楊文博,李芊芊,王 鍵,曲鑫建

(大連理工大學(xué)盤(pán)錦校區(qū)生命與醫(yī)藥學(xué)院,中國(guó)遼寧盤(pán)錦124221)

宮頸癌是最常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤之一,統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升的趨勢(shì)[1]。近年來(lái),診斷和篩查技術(shù)有了很大的進(jìn)步,但宮頸癌仍然是威脅女性生命健康的第二大原因[2]。腫瘤間質(zhì)浸潤(rùn)、淋巴轉(zhuǎn)移等是宮頸癌預(yù)后不良的重要因素[3]。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)與惡性腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。EMT是指上皮細(xì)胞通過(guò)特定程序轉(zhuǎn)化為間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過(guò)程,其主要表現(xiàn)為上皮標(biāo)記E-cadherin、角蛋白等表達(dá)降低,間質(zhì)標(biāo)記物如波形蛋白、N-cadherin和基質(zhì)金屬蛋白酶等表達(dá)增加,細(xì)胞的遷移能力增強(qiáng)[4]。EMT可以促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的浸潤(rùn)、侵襲和轉(zhuǎn)移,影響患者的預(yù)后[5]。

Krüppel樣因子 5(Krüppel-like factor 5,KLF5)又稱(chēng)為BTEB2(basic transcription element-binding protein 2)或 IKLF(intestinal-enriched Krüppel-like factor)。作為一種重要的轉(zhuǎn)錄因子,KLF5可調(diào)控眾多下游靶基因的表達(dá),包括細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)、細(xì)胞周期蛋白 B1(cyclin B1)、纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白(fibroblast growth factor-binding protein,FGF-BP)等的編碼基因[6～9],進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲等生物學(xué)過(guò)程。目前,已有報(bào)道顯示KLF5在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。Marrero-Rodríguez等[10]發(fā)現(xiàn) KLF5 在宮頸癌中表達(dá)上調(diào),可能在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中起著作用。Ma等[11]發(fā)現(xiàn)KLF5可以通過(guò)上調(diào)TNFRSF11a的表達(dá)促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。盡管如此,KLF5在宮頸癌中發(fā)揮作用的機(jī)制尚未闡明,仍需進(jìn)一步研究。本文以宮頸癌細(xì)胞為研究對(duì)象,探索KLF5在宮頸癌細(xì)胞EMT過(guò)程中的分子調(diào)控機(jī)制,為宮頸癌的診斷與治療提供一定的依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞

人宮頸癌HeLa細(xì)胞、人子宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞、C33A細(xì)胞和Cos7細(xì)胞源自美國(guó)ATCC(American Type Culture Collection)細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2 質(zhì)粒

pcDNA3.1質(zhì)粒、Flag-KLF5質(zhì)粒、GFP-SNAI1質(zhì)粒、SNAI1-Luc截短體質(zhì)粒等均來(lái)自實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。KLF5干擾質(zhì)粒由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,其序列見(jiàn)表1。

1.1.3 主要試劑

胰酶、青/鏈霉素、細(xì)胞裂解液、1×磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)、噻唑藍(lán)(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)和脂質(zhì)體Lipo2000等購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;胎牛血清(NQBB,澳大利亞)、DMEM 培養(yǎng)基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium,Gibco,USA)、EMEM 培養(yǎng)基(Eagle’s minimum essential medium,Hyclone,USA)購(gòu)自大連賽拓生物科技有限公司;BCA(bicinchoninic acid)試劑盒和Trizol試劑購(gòu)自碧云天生物科技有限公司;兔抗KLF5抗體、兔抗SNAI1抗體購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司;兔抗E-cadherin抗體、兔抗N-cadherin抗體購(gòu)自沈陽(yáng)萬(wàn)類(lèi)生物科技有限公司;鼠抗GAPDH抗體、鼠抗Flag標(biāo)簽抗體、兔抗GFP標(biāo)簽抗體購(gòu)自義翹神州(北京)科技有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRTMaster Mix(Perfect Real Time)、SYBR GREEN Mixture試劑盒、TaKaRa Ex Taq?Hot Start Version試劑購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;β半乳糖苷酶(β-galactosidase,β-gal)表達(dá)質(zhì)粒、熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司。

表1 KLF5干擾RNA序列Table 1 KLF5 interfering RNA sequences

1.1.4 主要儀器

Synergy H1酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)BioTek公司;TaKaRa TP600 PCR儀購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;EPS 600電泳儀購(gòu)自上海天能科技有限公司;AlphaImager HP凝膠成像儀購(gòu)自美國(guó)Alpha公司;LightCycler@96熒光定量PCR儀購(gòu)自瑞士Roche公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的培養(yǎng)基(HeLa、Cos7細(xì)胞使用DMEM培養(yǎng)基,SiHa、C33A細(xì)胞使用EMEM培養(yǎng)基),于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞長(zhǎng)至90%時(shí)進(jìn)行傳代。

HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染:傳代HeLa細(xì)胞至兩組6 cm培養(yǎng)板,待細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%時(shí),使用Lipo2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作,一組轉(zhuǎn)染6 μg pcDNA3.1空載質(zhì)粒,另一組轉(zhuǎn)染6 μg Flag-KLF5質(zhì)粒 (或者6 μg GFP-SNAI1 質(zhì)粒)。

SiHa細(xì)胞轉(zhuǎn)染:傳代SiHa細(xì)胞至兩組6 cm培養(yǎng)板,待細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%時(shí),使用Lipo2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作,一組轉(zhuǎn)染6 μg siControl序列,另一組轉(zhuǎn)染 6 μg siKLF5 序列(6 μg siKLF5#1、6 μg siKLF5#2、6 μg siKLF5#3、6 μg siKLF5#Mix=2 μg siKLF5#1+2 μg siKLF5#2+2 μg siKLF5#3)。

Cos7細(xì)胞轉(zhuǎn)染:傳代Cos7細(xì)胞至24孔培養(yǎng)板,待細(xì)胞長(zhǎng)到70%～80%時(shí),6個(gè)孔為一組,每組轉(zhuǎn)染 300 ng的 β-gal表達(dá)質(zhì)粒和 300 ng的SNAI1-Luc質(zhì)粒,然后其中3個(gè)孔轉(zhuǎn)染400 ng的pcDNA3.1空載質(zhì)粒,另外3個(gè)孔轉(zhuǎn)染400 ng的Flag-KLF5質(zhì)粒 (或者梯度轉(zhuǎn)染150 ng、300 ng、600 ng Flag-KLF5 質(zhì)粒)。

1.2.2 MTT比色法

HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后,胰酶消化收集細(xì)胞,按照每孔 1×103～2×103個(gè)細(xì)胞接種 96孔板。將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～6 d,每天固定一個(gè)時(shí)間點(diǎn)每孔加入10 μL的MTT,避光孵育4 h,吸除上清液。吸除最后一天的樣品上清液后,每孔加入100 μL 的二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)。將錫箔紙包裹的96孔板置于水平搖床上,室溫避光溶解15～30 min,直至沒(méi)有雜質(zhì),隨后用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD490處的吸光值,用GraphPad Prism 5.0處理數(shù)據(jù)。

1.2.3 細(xì)胞劃痕及Transwell實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn):HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后,用槍頭在培養(yǎng)皿中清晰筆直且等距離地劃三道線;在倒置顯微鏡下觀察0 h、24 h時(shí)同一視野區(qū)域并拍照,記錄劃痕寬度。

Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn):HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后,消化細(xì)胞,用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基懸浮并計(jì)數(shù)。取24孔板并加入500 μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,放入Transwell小室;取10 000個(gè)細(xì)胞接種于Transwell小室,培養(yǎng)40 h后取出Transwell小室,用PBS洗兩遍,5%戊二醛固定30 min;用棉簽擦去上室內(nèi)的細(xì)胞,對(duì)下室細(xì)胞進(jìn)行結(jié)晶紫染色30 min,顯微鏡下拍照計(jì)數(shù)。

Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn):HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后,消化細(xì)胞,用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基懸浮并計(jì)數(shù)。取24孔板并加入500 μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,放入Transwell小室,在上室內(nèi)加入100 μL基質(zhì)膠溶液(用4℃預(yù)冷DMEM培養(yǎng)基稀釋至1 mg/mL),37℃溫浴4～5 h使其干成膠狀;取50 000個(gè)細(xì)胞接種于Transwell小室,培養(yǎng)40 h后取出Transwell小室,用PBS洗兩遍,5%戊二醛固定30 min;用棉簽擦去上室內(nèi)的細(xì)胞,對(duì)下室細(xì)胞進(jìn)行結(jié)晶紫染色30 min,顯微鏡下拍照計(jì)數(shù)。

1.2.4 Western-blot檢測(cè)

HeLa(或 SiHa、C33A)細(xì)胞轉(zhuǎn)染 24 h 后,PBS洗滌兩遍,加入適量RIPA裂解液,4℃裂解30 min,隨后在4℃條件下12 000 r/min離心10 min,上清液即為提取的細(xì)胞總蛋白質(zhì)。用10%SDSPAGE進(jìn)行電泳,轉(zhuǎn)移至PVDF膜,5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,4℃條件下一抗孵育過(guò)夜,PBST洗膜3次,室溫孵育二抗1 h,化學(xué)發(fā)光法顯示結(jié)果。以GAPDH為內(nèi)參,實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.2.5 Real-time PCR檢測(cè)

HeLa(或 SiHa、C33A)細(xì)胞轉(zhuǎn)染 24 h 后,PBS洗兩遍,加入1 mL Trizol試劑裂解細(xì)胞,轉(zhuǎn)移至離心管后加入200 μL氯仿,震蕩混勻并靜置10 min;4℃、12 000 r/min離心15 min,吸取上層水相至另一離心管,加入500 μL異丙醇混勻,室溫靜置10 min;4℃、12 000 r/min離心10 min,棄上清,加入1 mL預(yù)冷75%乙醇懸浮沉淀;4℃、7 500 r/min離心5 min,棄上清,室溫晾干后加入30 μL DE-PC水溶解RNA樣品并測(cè)定濃度。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)說(shuō)明書(shū)將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,反轉(zhuǎn)錄條件為:37℃反應(yīng)15 min,85℃失活5 s。由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計(jì)并合成KLF5、SNAI1(snail family transcriptional repressor 1)、SLUG(snail family transcriptional repressor 2)、E-cadherin(cadherin 1)、N-cadherin(cadherin 2)、MMP9(matrix metallopeptidase 9)、ZEB1(zinc finger E-box binding homeobox 1)、ZEB2(zinc finger E-box binding homeobox 2)、TWIST1(twist family bHLH transcription factor 1)、GAPDH等基因的熒光定量PCR引物,引物如表2所示。

圖 4為Ma∞=1.5時(shí)燃燒室內(nèi)的流線、 聲速線和當(dāng)?shù)豈ach數(shù)分布圖. 根據(jù)圖 4(a)可見(jiàn)楔板后側(cè)和凹腔內(nèi)均出現(xiàn)較大范圍回流區(qū), 圖 4(b)顯示除噴流膨脹區(qū)和楔板后緣小部分區(qū)域外, 燃燒室整體為亞聲速流動(dòng)(Ma<1), 這是由于當(dāng)Ma∞=1.5時(shí), 燃燒室內(nèi)發(fā)生高化學(xué)當(dāng)量比的富油燃燒, 燃燒產(chǎn)生的巨大熱量造成熱壅塞, 使流動(dòng)發(fā)生壅堵, 隔離段內(nèi)產(chǎn)生正激波且被推至隔離段入口處(如圖4(b)所示).

以上述cDNA為模板,采用SYBR GREEN Mixture 試劑盒檢測(cè) KLF5、SNAI1、SLUG、E-cadherin、N-cadherin、MMP9、ZEB1、ZEB2、TWIST1 的mRNA水平。以GAPDH為內(nèi)參,每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性30 s;95℃變性10 s,60℃延伸30 s,共40個(gè)循環(huán);95℃10 s,65℃60 s,97℃1 s解離。反應(yīng)結(jié)束后,分析擴(kuò)增曲線和融解曲線,并利用2-△△Ct方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.6 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

JASPAR數(shù)據(jù)庫(kù)(http://jaspar2016.genereg.net/)能預(yù)測(cè)啟動(dòng)子區(qū)可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。我們根據(jù)預(yù)測(cè)的KLF5結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)不同長(zhǎng)度的SNAI1啟動(dòng)子截短體PCR引物,并在5′端添加酶切位點(diǎn)KpnⅠ(AAGCTT)和 HindⅢ (GGTACC)以及保護(hù)堿基,具體引物信息如表3所示。上述引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

按照TaKaRa Ex Taq?Hot Start Version說(shuō)明書(shū)中的步驟,用PCR法從HeLa細(xì)胞基因組DNA中克隆所需的SNAI1啟動(dòng)子截短體片段。PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,59℃退火30 s,72℃延伸2.5 min,反應(yīng)進(jìn)行30個(gè)循環(huán);72℃最后延伸10 min。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物雙酶切后插入到熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒(pGL3-basic)中,篩選陽(yáng)性克隆測(cè)序,隨后擴(kuò)增克隆并提純質(zhì)粒備用。

Cos7細(xì)胞轉(zhuǎn)染20～24 h后,按照熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定熒光強(qiáng)度,并測(cè)定β-gal含量以計(jì)算相對(duì)熒光強(qiáng)度。

表2 熒光定量PCR引物Table 2 Primers used for real-time quantitative PCR analysis

表3 SNAI1啟動(dòng)子截短體的PCR擴(kuò)增引物Table 3 Primer sequences of SNAI1 promoter truncation for PCR amplification

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 過(guò)表達(dá)KLF5基因能夠抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞的遷移和侵襲

為了研究KLF5基因在宮頸癌細(xì)胞中發(fā)揮的作用,選取C33A、SiHa和HeLa等幾種宮頸癌細(xì)胞系作為研究對(duì)象。首先通過(guò)Western-blot和realtime PCR技術(shù)檢測(cè)這幾種細(xì)胞系中KLF5基因的表達(dá)情況,結(jié)果顯示KLF5基因在SiHa細(xì)胞中呈高表達(dá),在HeLa和C33A細(xì)胞中表達(dá)量較低,且在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)量更低(圖1)。鑒于此,本論文選擇HeLa細(xì)胞和SiHa細(xì)胞為研究對(duì)象,在KLF5基因低表達(dá)的HeLa細(xì)胞中過(guò)表達(dá)KLF5基因,在KLF5基因高表達(dá)的SiHa細(xì)胞中沉默KLF5基因以便進(jìn)一步研究。

在宮頸癌細(xì)胞HeLa中分別轉(zhuǎn)染Flag-KLF5質(zhì)粒(實(shí)驗(yàn)組)和pcDNA3.1空載質(zhì)粒(對(duì)照組),然后進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明:與對(duì)照組相比,過(guò)表達(dá)KLF5基因后宮頸癌細(xì)胞HeLa的增殖變化不顯著(圖2A)。但是,進(jìn)一步的細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:過(guò)表達(dá)KLF5基因可以顯著地抑制HeLa細(xì)胞的遷移能力(圖2B)。而且,我們通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)也得到同樣的結(jié)果,即KLF5基因可以抑制HeLa細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力(圖2C)。

2.2 過(guò)表達(dá)KLF5抑制HeLa細(xì)胞的EMT過(guò)程

為了探究轉(zhuǎn)錄因子KLF5調(diào)控宮頸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲的分子機(jī)制,采用real-time PCR和Western-blot實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)HeLa細(xì)胞中轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。首先,在HeLa細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Flag-KLF5質(zhì)粒,結(jié)果顯示Flag-KLF5質(zhì)粒在HeLa細(xì)胞中可以正常表達(dá)(圖3A)。進(jìn)一步的real-time PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:過(guò)表達(dá)KLF5基因后,細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)因子的mRNA表達(dá)水平發(fā)生變化,其中上皮樣標(biāo)志分子E-cadherin的mRNA表達(dá)升高,間質(zhì)樣標(biāo)志分子N-cadherin和遷移標(biāo)志分子MMP9的mRNA表達(dá)降低。通過(guò)檢測(cè)E-cadherin基因的上游調(diào)控因子發(fā)現(xiàn),SNAI1、SLUG、ZEB1/2、TWIST1等轉(zhuǎn)錄因子的mRNA表達(dá)下降(圖3B,C)。轉(zhuǎn)錄因子SNAI1是EMT過(guò)程中重要的參與者,可以結(jié)合到E-cadherin啟動(dòng)子的E-box元件從而抑制其轉(zhuǎn)錄,此外,其還可以調(diào)控SLUG、ZEB1/2、TWIST1、N-cadherin和MMP9的表達(dá)。Westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示:過(guò)表達(dá)KLF5后,HeLa細(xì)胞的E-cadherin表達(dá)上調(diào),N-cadherin和SNAI1表達(dá)下調(diào)(圖3D)。

2.3 沉默KLF5基因促進(jìn)SiHa細(xì)胞的EMT過(guò)程

為了驗(yàn)證KLF5基因是否確實(shí)可以調(diào)控宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲,在KLF5基因高表達(dá)的Si-Ha細(xì)胞中用siRNA沉默KLF5基因,然后采用real-time PCR和Western-blot檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)。結(jié)果如圖4所示,沉默KLF5基因后,E-cadherin表達(dá)降低,N-cadherin表達(dá)升高,MMP9變化不顯著(圖4B)。同時(shí),其上游基因SNAI1、SLUG等表達(dá)升高,且SNAI1變化最為顯著,ZEB1/2升高不顯著(圖4C)。Western-blot實(shí)驗(yàn)顯示E-cadherin表達(dá)下調(diào),N-cadherin和SNAI1表達(dá)上調(diào)(圖4D)。以上結(jié)果說(shuō)明,KLF5基因可以調(diào)控宮頸癌細(xì)胞的EMT過(guò)程,且有可能是通過(guò)調(diào)控SNAI1的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。

圖1 三種宮頸癌細(xì)胞中KLF5基因的表達(dá)分析(A)3種宮頸癌細(xì)胞中KLF5蛋白表達(dá)水平的檢測(cè);(B)3種宮頸癌細(xì)胞中KLF5基因mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)。Fig.1 The expression of KLF5 gene in three cervical cancer cell lines(A)The expression of KLF5 protein in three cervical cancer cell lines;(B)The expression of KLF5 mRNA in three cervical cancer cell lines.

圖2 KLF5基因?qū)eLa細(xì)胞增殖和遷移的影響(A)MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)KLF5基因?qū)eLa細(xì)胞增殖的影響;(B)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)KLF5基因?qū)eLa細(xì)胞遷移能力的影響;(C)Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)KLF5基因?qū)eLa細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力的影響。Fig.2 The effects of KLF5 on proliferation and migration of HeLa cells(A)The effect of KLF5 gene on proliferation of HeLa cells detected by MTT assay;(B)The effect of KLF5 gene on migration ability of HeLa cells detected by cell scratch assay;(C)The effect of KLF5 gene on metastasis and invasion ability of HeLa cells detected by Transwell assay.

2.4 KLF5抑制SNAI1啟動(dòng)子的活性

為了進(jìn)一步驗(yàn)證KLF5是否通過(guò)抑制SNAI1基因的表達(dá)來(lái)調(diào)控宮頸癌細(xì)胞的EMT過(guò)程,我們首先利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)JASPAR預(yù)測(cè)KLF5結(jié)合SNAI1啟動(dòng)子區(qū)的位點(diǎn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn):SNAI1啟動(dòng)子區(qū)域含有多個(gè)預(yù)測(cè)的KLF5結(jié)合位點(diǎn)(圖5A)。基于預(yù)測(cè)結(jié)果,我們構(gòu)建不同片段的截短體,并在Cos7細(xì)胞中采用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)KLF5對(duì)SNAI1啟動(dòng)子區(qū)域的影響。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示:KLF5對(duì)SNAI1-Luc-1000、SNAI1-Luc-500、SNAI1-Luc-300、SNAI1-Luc-200具有顯著抑制作用,抑制作用最高達(dá)到80%,但是當(dāng)截短到上游100 bp后,KLF5對(duì)SNAI1啟動(dòng)子的抑制作用減弱,不再具有顯著性差異,說(shuō)明SNAI1啟動(dòng)子-200至-100區(qū)域含有KLF5的結(jié)合位點(diǎn),KLF5可以結(jié)合到SNAI1啟動(dòng)子區(qū)域(-200至-100)來(lái)抑制SNAI1基因的表達(dá)(圖5B)。

為了進(jìn)一步檢測(cè)KLF5對(duì)SNAI1-Luc-200的抑制作用,在24孔板中梯度濃度轉(zhuǎn)染Flag-KLF5質(zhì)粒,結(jié)果發(fā)現(xiàn)KLF5可以劑量依賴(lài)性地抑制SNAI1-Luc-200的表達(dá)(圖5C)。這說(shuō)明KLF5確實(shí)可以結(jié)合到SNAI1基因的啟動(dòng)子上游-200至-100區(qū)域抑制SNAI1基因的表達(dá),并且這種抑制效應(yīng)呈劑量依賴(lài)性。

2.5 過(guò)表達(dá)SNAI1對(duì)HeLa細(xì)胞EMT相關(guān)基因表達(dá)的影響

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明KLF5可以結(jié)合到SNAI1基因的啟動(dòng)子區(qū)域抑制其表達(dá),進(jìn)而影響宮頸癌細(xì)胞的EMT過(guò)程。為了驗(yàn)證SNAI1對(duì)宮頸癌細(xì)胞EMT過(guò)程的影響,在HeLa細(xì)胞中過(guò)表達(dá)SNAI1基因,利用real-time PCR技術(shù)檢測(cè)EMT相關(guān)基因的mRNA水平。結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,過(guò)表達(dá)SNAI1抑制了E-cadherin的表達(dá),同時(shí)促進(jìn)了N-cadherin和MMP9的表達(dá),而且過(guò)表達(dá)SNAI1也可以促進(jìn)其下游轉(zhuǎn)錄因子SLUG、ZEB1、ZEB2、TWIST1等mRNA水平的表達(dá)(圖6)。因此,SNAI1是EMT過(guò)程的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,KLF5對(duì)SNAI1基因的調(diào)控會(huì)影響宮頸癌細(xì)胞的EMT過(guò)程。

圖5 KLF5對(duì)SNAI1啟動(dòng)子截短體活性的影響(A)JASPAR軟件預(yù)測(cè)SNAI1啟動(dòng)子區(qū)域KLF5的結(jié)合位點(diǎn);(B)熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)KLF5對(duì)不同長(zhǎng)度SNAI1啟動(dòng)子截短體活性的影響;(C)熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)梯度轉(zhuǎn)染Flag-KLF5質(zhì)粒對(duì)于SNAI1-Luc-200啟動(dòng)子片段活性的影響。Fig.5 The effects of KLF5 on the activity of SNAI1 promoter truncation(A)The binding site of KLF5 in the SNAI1 promoter region predicted by JASPAR software;(B)The effect of KLF5 gene on the activities of different lengths of truncated SNAI1 promoters by luciferase reporter gene assay;(C)The effect of gradient transfection of the Flag-KLF5 plasmid on the activity of the SNAI1-Luc-200 promoter fragment by luciferase reporter gene assay.

圖6 HeLa細(xì)胞中過(guò)表達(dá)SNAI1對(duì)EMT相關(guān)基因表達(dá)的影響(A)在HeLa細(xì)胞中檢測(cè)過(guò)表達(dá)SNAI1對(duì)遷移相關(guān)基因E-cadherin、N-cadherin和MMP9轉(zhuǎn)錄水平的影響;(B)在HeLa細(xì)胞過(guò)表達(dá)SNAI1后,E-cadherin、N-cadherin和MMP9等遷移相關(guān)基因上游轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)結(jié)果。Fig.6 The effects of overexpressing SNAI1 gene on the expression of EMT-related genes in HeLa cells(A)The effects of overexpression of the SNAI1 gene on the transcriptional levels of the migration-related genes E-cadherin,N-cadherin and MMP9 in HeLa cells;(B)The effects of overexpression of SNAI1 gene on the transcriptional levels of upstream transcription factors of migration-related proteins such as E-cadherin,N-cadherin and MMP9 in HeLa cells.

3 討論

據(jù)統(tǒng)計(jì),我國(guó)每年因?qū)m頸癌死亡人數(shù)大約5.3萬(wàn),占女性因惡性腫瘤死亡人數(shù)的18.4%,可見(jiàn)宮頸癌是危害我國(guó)女性健康與生命的重要疾病[12],因此,研究宮頸癌的發(fā)生發(fā)展對(duì)于預(yù)防和治療這種惡性疾病具有積極的意義。

KLF5在多種腫瘤類(lèi)型中異常表達(dá)[13～17]。Marrero-Rodríguez等[10]的研究結(jié)果顯示 KLF5 的表達(dá)隨宮頸病變惡性程度逐漸升高,且在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能作為一個(gè)獨(dú)立的影響因素。本研究發(fā)現(xiàn)KLF5在調(diào)控宮頸癌轉(zhuǎn)移方面具有重要作用,在以宮頸癌HeLa細(xì)胞為研究對(duì)象的實(shí)驗(yàn)中,過(guò)表達(dá)KLF5可抑制HeLa細(xì)胞的遷移和侵襲能力(圖2B,C)。在癌癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,上皮細(xì)胞會(huì)經(jīng)歷EMT過(guò)程,期間細(xì)胞的極性和細(xì)胞間黏附作用消失,運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)。伴隨著細(xì)胞的形態(tài)變化,EMT指示性分子E-cadherin等表達(dá)降低,N-cadherin、波形蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶等表達(dá)增多,細(xì)胞的遷移和侵襲能力增強(qiáng)。有研究顯示,KLF5可以作為T(mén)GF-β通路的一個(gè)輔助因子,參與調(diào)控癌癥的EMT過(guò)程[18]。此外,E-cadherin、N-cadherin和基質(zhì)金屬蛋白酶等的上游轉(zhuǎn)錄因子,如 SNAI1、SLUG、ZEB1、ZEB2、TWIST1 等,也是TGF-β通路調(diào)節(jié)的重要分子[19]。我們的研究結(jié)果顯示,在宮頸癌HeLa細(xì)胞中過(guò)表達(dá)KLF5后,SNAI1、SLUG等轉(zhuǎn)錄因子mRNA水平和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)均下降(圖3C,D)。對(duì)比研究發(fā)現(xiàn),在KLF5高表達(dá)的SiHa細(xì)胞中沉默KLF5基因后,SNAI1、SLUG等基因表達(dá)上調(diào)(圖4C,D)。這些結(jié)果說(shuō)明KLF5可以通過(guò)TGF-β信號(hào)通路調(diào)控宮頸癌細(xì)胞的EMT過(guò)程。在上述轉(zhuǎn)錄因子中,SNAI1被認(rèn)為是調(diào)節(jié)各種癌癥EMT過(guò)程的主要轉(zhuǎn)錄因子[20],可以調(diào)控ZEB1、ZEB2等的表達(dá);同時(shí),SNAI1可以與E-cadherin啟動(dòng)子結(jié)合,增強(qiáng)波形蛋白和MMP9的表達(dá)水平,并最終促進(jìn)EMT[21]。因此,我們推測(cè)KLF5通過(guò)抑制SNAI1的表達(dá)來(lái)抑制EMT過(guò)程。

KLF5是一種基本的轉(zhuǎn)錄因子,通過(guò)3個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域與富含GC的DNA序列(如Sp1位點(diǎn)、GC盒、CACCC盒等)結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄[22]。JASPAR數(shù)據(jù)庫(kù)可以預(yù)測(cè)真核生物轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)。本研究利用該數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)了KLF5結(jié)合SNAI1基因啟動(dòng)子的多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)(圖5A)。為了研究KLF5發(fā)揮作用的結(jié)合位點(diǎn),我們構(gòu)建了含有不同結(jié)合位點(diǎn)的啟動(dòng)子截短體質(zhì)粒。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示,KLF5可以結(jié)合到SNAI1啟動(dòng)子的-200至-100區(qū)域來(lái)抑制SNAI1基因的表達(dá)(圖5B)。綜合上述信息,KLF5很可能是通過(guò)結(jié)合到SNAI1的啟動(dòng)子區(qū)域抑制SNAI1基因的轉(zhuǎn)錄活性,進(jìn)而抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞的EMT過(guò)程。SNAI1誘導(dǎo)EMT過(guò)程中,除可直接下調(diào)E-cadherin蛋白的表達(dá)外,可以上調(diào)N-cadherin、波形蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶、TWIST、ZEB1和ZEB2等蛋白質(zhì)的表達(dá)水平[21]。為了進(jìn)一步驗(yàn)證KLF5是否通過(guò)調(diào)控SNAI1介導(dǎo)的EMT通路來(lái)影響宮頸癌細(xì)胞的侵襲和遷移,在HeLa細(xì)胞中過(guò)表達(dá)SNAI1基因,real-time PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)過(guò)表達(dá)SNAI1可以下調(diào)E-cadherin基因的表達(dá),同時(shí)增強(qiáng)了 N-cadherin、MMP9、SLUG、TWIST、ZEB1/2 基因的表達(dá)(圖 6)。

因此,本研究發(fā)現(xiàn)KLF5可能通過(guò)抑制SNAI1基因的表達(dá)來(lái)參與宮頸癌HeLa細(xì)胞的EMT過(guò)程,進(jìn)而抑制宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲。但是,KLF5調(diào)控SNAI1的表達(dá)是否還有其他基因或者通路的參與有待進(jìn)一步研究。