李香妹,楊筱慧

(湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,中國(guó)湖南長(zhǎng)沙410081)

蟲(chóng)癭是致癭昆蟲(chóng)通過(guò)產(chǎn)卵和取食行為等持續(xù)刺激寄主植物并導(dǎo)致植物組織異常生長(zhǎng)而形成的非正常組織,是致癭昆蟲(chóng)和寄主植物相互作用的產(chǎn)物[1]。蟲(chóng)癭對(duì)致癭昆蟲(chóng)具有重要意義,包括以特化的蟲(chóng)癭組織為致癭昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)提供糖類、脂類和蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì);提供有利于抵御低溫和過(guò)度干燥等不利環(huán)境脅迫的小環(huán)境;提供有利于防御捕食者和寄生者侵害的避難所[2]。

就蟲(chóng)癭形成的適應(yīng)性機(jī)制,目前有多種不同觀點(diǎn)。Price等[3]提出6種假說(shuō),分別是營(yíng)養(yǎng)、微環(huán)境、天敵、互利、防御和非適應(yīng)假說(shuō)。其中,營(yíng)養(yǎng)假說(shuō)認(rèn)為蟲(chóng)癭為致癭昆蟲(chóng)提供豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量應(yīng)高于植物未成癭部位的相應(yīng)組織,而次生代謝產(chǎn)物的含量則相反,以此滿足致癭昆蟲(chóng)的營(yíng)養(yǎng)需求[2]。

致癭昆蟲(chóng)的主要類群包括6目20科。其中,雙翅目(Diptera)的癭蚊科(Cecidomyiidae)和膜翅目(Hymenoptera)的癭蜂科(Cynipidae)是兩個(gè)最大的造癭類群[4]。近年來(lái),研究證實(shí)部分癭蚜[5]、癭蚊[6]和癭蜂[7]等蟲(chóng)癭支持營(yíng)養(yǎng)假說(shuō)。其中,癭蜂蟲(chóng)癭的主要營(yíng)養(yǎng)成分有淀粉[8～9]、三酰甘油[10]和磷脂[11]。

栗癭蜂(Dryocosmus kuriphilus)屬于膜翅目癭蜂科,營(yíng)孤雌生殖,廣泛分布于中國(guó)、日本、韓國(guó)、美國(guó)和歐洲部分國(guó)家,為世界性的檢疫性害蟲(chóng)[12]。栗癭蜂于栗芽或葉上形成蟲(chóng)癭,其中,被害枝直接膨大形成的蟲(chóng)癭稱為枝癭,葉片上形成的蟲(chóng)癭稱為葉癭[13]。癭蜂幼蟲(chóng)生活于蟲(chóng)癭的蟲(chóng)室內(nèi),以蟲(chóng)癭為食。成蟲(chóng)不取食蟲(chóng)癭,在合適時(shí)機(jī)通過(guò)蟲(chóng)癭羽化口逃離蟲(chóng)癭[14]。目前,已有研究發(fā)現(xiàn)栗癭蜂致癭影響相鄰葉片中單寧、類黃酮的含量和苯丙氨酸解氨酶的活性[15～17]。而且,相關(guān)研究探討了栗樹(shù)枝條和芽中的酚類化合物含量與抗栗癭蜂性狀的關(guān)系,結(jié)果顯示栗樹(shù)枝條和栗芽?jī)?nèi)酚類化合物含量與栗癭蜂蟲(chóng)癭百分率呈負(fù)相關(guān)[18～19]。此外,丁玉洲等[20]發(fā)現(xiàn)栗癭蜂蟲(chóng)癭的體積和質(zhì)量與蟲(chóng)室數(shù)和蟲(chóng)數(shù)呈正相關(guān)。盡管已有上述報(bào)道,但是目前尚不清楚栗癭蜂蟲(chóng)癭是否支持營(yíng)養(yǎng)假說(shuō)。

本研究以栗癭蜂幼蟲(chóng)期的蟲(chóng)癭以及蟲(chóng)癭著生的枝條為材料,測(cè)定其總蛋白質(zhì)、淀粉和還原糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及單寧、類黃酮、多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶等防御物質(zhì)的含量或活性,以驗(yàn)證營(yíng)養(yǎng)假說(shuō)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本的采集和解剖

栗癭蜂蟲(chóng)癭和板栗枝條于2018年4月采集自湖南省邵陽(yáng)市洞口縣黃橋鎮(zhèn),以干冰保存,帶回實(shí)驗(yàn)室。解剖蟲(chóng)癭,取出幼蟲(chóng)后,將解剖的蟲(chóng)癭用于后續(xù)檢測(cè)。

1.2 試劑

總蛋白質(zhì)、淀粉、還原糖、單寧、類黃酮、多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶等物質(zhì)的檢測(cè)試劑盒購(gòu)于蘇州科銘生物技術(shù)有限公司。單寧含量檢測(cè)試劑盒中的試劑有鎢酸鈉、磷鉬酸、磷酸的混合溶液和Na2CO3溶液;類黃酮含量檢測(cè)試劑盒中的試劑有亞硝酸鈉、硝酸鋁和NaOH;多酚氧化酶活性檢測(cè)試劑盒中的試劑有 KH2PO4、K2HPO4·3H2O(含PVP)和鄰苯二酚溶液;苯丙氨酸解胺酶活性檢測(cè)試劑盒中的試劑有十水硼砂鈉、硼酸(含EDTA和巰基乙醇)、苯丙氨酸和HCl溶液;還原糖含量檢測(cè)試劑盒中的試劑有60%乙醇和3,5-二硝基水楊酸溶液;淀粉含量檢測(cè)試劑盒中的試劑有60%乙醇和高氯酸溶液;總蛋白質(zhì)含量檢測(cè)試劑盒中的試劑有標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液、BCA試劑。85%濃硫酸等其他試劑均購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 待測(cè)物的提取

1.3.1 單寧和類黃酮的提取

將樣本烘干至恒重,分別取0.01 g已解剖的蟲(chóng)癭和枝條,加入100 μL蒸餾水,充分搗勻后,80℃水浴30 min,8 000 g、25℃離心10 min,取上清液待用。

1.3.2 粗酶的提取

分別取0.01 g栗癭蜂蟲(chóng)癭和枝條至EP管中,加入100 μL的十水硼砂鈉、硼酸溶液和巰基乙醇的混合液,冰浴勻漿,10 000 g、4℃離心10 min,取上清液至冰上待測(cè)。

1.3.3 還原糖的提取

取0.01 g栗癭蜂蟲(chóng)癭和枝條至EP管中,加入100 μL的60%乙醇溶液,冰浴勻漿,80℃水浴40 min并震蕩 8～10次,隨后 8 000 g、25℃離心10 min,取上清液待用。

1.3.4 淀粉的提取

取0.01 g栗癭蜂蟲(chóng)癭和枝條至EP管中,加入100 μL的60%乙醇溶液,充分搗勻后,80℃水浴30 min,隨后3 000 g、25℃離心5 min,棄上清。在沉淀中加500 μL蒸餾水,95℃糊化15 min,然后加350 μL高氯酸溶液,25℃提取15 min,震蕩3～5 次,再加 850 μL 蒸餾水混勻,隨后 3 000 g、25℃離心10 min,取上清液待用。

1.3.5 總蛋白質(zhì)的提取

取0.01 g栗癭蜂蟲(chóng)癭和枝條至EP管中,加入100 μL的蒸餾水,冰浴勻漿,隨后8 000 g、4℃離心10 min,取上清液至冰上待測(cè)。

1.4 待測(cè)物的測(cè)定

1.4.1 單寧含量的測(cè)定

單寧在堿性環(huán)境下與磷鉬酸反應(yīng),生成藍(lán)色化合物,在760 nm處有最大吸收峰。依據(jù)該實(shí)驗(yàn)原理,文中采用鎢酸鈉-磷鉬酸法測(cè)定單寧的含量,具體操作步驟參考單寧含量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書。

1.4.2 類黃酮含量的測(cè)定

類黃酮的測(cè)定采用堿性亞硝酸鹽法。在堿性亞硝酸鹽溶液中,類黃酮與鋁離子形成在502 nm處有特征吸收峰的紅色絡(luò)合物,測(cè)定樣品提取液在502 nm處的吸光值,即可計(jì)算樣品中類黃酮的含量。具體操作步驟參考類黃酮含量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書。

1.4.3 苯丙氨酸解胺酶活性的測(cè)定

苯丙氨酸解胺酶催化L-苯丙氨酸裂解為反式肉桂酸和氨,反式肉桂酸在290 nm處有最大吸收值,通過(guò)測(cè)定吸光值的升高速率可計(jì)算苯丙氨酸解胺酶的活性。具體操作步驟參考苯丙氨酸解胺酶檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書。

1.4.4 多酚氧化酶活性的測(cè)定

多酚氧化酶能夠催化鄰苯二酚產(chǎn)生醌,后者在525 nm處有最大吸收值,通過(guò)測(cè)定吸光值的升高速率可計(jì)算多酚氧化酶的活性。具體操作步驟參考多酚氧化酶檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書。

1.4.5 還原糖含量的測(cè)定

還原糖含量的測(cè)定采用3,5-二硝基水楊酸法,通過(guò)加熱促進(jìn)堿性溶液中3,5-二硝基水楊酸溶液與還原糖生成棕紅色氨基化合物,反應(yīng)產(chǎn)物在540 nm有特征吸收峰。在一定的濃度范圍內(nèi),還原糖含量與OD540nm呈線性關(guān)系,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,即可求出樣品中還原糖的量。具體操作步驟參考還原糖含量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書。

1.4.6 淀粉含量的測(cè)定

首先利用80%乙醇把樣品中的可溶性糖與淀粉分開(kāi),隨后采用酸水解法分解淀粉為葡萄糖。采用蒽酮比色法測(cè)定葡萄糖含量,即可計(jì)算淀粉含量。具體操作步驟參考淀粉含量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書。

1.4.7 總蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用BAC法。堿性條件下,蛋白質(zhì)中的半胱氨酸、胱氨酸、色氨酸、酪氨酸以及肽鍵能將Cu2+還原成Cu+;2分子的BCA與Cu+結(jié)合,生成紫色絡(luò)合物,在540～595 nm有吸收峰,在562 nm處有最強(qiáng)的光吸收值,并與蛋白質(zhì)濃度呈正比,據(jù)此可測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。具體操作步驟參考蛋白質(zhì)含量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書。

1.5 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

栗癭蜂幼蟲(chóng)期蟲(chóng)癭的單寧含量為1.085±0.076 mg/g,極顯著低于枝條的單寧含量1.821±0.032 mg/g(F1,38=79.424,P＜0.01;圖 1)。栗癭蜂蟲(chóng)癭的類黃酮含量為16.457±1.216 mg/g,極顯著低于枝條的類黃酮含量43.126±2.357 mg/g(F1,38=101.161,P＜0.01;圖1)。此外,栗癭蜂蟲(chóng)癭的多酚氧化酶活性為55.902±2.243 U/g,顯著低于枝條的多酚氧化酶活性 60.961±1.081 U/g(F1,38=4.126,P＜0.05;圖 2)。栗癭蜂蟲(chóng)癭的苯丙氨酸解氨酶活性為7.763±0.509 U/g,極顯著低于枝條的苯丙氨酸解氨酶活性 22.752±1.350 U/g(F1,38=107.852,P＜0.01;圖 2)。上述結(jié)果表明,栗癭蜂蟲(chóng)癭中與防御相關(guān)的部分次生代謝產(chǎn)物的含量和酶的活性顯著低于枝條,均支持營(yíng)養(yǎng)假說(shuō)。

圖1 栗癭蜂幼蟲(chóng)期蟲(chóng)癭和枝條中單寧與類黃酮的含量比較Fig.1 Comparison of tannin and flavonoid contents in the galls and branches during the larvae stage of D.kuriphilus

圖2 栗癭蜂幼蟲(chóng)期蟲(chóng)癭和枝條中苯丙氨酸解氨酶與多酚氧化酶的活性比較Fig.2 Comparison of phenylalanine ammonia-lyase and polyphenol oxidase activities in the galls and branches during the larvae stage of D.kuriphilus

栗癭蜂幼蟲(chóng)期蟲(chóng)癭中還原糖的含量為5.614±0.479 mg/g,極顯著低于枝條中還原糖的含量 6.111±0.110 mg/g(F1,38=10.466,P＜0.01;圖3)。蟲(chóng)癭和枝條中淀粉的含量分別為16.859±0.346 mg/g和16.750±0.295 mg/g,二者無(wú)顯著差異(F1,38=0.058,P＞0.05;圖3)。蟲(chóng)癭中總蛋白質(zhì)的含量為1.865±0.161 mg/g,極顯著低于枝條中總蛋白質(zhì)的含量9.420±0.253 mg/g(F1,38=635.196,P＜0.01;圖 3)。上述結(jié)果表明,栗癭蜂蟲(chóng)癭中淀粉的含量與枝條中淀粉的含量無(wú)顯著差異,但蟲(chóng)癭中的還原糖和總蛋白質(zhì)含量均顯著低于枝條中對(duì)應(yīng)物質(zhì)的含量,不支持營(yíng)養(yǎng)假說(shuō)。

圖3 栗癭蜂幼蟲(chóng)期蟲(chóng)癭和枝條中還原糖、淀粉與總蛋白質(zhì)含量的比較Fig.3 Comparison of reducing sugar,starch and protein contents in the galls and branches during the larvae stage of D.kuriphilus

3 討論

營(yíng)養(yǎng)假說(shuō)認(rèn)為,蟲(chóng)癭營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量應(yīng)高于植物正常組織,而防御物質(zhì)應(yīng)低于植物的相應(yīng)組織,以滿足致癭昆蟲(chóng)的營(yíng)養(yǎng)需求[3]。本文就栗癭蜂蟲(chóng)癭的部分營(yíng)養(yǎng)和防御物質(zhì)是否支持營(yíng)養(yǎng)假說(shuō)進(jìn)行研究。

研究結(jié)果表明栗癭蜂蟲(chóng)癭的防御物質(zhì)單寧和類黃酮的含量及多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶的活性均顯著低于寄主植物枝條中相應(yīng)物質(zhì)的含量或活性。單寧是一種酚類物質(zhì),能與昆蟲(chóng)消化酶結(jié)合抑制酶的活性,從而降低昆蟲(chóng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化利用以抑制昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育[21]。我們的研究與其他癭蜂Andricus petiolicolus和Trigonaspis sp.蟲(chóng)癭單寧含量的研究[22～23]一致。類黃酮影響昆蟲(chóng)生長(zhǎng)和發(fā)育,呂文玲[24]的研究表明鴨腳木星室木虱(Pseudophacopteron alstonium)為害初期,蟲(chóng)癭組織黃酮含量顯著降低。栗癭蜂蟲(chóng)癭內(nèi)較低含量的單寧和類黃酮有利于癭蜂幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)和發(fā)育。

多酚氧化酶廣泛分布于植物和昆蟲(chóng)體內(nèi)。植物中,多酚氧化酶可引起組織的褐變,而昆蟲(chóng)中的多酚氧化酶主要與表皮的硬化和褐化有關(guān)[25]。蟲(chóng)癭被癭蜂幼蟲(chóng)取食后,其多酚氧化酶一方面能共價(jià)修飾昆蟲(chóng)的消化蛋白并與之交聯(lián),降低昆蟲(chóng)中腸蛋白酶的水解能力;另一方面,多酚氧化酶能作用于多酚形成醌,而醌對(duì)昆蟲(chóng)具有毒性。我們的研究表明栗癭蜂蟲(chóng)癭的多酚氧化酶活性顯著低于枝條,這支持營(yíng)養(yǎng)假說(shuō)。但是,汪少妃等[26]證實(shí)刺桐姬小蜂(Quadrastichus erythrinae)蟲(chóng)癭的多酚氧化酶活性顯著高于寄主植物。我們的結(jié)果與其并不一致,這可能與致癭昆蟲(chóng)和寄主植物的種類相關(guān)。

苯丙氨酸解氨酶存在于綠色植物中,是催化苯丙烷類代謝第一步反應(yīng)的關(guān)鍵酶,也是限速酶,目前尚無(wú)研究表明昆蟲(chóng)體內(nèi)存在苯丙氨酸解氨酶[27]。L-苯丙氨酸經(jīng)苯丙氨酸解氨酶作用生成反式肉桂酸,進(jìn)入苯丙烷代謝途徑并經(jīng)中間產(chǎn)物可轉(zhuǎn)化為類黃酮和單寧。我們的研究表明,蟲(chóng)癭中單寧和類黃酮的含量顯著低于枝條,而苯丙氨酸解氨酶的活性亦如此。我們推測(cè),蟲(chóng)癭中單寧和類黃酮的含量較低,這可能與苯丙氨酸解氨酶活性較低有關(guān)。

糖和蛋白質(zhì)是昆蟲(chóng)所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。黃金水等[28]的研究表明木麻黃木質(zhì)部中葡萄糖含量的增加,為星天牛(Anoplophora chinensis)提供豐富的能量,提高星天牛的存活率。我們的研究結(jié)果表明,栗癭蜂蟲(chóng)癭的還原糖含量低于枝條,淀粉的含量與枝條相比無(wú)顯著性差異,這與營(yíng)養(yǎng)假說(shuō)不符。就蛋白質(zhì)含量而言,研究已證實(shí)蚜蟲(chóng)、癭蚊和癭蜂蟲(chóng)癭的總氮含量低于未成癭組織[7,29～30];癭蚊 Bruggmanniella sp.及癭蜂 Andricus kollari、Diplolepis rosae、Dryocosmus spinosa 和 A.petiolicolus蟲(chóng)癭的可溶性蛋白質(zhì)含量低于未成癭組織[22,31]。本文的研究結(jié)果也顯示,栗癭蜂蟲(chóng)癭的蛋白質(zhì)含量極顯著低于枝條的含量,不支持營(yíng)養(yǎng)假說(shuō)。

綜上所述可知,就栗癭蜂幼蟲(chóng)期的蟲(chóng)癭而言,并非所有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量均支持營(yíng)養(yǎng)假說(shuō)。我們推測(cè),這可能與癭蜂蟲(chóng)癭的復(fù)雜結(jié)構(gòu)有關(guān)。癭蜂蟲(chóng)癭包括表皮層、保護(hù)層和營(yíng)養(yǎng)層[32],癭蜂幼蟲(chóng)以鄰近幼蟲(chóng)的營(yíng)養(yǎng)層細(xì)胞為食。我們的結(jié)果表明,營(yíng)養(yǎng)層組織的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可能含量較低,而防御物質(zhì)的含量較高,而我們以整個(gè)蟲(chóng)癭為研究對(duì)象,因此部分檢測(cè)結(jié)果不符合營(yíng)養(yǎng)假說(shuō)?？紤]到栗癭蜂營(yíng)養(yǎng)層與保護(hù)層是連續(xù)且不規(guī)則的,因此需尋找合適的方法將營(yíng)養(yǎng)層和保護(hù)層分離后開(kāi)展進(jìn)一步研究。

此外,栗癭蜂幼蟲(chóng)期蟲(chóng)癭的部分防御物質(zhì)的含量或活性低于枝條,而部分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(如還原糖和總蛋白質(zhì))的含量亦低于枝條。我們推測(cè),這可能與栗癭蜂幼蟲(chóng)和寄主植物的適應(yīng)性策略相關(guān)。一方面,癭蜂幼蟲(chóng)可能使蟲(chóng)癭中部分防御物質(zhì)的含量或活性低于枝條,從而有利于自身的生長(zhǎng)和發(fā)育;另一方面,寄主植物可能通過(guò)改變蟲(chóng)癭還原糖和總蛋白質(zhì)的含量以降低食物的質(zhì)量,從而影響癭蜂幼蟲(chóng)的發(fā)育,這兩方面在一定程度上取得平衡。