止毛發(fā)生長的有效措施之一,由皮乳頭細胞分泌血管內皮生長因子(VEGF)是毛囊營養(yǎng)的主要來源[2]。VEGF通過促進毛細血管的形成，調控與毛球相連的毛細血管的數(shù)量，為毛囊的生長提供營養(yǎng)。存在于毛囊的內根鞘的表皮生長因子。具有調節(jié)角質細胞的增殖和分化，促進外根鞘細胞的生長，控制毛囊生長期的長短的作用[3-5]。毛囊的生長周期分為生長期、退行期和休止期，不同生長階段毛囊的形態(tài)和毛囊內堿性磷酸酶的表達量不同。生長期，毛囊逐漸由表皮層延伸到真皮層，毛囊柄逐漸延長，毛球膨大呈圓形，毛囊結構完整(即在毛囊橫切面能明顯看到毛干、內根鞘、外根鞘和芥蒂組織)。退行期，毛囊從真皮層逐漸萎縮上升到表皮層，毛囊柄萎縮變短，毛球呈釘型，毛囊的內根鞘結構紊亂，看不到毛囊內根鞘[6]。休止期，毛囊柄繼續(xù)縮短，位于皮膚的表皮層。由于毛囊循環(huán)具有不可逆性，因此，生長期毛囊數(shù)量和退行期毛囊數(shù)量的比值是評價毛囊生長狀態(tài)重要的指標之一[7]。堿性磷酸酶是存在于毛囊內的有一種鋅指酶，其表達量的高低反應了毛囊所處的生長階段。堿性磷酸酶表達量在毛囊生長期的初級階段最高，隨后逐漸降低直至退行期。毛囊進入下一個循環(huán)后，堿性磷酸酶表達量也隨之發(fā)生升降變化[8]。由此可知，生長期與休止期毛囊數(shù)量的比值(A/T)可用于評價毛發(fā)的生長狀況。堿性磷酸酶在皮膚內表達量反應毛囊的生長階段。提高血管內皮生長因子和表皮生長因子的表達量，可延長毛囊的生長期，阻止毛發(fā)脫落。

蟲白蠟是半翅目Hemiptera蚧總科Coccoidea蟲白蠟蚧屬Ericerus的蟲白蠟蟲雄性幼蟲在寄主植物枝條上分泌的次生代謝物質，其主要成分為碳原子數(shù)在48～64范圍內蠟酯，含量為93%～95%[9]，是我國特有的一種昆蟲藥。早在《本草綱目》收錄的《集玄方》中記載“頭上禿瘡，蠟燭頻涂，勿令日曬，久則生發(fā)”，表明蟲白蠟對真菌感染引起的脫發(fā)具有一定的作用效果。筆者研究發(fā)現(xiàn)蟲白蠟能明顯促進脂溢性脫發(fā)模型小鼠毛發(fā)的生長，但對其治療脂溢性脫發(fā)的機理尚不清楚。本文以脂溢性脫發(fā)小鼠為模式動物，通過檢測蟲白蠟對毛發(fā)重量、不同時期毛囊數(shù)量、表皮生長因子、血管內皮生長因子和堿性磷酸酶的表達量，探究蟲白蠟對毛囊生長期的調節(jié)作用，為蟲白蠟產品的開發(fā)和應用奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗藥物 蟲白蠟：購自于四川峨眉蟲白蠟研究所；米諾地爾酊劑(曼迪)：購自浙江萬晟藥業(yè)有限公司，含量為5%，批號：160103。丙酸睪酮購自杭州動物藥品廠，生產批號：150813，丙酸睪酮溶解到滅菌大豆油中，配置成濃度為5 mg/mL的溶液；堿性磷酸酶試劑盒：南京建成生物工程研究所，批號：20160618；血管內皮生長因子試劑盒和表皮細胞生長因子試劑盒：上海依科賽生物制品有限公司，批號分別為21F120和21E254；一步法動物組織活性蛋白提取試劑盒：生工生物工程股份有限公司，批號：C325DA0008。

1.2 試驗動物 試驗動物：KM小鼠購自于北京華阜康生物科技股份有限公司，SPF級，5周齡雄鼠，批準文號：11401300042992，在室內適應性飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)溫度為室溫，光照L∶D=12 h∶12 h，飼喂人工飼料，食物和水不限量供應。

1.3 儀器 倒置顯微鏡：型號VHX-1000，基恩，日本，石蠟切片機：型號RM2126RT，上海徠卡儀器有限公司。多功能酶標儀：型號3001-1592，賽默飛世爾科技，氣相色譜：型號HP1890，惠普上海分析儀器有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 試驗動物分組與處理 將150只KM小鼠隨機分成6組，設CK組(不做任何處理)、模式組(皮下注射丙酸睪酮)、陽性對照組(皮下注射丙酸睪酮+局部涂抹2%非那雄胺)、實驗組(皮下注射丙酸睪酮的同時局部分別涂抹5%、10%和15%蟲白蠟)，每組25只試驗動物，動物模型的建立參照Renuka等[10]的報道，每天在小鼠背部皮下注射0.1 mL丙酸睪酮，連續(xù)注射60 d。皮下給藥的同時，除模式組外，其他組每天在小鼠背部局部涂抹0.5 mL相應的藥液。

1.4.2 毛囊生長期/休止期(A/T) 給藥第7(只稱取毛發(fā)重量)、14、21、28、45、60天每組隨機選取5只小鼠，用乙醚迷暈后脫頸處死，剪下小鼠背部面積為2 cm×3 cm的毛發(fā)及皮膚，剪下的毛發(fā)直接稱量其重量，皮膚在4%多聚甲醛中固定12 h，流水沖4 h，在不同濃度的乙醇中(30%、50%、70%、85%、90%、95%、無水乙醇、二甲苯)脫水、浸蠟、裝盒，橫切蠟塊，烤箱58～60 ℃過夜，H&E染色。記錄1 mm皮膚范圍內生長期(A)和休止期(T)毛囊的數(shù)量，計算生長期與休止期的比值(A/T)。生長期判斷標準為具有完整的毛囊結構，即具有內根鞘、外根鞘；休止期判斷標準為毛囊沒有內根鞘[6]。

1.4.3 堿性磷酸酶活性測定 取給藥第14、21、28、45、60天小鼠背部皮膚，剪碎，稱重，加入4倍量0.1M的磷酸緩沖鹽(pH值為7.4) ，在玻璃均漿器中勻漿，12000 rpm，4 ℃離心20 min，取上清液，分裝放在-70 ℃條件下保存。用堿性磷酸酶試劑盒測定皮膚內堿性磷酸酶(ALP)的含量，操作步驟按照試劑盒說明進行。在96孔板內添加適量的樣品和試劑，37 ℃孵育15 min，加入顯色劑，搖勻，用酶標儀在520 nm波長時測定每孔的吸光度值。采用考馬斯亮測定樣品中蛋白質的含量，每個樣品3次重復。按照下列公式計算樣品中ALP的活性：皮膚內ALP活性=(測定OD-空白OD值)/(標準OD值-空白OD值)×酚標準品濃度/待測樣本蛋白濃度。

1.4.4 生長因子測定 試驗第28天，每組隨機選取5只小鼠，取小鼠背部皮膚，剪碎，稱重，按一步法動物組織活性蛋白提取試劑盒操作說明進行。加入9倍量的組織提取液，在冰上孵育20 min，4 ℃離心，取上清液，采用試劑盒測定皮膚內血管內皮生長因子(VEGF)和表皮生長因子(EGF)，操作步驟按照試劑盒說明進行。用酶標儀在450 nm波長時測定樣品中血管內皮生長因子的吸光度值，在560 nm波長時測定樣品中表皮生長因子的吸光度值。采用考馬斯亮測定樣品中蛋白質的含量。每個樣品3次重復。根據(jù)標準曲線計算出每個樣品的濃度除于樣品蛋白質濃度。

2 試驗結果

2.1 毛發(fā)重量 給藥60 d，蟲白蠟和陽性對照組小鼠背毛生長情況明顯優(yōu)于模式組。蟲白蠟組背毛有光澤，毛發(fā)生長濃密，模式組小鼠背部脫毛明顯(如圖1)。蟲白蠟組單位面積內毛發(fā)的重量高于模式組。給藥21 d，各組小鼠被毛重量達到峰值，隨后毛發(fā)的重量降低，其中，CK組和10%蟲白蠟組毛發(fā)重量在給藥第28天時緩慢上升，15%蟲白蠟組和陽性對照組在給藥第45天時才開始上升。如圖2所示。

2.2 毛囊A/T比值 小鼠毛囊A/T比值隨著給藥時間發(fā)生變化，蟲白蠟組毛囊A/T變化趨勢與陽性對照組相似，呈“N”字形，在給藥第28天和45天，分別出現(xiàn)最高點和最低點，其值明顯高于模式組。給藥28 d時，10%蟲白蠟A/T比值明顯高于CK組、陽性對照和5%、10%蟲白蠟組。給藥60d時，除模式組外，各組A/T比值差異不顯著。如圖3所示。

2.3 堿性磷酸酶活性 皮下連續(xù)注射丙酸睪酮60 d，小鼠皮膚內ALP含量下降，其最高值出現(xiàn)的時間早于CK組，給予不同濃度的蟲白蠟和米諾地爾后，ALP含量明顯升高，且隨著給藥時間發(fā)生改變。其中，蟲白蠟組ALP變化趨勢與陽性對照組相似，即給藥14～28 d，ALP呈上升狀態(tài)，隨后降低，給藥45 d，ALP含量降到最低點后反彈；給藥45～60 d，10%蟲白蠟組ALP含量明顯高于5%、15%蟲白蠟和陽性對照組。如圖4所示。

2.4 生長因子 給藥第28天，蟲白蠟組和陽性對照組小鼠皮膚內血管內皮生長因子和表皮生長的表達量明顯高于模式組。隨著蟲白蠟濃度的增加，VEGF含量增加，蟲白蠟用量高于10%時，VEGF含量與陽性對照組和CK組差異不顯著。EGF的含量變化不隨蟲白蠟濃度的升高發(fā)生變化。10%蟲白蠟組EGF的含量明顯低于低于5%、15%蟲白蠟組，其值與CK組差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1不同處理小鼠皮膚內生長因子的表達量

處理血管內皮生長因子表皮生長因子CK42.51±5.151478.55±112.62?模式36.78±2.81 765.85±35.845%米諾地爾66.53±10.77△2418.56±132.95?5%蟲白蠟39.32±4.131966.01±127.47?10%蟲白蠟55.94±7.541488.44±125.78?15%蟲白蠟63.64±4.40△2550.06±130.20?

注：與模式組比較，*P<0.01，△P<0.05。

3 討論

給藥期間，蟲白蠟組小鼠皮膚內ALP表達量、A/T、毛發(fā)重量隨時間發(fā)生變化，出現(xiàn)峰值的時間早于CK組，而與陽性對照組相同，分別為28 d和45 d；給藥28 d時，測定小鼠皮膚內VEGF和EGF表達量，結果顯示，蟲白蠟濃度為10%時VEGF的表達量最低，其值明顯高于模式組，而與CK組差異不顯著。表明，皮下注射丙酸睪酮后縮短了毛囊的周期，給予蟲白蠟后能提高雄激素性脫發(fā)模型小鼠毛發(fā)營養(yǎng)的供應。

現(xiàn)代研究表明，延長毛囊的生長期，提高毛囊營養(yǎng)的供應可有效防治毛發(fā)的脫落[11]。ALP和A/T是評價毛囊處于生長期的關鍵性指標。VEGF和EGF是毛囊營養(yǎng)供應的關鍵指標[12-14]。毛囊具有循環(huán)再生的能力，其生長過程包括生長期、退行期和休止期。在生長期內毛囊細胞生長旺盛，毛囊柄伸入到真皮層，分泌較多的VEGF，為毛囊提供充足的營養(yǎng)，生成的毛干直徑較粗，毛發(fā)較長；在退行期毛囊細胞開始凋亡，VEGF分泌量減少，毛干開始萎縮，其長度隨著毛囊柄長度的縮短而減少，到休止期毛囊到達表皮層，細胞幾乎不分泌VEGF，毛囊營養(yǎng)供應不足，毛發(fā)開始脫落。正常情況下，毛囊的三個生長階段同時存在，共同維持新舊毛發(fā)的更替。當退行期和休止期毛囊數(shù)量增多時，會導致毛發(fā)的脫落。有效的促進VEGF的分泌，能延長毛囊的生長期，提高生長期毛囊的數(shù)量，阻止毛發(fā)的脫落，從而達到治療脫發(fā)的目的。EGF是毛囊生長期與退行期轉化的開關[5]。文獻報道，表皮生長因子促進毛發(fā)生長的作用與其劑量關系密切，其表達量只有在2×103～2×104pg/mL范圍內才能促進毛發(fā)的生長[5，15]。因此，控制EGF的表達量在適宜的范圍也可有效的阻止毛發(fā)的脫落，達到治療脫發(fā)的目的。

Lida[8]報道，ALP在毛囊生長期的初期表達量最高，隨后其含量降低，一直持續(xù)到休止期，堿性磷酸酶在休止期內的含量最低。由此可知，除了A/T比值外，ALP含量變化也能反映毛囊生長期的變化。經(jīng)過研究筆者發(fā)現(xiàn)，皮下注射丙酸睪酮后，小鼠皮膚內ALP的變化趨勢與A/T比值相同，即ALP的表達量和A/T比值在28 d和45 d時出現(xiàn)高峰和低谷。測試范圍內，CK組ALP和A/T比值一直處于平穩(wěn)的的上升階段。給予蟲白蠟后，小鼠皮膚內ALP值出現(xiàn)的時間與模式組相同，但其表達量明顯高于模式組。表明，皮下注射丙酸睪酮后，毛囊生長周期縮短，其生長初期和休止期分別始于給藥后的28d和45d，給與蟲白蠟后并不能改變毛囊的生長周期。

測定生長期表皮內小鼠的VEGF和EGF發(fā)現(xiàn)，10%蟲白蠟VEGF和EGF表達量與CK組差異不顯著，其值明顯高于模式組。表明，蟲白蠟通過提高毛囊內的血管內皮生長因子表達量，促進毛囊營養(yǎng)的供應，治療脂溢性脫發(fā)。但10%蟲白蠟組VEGF和EGF表達量與陽性對照組相比表現(xiàn)為不同的顯著性，10%蟲白蠟組VEGF表達量與陽性對照差異不顯著，而其EGF表達量明顯低于陽性對照組，這可能是導致蟲白蠟組促進毛發(fā)生長的效果優(yōu)于陽性對照組的原因。關于這一點還需進一步驗證。