劉 聰,董臘嬡,林建中,劉選明

(湖南大學(xué)生物學(xué)院植物功能基因組學(xué)與發(fā)育調(diào)控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國(guó)湖南長(zhǎng)沙410082)

植物不可避免地會(huì)遭受到各種不良環(huán)境脅迫,尤其是一些重要糧食和經(jīng)濟(jì)作物,每年都會(huì)因?yàn)楦鞣N不利環(huán)境因素造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。為了應(yīng)對(duì)多種不利環(huán)境因素(如高溫、低溫、干旱、高鹽和病蟲(chóng)害等),植物進(jìn)化出了一系列生理生化機(jī)制來(lái)響應(yīng)各種環(huán)境脅迫。植物體內(nèi)存在許多感受不同逆境信號(hào)的受體,參與各種逆境脅迫響應(yīng),并形成一個(gè)復(fù)雜的響應(yīng)和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以應(yīng)對(duì)逆境脅迫[2]。為了更好地理解植物的抗逆性機(jī)制和提高植物的適應(yīng)性,篩選和鑒定一個(gè)通用的受體或者信號(hào)分子至關(guān)重要[1]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),活性氧(reactive oxygen species,ROS)急劇增加是植物面臨各種逆境脅迫時(shí)的一個(gè)共同表現(xiàn),表明ROS在植物逆境響應(yīng)中起著十分重要的作用(圖1)[3～4]。

ROS主要包括超氧陰離子(O2·-)、過(guò)氧化氫(H2O2)、羥基自由基(·OH)和單線態(tài)氧(1O2)等,一直被認(rèn)為是有氧代謝帶來(lái)的有毒副產(chǎn)物[5]。光合作用和呼吸作用等有氧代謝不可避免地會(huì)在葉綠體、線粒體和過(guò)氧化物酶體中產(chǎn)生ROS,細(xì)胞質(zhì)膜和質(zhì)外體也是植物響應(yīng)各種脅迫信號(hào)后產(chǎn)生ROS的重要場(chǎng)所[6]。研究發(fā)現(xiàn),ROS在植物體內(nèi)具有雙重功能,其角色的轉(zhuǎn)變依賴(lài)于其在植物體內(nèi)的濃度。低濃度時(shí),ROS作為植物體內(nèi)一類(lèi)重要信號(hào)分子,參與調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng);當(dāng)濃度超過(guò)細(xì)胞所能承受的限度時(shí),ROS就變成了細(xì)胞殺手。在正常條件下,細(xì)胞內(nèi)ROS會(huì)處于較低水平。當(dāng)干旱、高溫等脅迫發(fā)生時(shí),植物因氣孔關(guān)閉而限制了二氧化碳的攝取,使得光呼吸過(guò)程中電子傳遞受阻,從而產(chǎn)生大量單線態(tài)氧和H2O2[3]。過(guò)量積累的ROS會(huì)影響蛋白質(zhì)、脂質(zhì)甚至核酸的功能,從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷乃至死亡[7]。

因此,植物體內(nèi)存在一系列調(diào)節(jié)機(jī)制,以維持ROS動(dòng)態(tài)平衡,既要維持適量的ROS調(diào)節(jié)正常的生長(zhǎng)發(fā)育,又不能任其積累而產(chǎn)生毒害,以至于殺死植物[8]。近年來(lái)在ROS代謝及其調(diào)節(jié)機(jī)制研究方面取得了很大的突破,但仍然存在許多生理及分子進(jìn)程需要進(jìn)一步探索。尤其是逆境下ROS動(dòng)態(tài)平衡調(diào)節(jié)與植物抗逆性之間的關(guān)聯(lián)性及其調(diào)節(jié)機(jī)制的解析,將有助于我們改良和培育作物新品種,維持作物的穩(wěn)產(chǎn)或高產(chǎn)。本文對(duì)近年來(lái)植物在逆境下ROS的代謝及調(diào)控機(jī)制研究進(jìn)行了綜述,并對(duì)相關(guān)研究提出了進(jìn)一步的展望。

1 逆境下ROS產(chǎn)生及其調(diào)節(jié)機(jī)制

通常ROS被認(rèn)為是有氧代謝的副產(chǎn)物,其產(chǎn)生的主要部位是線粒體和葉綠體中的電子傳遞鏈。當(dāng)電子傳遞到氧(O2)時(shí),就會(huì)產(chǎn)生ROS,而且逆境脅迫會(huì)加劇ROS積累[9]。Mittler等[2]總結(jié)了植物體內(nèi)ROS產(chǎn)生的10種方式,包括光合作用及呼吸作用電子傳遞鏈、NADPH(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)氧化酶、光呼吸作用、胺氧化和細(xì)胞壁損傷過(guò)氧化物酶等。其中錨定在細(xì)胞膜上的NADPH氧化酶,也被稱(chēng)作呼吸爆發(fā)氧化酶(respiratory burst oxidase homologues,RBOHs),在ROS產(chǎn)生中起著關(guān)鍵作用[10]。

研究表明,植物RBOHs的結(jié)構(gòu)與其ROS產(chǎn)生能力緊密相關(guān)[10～11]。其C端含有FAD(flavin adenine dinucleotide)和NADPH結(jié)合結(jié)構(gòu)域,以及與哺乳動(dòng)物NADPH相類(lèi)似的6次跨膜結(jié)構(gòu)域[12]。與哺乳動(dòng)物不同的是,植物中RBOHs的N端包含一個(gè)鈣離子(Ca2+)結(jié)合的EF-hand結(jié)構(gòu)域和一個(gè)可以磷酸化修飾的位點(diǎn),它們對(duì)RBOHs的ROS產(chǎn)生能力起著關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用[13]。當(dāng)RBOHs被激活以后,會(huì)產(chǎn)生大量的超氧陰離子(O2·-),隨后O2·-在超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)催化下形成H2O2。這類(lèi)由細(xì)胞膜產(chǎn)生的H2O2,可以作為重要的信號(hào)分子參與細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育和逆境響應(yīng)過(guò)程[14]。擬南芥RBOHs的ROS產(chǎn)生能力的調(diào)節(jié)機(jī)制主要為蛋白質(zhì)磷酸化修飾調(diào)節(jié)、Ca2+調(diào)節(jié)和Ca2+依賴(lài)的蛋白激酶調(diào)節(jié)[13～15]。植物受到外界刺激時(shí),細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度會(huì)因細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流而迅速升高,升高的Ca2+會(huì)和RBOHs的Ca2+結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合,從而激活其ROS產(chǎn)生活性[16]。在脫落酸(abscisic acid,ABA)依賴(lài)的氣孔關(guān)閉過(guò)程中,RBO-HF(respiratory burst oxidase homolog protein F)的13和174號(hào)位點(diǎn)的絲氨酸殘基被激酶OST1(open stomata 1)磷酸化,被磷酸化后的RBOHF產(chǎn)生ROS的能力提高,可改善擬南芥對(duì)干旱脅迫的耐受能力[17]。近期研究發(fā)現(xiàn),ROBHF產(chǎn)生ROS的活性還受到Ca2+依賴(lài)的CBL1/9-CIPK26(calcineurin B-like 1/9-CBL-interacting protein kinase 26)復(fù)合體的直接調(diào)節(jié)[13]。在水稻中,一個(gè)類(lèi)似于哺乳動(dòng)物Rac的蛋白質(zhì)OsRac1能夠和OsRBOHB(respiratory burst oxidase homolog protein B)的EF-hand結(jié)構(gòu)域結(jié)合,并可通過(guò)激活后者的ROS產(chǎn)生活性,調(diào)節(jié)水稻的防御反應(yīng)[18]。

圖1 植物中ROS與逆境之間的關(guān)系Fig.1 The relationship between ROS and stresses in plants

RBOHs并不是ROS的唯一來(lái)源,植物中還存在著其他ROS產(chǎn)生途徑,主要是一些響應(yīng)逆境脅迫的氧化酶。其中,草酸氧化酶(oxalate oxidase)參與植物根細(xì)胞對(duì)干旱脅迫響應(yīng)時(shí)的ROS產(chǎn)生過(guò)程[19];過(guò)氧化物酶(peroxidase,PRX)在植物響應(yīng)逆境脅迫后的ROS產(chǎn)生中扮演重要角色,如擬南芥PRX33和PRX34主要參與植物防御反應(yīng)中ROS的產(chǎn)生[20]。在擬南芥中,酪氨酸受體激酶EFR(EF-TU RECEPTOR)在感受到外界病蟲(chóng)害入侵時(shí),能通過(guò)磷酸化和去磷酸化調(diào)節(jié)體內(nèi)ROS產(chǎn)生相關(guān)酶類(lèi)的活性,促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)ROS積累,從而激活體內(nèi)的防御反應(yīng)[21]。這些酶的不同響應(yīng)方式,使得植物在不同脅迫下產(chǎn)生ROS的種類(lèi)也不盡相同,有助于植物分辨不同類(lèi)型的脅迫信號(hào),以作出相應(yīng)響應(yīng)。

2 逆境下ROS清除及其調(diào)節(jié)機(jī)制

ROS在植物生長(zhǎng)發(fā)育中扮演著十分重要的角色,正常條件下濃度較低,主要作為信號(hào)分子調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育;當(dāng)植物受到逆境脅迫時(shí),體內(nèi)ROS會(huì)急劇積累,而高濃度ROS會(huì)直接影響細(xì)胞的正常發(fā)育[9]。為了維持細(xì)胞內(nèi)ROS平衡,使之處于無(wú)害的濃度,植物進(jìn)化出了一系列酶促和非酶促的ROS清除機(jī)制。參與酶促ROS清除過(guò)程的酶有超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(catalase,CAT)、抗壞血酸過(guò)氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase,GST)、谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase,GR)和過(guò)氧化物酶(PRX)。參與非酶促ROS清除過(guò)程的主要是一些抗氧化物質(zhì),包括抗壞血酸(ascorbic acid,AsA)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)、維生素 E(α-tocopherol)和類(lèi)黃酮(flavonoid)等[22]。當(dāng)受到逆境脅迫時(shí),植物可以通過(guò)一系列生理生化機(jī)制調(diào)節(jié)這些酶類(lèi)的活性或者抗氧化類(lèi)物質(zhì)的量,從而清除植物體內(nèi)過(guò)量積累的ROS,提高植物抗逆性。

2.1 磷酸化修飾對(duì)逆境下ROS清除的調(diào)控

蛋白質(zhì)翻譯后水平修飾是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能和穩(wěn)定性的主要手段,在植物的逆境快速響應(yīng)中發(fā)揮重要功能。磷酸化修飾是蛋白質(zhì)修飾的主要方式,通過(guò)激酶(kinase)和磷酸酶(phosphotase)對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)的絲氨酸/蘇氨酸或酪氨酸殘基分別進(jìn)行磷酸化和去磷酸化,從而影響目標(biāo)蛋白質(zhì)的構(gòu)象和功能,在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著分子開(kāi)關(guān)作用。在擬南芥中,當(dāng)受到干旱脅迫時(shí),Ca2+依賴(lài)蛋白激酶CPK8(calcium-dependent protein kinase 8)能夠?qū)⑦^(guò)氧化氫酶CAT3的261號(hào)位點(diǎn)絲氨酸殘基(Ser261)磷酸化,激活CAT3的酶活性,從而將因干旱脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生的過(guò)量H2O2清除,提高擬南芥耐旱性[23]。有趣的是,在人體細(xì)胞內(nèi)也存在類(lèi)似機(jī)制,內(nèi)皮素-1(endothelin-1,ET-1)能夠促進(jìn)蛋白激酶 Cδ(protein kinase Cδ,PKCδ)磷酸化 CAT的167號(hào)位點(diǎn)絲氨酸殘基(Ser167),并激活CAT的酶活性,降低內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)積累的過(guò)量H2O2,從而提高肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的抗剪切力[24～25]。最近,我們?cè)谒局邪l(fā)現(xiàn)了一個(gè)正調(diào)控耐鹽性的類(lèi)受體胞質(zhì)激酶STRK1(salt tolerance receptor-like cytoplasmic kinase 1),其過(guò)表達(dá)水稻株系在苗期和生殖生長(zhǎng)期的耐鹽性顯著提高,而其RNA干擾(RNA interference,RNAi)株系則對(duì)鹽脅迫更加敏感。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),當(dāng)受到鹽脅迫時(shí),STRK1將過(guò)氧化氫酶C(CatC)的210號(hào)位點(diǎn)酪氨酸殘基(Tyr210)磷酸化,并激活CatC的酶活性,清除因鹽脅迫誘導(dǎo)積累的過(guò)量H2O2,以維持體內(nèi)ROS平衡,從而提高水稻耐鹽性[26]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),雖然蛋白質(zhì)的酪氨酸磷酸化修飾非常稀少,但是其在植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑[主要為油菜素內(nèi)脂(brassinosteroid,BR)]和免疫響應(yīng)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面起著非常重要的作用[27]。值得指出的是,STRK1是迄今植物中發(fā)現(xiàn)的唯一能將CAT的酪氨酸殘基磷酸化的酪氨酸激酶。因此,我們推測(cè)在植物中也存在一條類(lèi)似BR和免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的酪氨酸級(jí)聯(lián)磷酸化的鹽脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。Tsang等[28]發(fā)現(xiàn)超氧化物歧化酶1(SOD1)的活性也受到磷酸化修飾調(diào)節(jié),其39號(hào)位點(diǎn)絲氨酸殘基(Ser39)被mTORC1(mammalian target of rapamycin complex 1)復(fù)合體磷酸化,磷酸化的SOD1酶活性顯著提高,可以清除過(guò)量的ROS以維持體內(nèi)ROS平衡。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)在細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)中扮演著十分重要的角色,在ROS代謝中也發(fā)揮著重要作用。在擬南芥中,MPK3和MPK6能夠?qū)RF6(ethylene-responsive element binding factor 6)磷酸化,增加ERF6的穩(wěn)定性,而ERF6可進(jìn)一步促進(jìn)抗氧化相關(guān)基因的表達(dá),提高植物抵抗生物和非生物脅迫的能力[29～30]。此外,一些研究表明,植物體內(nèi)磷酸酶的表達(dá)水平和功能也會(huì)受到ROS調(diào)節(jié)[31],說(shuō)明磷酸酶也會(huì)參與到ROS清除代謝調(diào)節(jié)中去,但其具體調(diào)節(jié)機(jī)制有待進(jìn)一步研究,而且也是將來(lái)研究的一個(gè)重要方向。

2.2 其他翻譯后修飾參與ROS的清除調(diào)節(jié)

泛素化修飾是體內(nèi)蛋白質(zhì)翻譯后修飾的一種重要手段,它對(duì)蛋白質(zhì)的定位、調(diào)節(jié)和降解都起著重要作用[32]。Cao等[33]發(fā)現(xiàn)人的CAT可以被泛素化修飾,而且該過(guò)程還受磷酸化調(diào)節(jié)。當(dāng)CAT的231號(hào)和386號(hào)位點(diǎn)酪氨酸殘基被激酶復(fù)合體c-Abl/Arg磷酸化后,可以促進(jìn)CAT的泛素化途徑降解,導(dǎo)致胞內(nèi)H2O2含量升高,加速細(xì)胞凋亡。在非酶促ROS清除機(jī)制中,抗壞血酸作為一種重要的抗氧化物質(zhì),其合成關(guān)鍵酶鳥(niǎo)苷-甘露糖焦磷酸化酶(GDP-Man pyrophosphorylase 1,GMP1)的穩(wěn)定性也受到泛素化調(diào)節(jié)。Wang等[34]發(fā)現(xiàn)擬南芥的光形態(tài)建成因子CSN5B(COP9 signalosome subunit 5B)能夠和VTC1(vitamin C defective 1)互作,促進(jìn)VTC1的泛素化降解,減少抗壞血酸合成,使植株的ROS清除能力降低,表現(xiàn)出對(duì)鹽脅迫更為敏感。除此之外,其他蛋白質(zhì)修飾方式也參與了ROS的清除調(diào)節(jié),如SUMO化、氧化修飾、棕櫚?；纫材苡绊懴嚓P(guān)蛋白質(zhì)的酶活性或者定位,從而調(diào)節(jié)體內(nèi)ROS動(dòng)態(tài)平衡[35～36]。同樣,我們?cè)谘芯縎TRK1通過(guò)磷酸化CatC而參與H2O2動(dòng)態(tài)平衡及耐鹽脅迫調(diào)控的分子機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn),STRK1通過(guò)N端5、10和14號(hào)位點(diǎn)的半胱氨酸殘基棕櫚酰化修飾而定位于細(xì)胞質(zhì)膜,其過(guò)表達(dá)株系表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐鹽性;當(dāng)把N端5、10和14號(hào)位點(diǎn)的半胱氨酸突變?yōu)楸彼釙r(shí),突變的STRK1無(wú)法被棕櫚酰化而定位于細(xì)胞質(zhì)中,其過(guò)表達(dá)株系的強(qiáng)耐鹽性消失[26]。該結(jié)果表明,STRK1通過(guò)磷酸化CatC參與H2O2動(dòng)態(tài)平衡的調(diào)控過(guò)程也受到棕櫚?；揎椀恼{(diào)控。有意思的是,除了磷酸化、泛素化和棕櫚?；鹊鞍踪|(zhì)水平的修飾外,Li等[37]發(fā)現(xiàn)在擬南芥中還存在著一種含環(huán)指結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)NCA1(no catalase activity 1),其可類(lèi)似分子伴侶蛋白一樣與CAT2結(jié)合,并通過(guò)構(gòu)象改變?cè)黾覥AT2的穩(wěn)定性和酶活性,從而提高植株的逆境脅迫耐受能力。在水稻中,人們也發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似的調(diào)控方式,在逆境脅迫下,乙醇酸氧化酶(glycolate oxidase,GOX)會(huì)與CAT分離,降低CAT的活性,促進(jìn)體內(nèi)H2O2的積累,從而激活體內(nèi)的防御反應(yīng)[38]。這種類(lèi)似于分子伴侶的蛋白質(zhì)通過(guò)改變目標(biāo)蛋白構(gòu)象來(lái)參與脅迫響應(yīng)的方式,為植物耐逆性分子機(jī)制研究提供了一種新思路。

2.3 轉(zhuǎn)錄因子影響ROS清除基因的表達(dá)

轉(zhuǎn)錄因子在植物逆境響應(yīng)中扮演著十分重要的角色,通過(guò)對(duì)ROS相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),擬南芥中有1 500多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子對(duì)單線態(tài)氧、H2O2、羥基自由基等ROS有響應(yīng)[39]。ROS主要通過(guò)提高轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量、增加轉(zhuǎn)錄因子穩(wěn)定性、增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合DNA能力等方面調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的功能,進(jìn)一步調(diào)節(jié)逆境響應(yīng)相關(guān)基因表達(dá),改善植物抗逆性[40]。例如:水稻中轉(zhuǎn)錄因子OsNAC2(NAC domain containing protein 2)能夠結(jié)合到ROS清除基因OsCOX11(cytochrome c oxidase 11)的啟動(dòng)子上并促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄,大量表達(dá)的OsCOX11能夠清除逆境下積累的ROS,提高水稻的鹽脅迫耐受能力[41]。Zhao等[42]發(fā)現(xiàn)高溫能夠誘導(dǎo)過(guò)氧化氫酶基因表達(dá),清除高溫下過(guò)量積累的ROS,提高水稻對(duì)高溫脅迫的耐受能力。此外,近期研究發(fā)現(xiàn),Osa-miR398b能夠直接調(diào)節(jié)SOD基因的轉(zhuǎn)錄水平以調(diào)節(jié)水稻體內(nèi)ROS動(dòng)態(tài)平衡,改善水稻對(duì)病蟲(chóng)害的抗性[43]。擬南芥ARR2(response regulator 2)在受到脅迫時(shí),可以直接調(diào)節(jié)PRX33和PRX34表達(dá)水平,以提高植物抵抗病原菌入侵的能力[44]。在逆境脅迫下,植物會(huì)通過(guò)調(diào)節(jié)體內(nèi)甲基轉(zhuǎn)移酶的活性來(lái)改變植物基因組DNA甲基化程度,而DNA甲基化程度又能夠影響相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá),最終影響植物的抗逆性[45]。

綜上所述,植物在受到逆境脅迫時(shí),可以通過(guò)調(diào)節(jié)體內(nèi)一系列抗氧化蛋白質(zhì)的活性和表達(dá)水平,來(lái)清除逆境脅迫下產(chǎn)生的大量ROS,保護(hù)植物免受氧化傷害,從而提高植物抗逆性(圖2)。近年來(lái),盡管逆境下ROS的產(chǎn)生、清除及其相關(guān)調(diào)節(jié)機(jī)制得到一定程度的了解,但是其更為精細(xì)的調(diào)節(jié)機(jī)制和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)還有待進(jìn)一步解析。

圖2 植物逆境脅迫中ROS動(dòng)態(tài)平衡的調(diào)節(jié)Fig.2 Regulation of ROS homeostasis in plants under stresses

3 結(jié)語(yǔ)與展望

ROS既是有氧代謝的有毒副產(chǎn)物,又是細(xì)胞內(nèi)十分重要的信號(hào)分子,適當(dāng)濃度的ROS是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的;但是,在逆境脅迫下,植物體內(nèi)的ROS會(huì)大量積累,影響細(xì)胞內(nèi)正常的生理生化進(jìn)程,甚至殺死細(xì)胞。同時(shí),ROS也作為一個(gè)脅迫信號(hào)激活體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng),調(diào)節(jié)抗氧化酶類(lèi)的表達(dá)水平和酶活性,或者改變抗氧化物質(zhì)的量,從而消除過(guò)量積累ROS的不利影響,保護(hù)植物并提高植物的抗逆性。對(duì)逆境脅迫下ROS調(diào)節(jié)機(jī)制的解析,可以有助于我們理解植物抵抗逆境脅迫的分子機(jī)制,從而用以改善甚至改良植物尤其是作物的抗逆性,同時(shí)為分子育種提供新的耐逆性分子標(biāo)記,為作物新品種培育提供理論依據(jù)。