季慧慧,鄭中華,段世偉

(寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院浙江省病理生理學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國浙江寧波315211)

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(coronary heart disease,CHD)簡(jiǎn)稱“冠心病”,是全球死亡率最高的疾病之一,也是全球公共衛(wèi)生面臨的主要挑戰(zhàn)。根據(jù)2014年世界衛(wèi)生組織的報(bào)告,從2000年到2012年,全球有5 600萬人死于CHD[1]。CHD是一種由多種因素導(dǎo)致的復(fù)雜疾病。相關(guān)研究表明,年齡、吸煙史、飲酒史、高血壓病史、糖尿病史、肥胖、炎癥、高血脂等是早發(fā)CHD的危險(xiǎn)因素[2]。據(jù)報(bào)道,包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重構(gòu)和非編碼RNA調(diào)控在內(nèi)的表觀遺傳因子通過改變基因與環(huán)境的相互作用而引起CHD[3]。DNA甲基化是指通過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase,Dnmt)的作用在 5′-CpG-3′二核苷酸胞嘧啶的第5個(gè)碳原子上合成甲基。DNA甲基化涉及多種細(xì)胞生理和病理活動(dòng),例如時(shí)間和空間特異性基因表達(dá)、X染色體失活、衰老、癌癥和心血管疾病[4]。已知淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)高甲基化與阿爾茨海默病相關(guān)[5]。APP致病變體或重復(fù)會(huì)導(dǎo)致β淀粉樣蛋白(β-amyloid protein,Aβ)相關(guān)的腦淀粉樣血管病的發(fā)生,是原發(fā)性非創(chuàng)傷性腦出血的主要原因[6]。慢性炎癥引起的疾病如動(dòng)脈粥樣硬化等是由多種遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果,并且這些疾病具有共同的分子機(jī)制。越來越多的小鼠模型表明APP在血管炎癥中起核心作用,可激活內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中的一系列促炎事件[7～8]。本研究主要觀察CHD患者APP甲基化水平并探討其可能存在的調(diào)節(jié)機(jī)制,旨在闡明CHD與APP甲基化水平改變之間的關(guān)系。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

2015年2月至2018年2月,從浙江省寧波市第一醫(yī)院收集CHD患者538名(63±10歲,男性378名,女性160名),作為病例組,同期健康體檢者453名(59±10歲,男性249名,女性204名),作為正常對(duì)照組。納入病例組的標(biāo)準(zhǔn):采用Judkins冠狀動(dòng)脈造影術(shù),將左回旋支、左前旋降支、左冠狀動(dòng)脈主干、右冠狀動(dòng)脈中至少有一支冠狀動(dòng)脈狹窄程度大于或等于50%的患者納入病例組。排除標(biāo)準(zhǔn):1)患有先天性心臟病、風(fēng)濕性心臟病、肺性心臟病、高血壓心臟病等的患者;2)患有精神疾病的患者;3)患有惡性腫瘤、肝腎功能不全、血液系統(tǒng)疾病的患者。對(duì)照組入選對(duì)象為該院同期健康體檢者,無肝腎功能異常、惡性腫瘤、心臟病等。本研究獲得了所有研究對(duì)象的知情同意,并且通過了寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 血液采集及一般臨床資料

受試者空腹8 h后,抽取肘靜脈血5 mL,用2%乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid,EDTA)抗凝。收集一般資料,包括年齡、性別、吸煙史、高血壓病史、糖尿病史、冠狀動(dòng)脈狹窄程度等。采用Beckman AU5800全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、高密度脂蛋白(highdensity lipoprotein,HDL)、甘油三酸酯(triglyceride,TG)、載脂蛋白 A(apolipoprotein A,ApoA)、載脂蛋白B(apolipoprotein B,ApoB)、載脂蛋白E(apolipoprotein E,ApoE)、脂蛋白(a)[lipoprotein(a),Lp(a)]、C-反應(yīng)蛋白(C-reactin protein,CRP)、白蛋白(albumin)、球蛋白(globulin)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、堿性磷酸鹽(alkaline phosphate,ALP)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(γ-glutamyl transferase,γ-GT)等的濃度。

1.3 DNA提取及亞硫酸氫鹽修飾

根據(jù)E.Z.N.A.TM血液試劑盒(Omega Bio-Tek,Norcross,GA)的說明書,提取基因組DNA,保存在-20℃冰箱中。通過Nanodrop 2000分光光度計(jì)(Thermal Scientific Co.Ltd,Wilmington,USA)測(cè)量DNA濃度。通過EZ DNA Methylation-Gold Kit(Zymo Research,Orange,USA)進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾?；蚪MDNA通過亞硫酸氫鹽修飾后,未甲基化的胞嘧啶相應(yīng)地轉(zhuǎn)化為尿嘧啶,而已甲基化的胞嘧啶則保留在反應(yīng)中。

1.4 甲基化特異性實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative methylation-specific PCR,qMSP)

將經(jīng)過亞硫酸氫鹽修飾的DNA用作qMSP測(cè)定中的模板,最終反應(yīng)體系共20 μL,含有10 μL SYBR Green I Master(Roche,Basel,Switzerland)、0.5 μL 正向引物、0.5 μL 反向引物、1 μL DNA樣本以及8 μL ddH2O。正向引物的序列為 5′-GTTGTCGTCGTTAGTAGTC-3′,反向引物的序列為 5′-TCGTTTCACCTTCCTCTC-3′。PCR 反應(yīng)在Light Cycler 480(Roche,Basel,Switzerland)中進(jìn)行,具體條件如下。首先,95℃下進(jìn)行1個(gè)10 min的循環(huán);其次,95℃下持續(xù)20 s,58℃下退火20 s,72℃持續(xù)30 s,循環(huán)45次;然后,1循環(huán)的融化分析曲線在下列條件進(jìn)行:95℃15 s,60℃1 min,之后以每秒增加0.11℃的幅度升溫至95℃;最后,40℃下延伸擴(kuò)展10 min。

1.5 Sanger測(cè)序及毛細(xì)管電泳

我們隨機(jī)選取亞硫酸氫鹽修飾過的DNA進(jìn)行Sanger測(cè)序。與原序列相比,亞硫酸氫鹽修飾后的尿嘧啶完全轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶,甲基化胞嘧啶保持不變,則轉(zhuǎn)化過程得到驗(yàn)證。采用全自動(dòng)高分辨率毛細(xì)管電泳儀(Qsep100,Bioptic Inc.,Taiwan,China)對(duì)qMSP產(chǎn)物進(jìn)行分析,以驗(yàn)證產(chǎn)物的片段大小是否與理論片段長(zhǎng)度相符。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

所有的統(tǒng)計(jì)分析均使用SPSS 18.0軟件(SPSS Inc,Chicago,IL,USA)。獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、卡方檢驗(yàn)及Mann-Whitney U test檢驗(yàn)用于評(píng)估臨床特征及APP基因甲基化水平在CHD組與對(duì)照組之間的差異。采用Spearman相關(guān)性測(cè)試來評(píng)估APP甲基化與生化指標(biāo)之間的相關(guān)性。DNA甲基化水平采用相對(duì)甲基化率(percentage of methylated reference,PMR)表示。每個(gè)樣本的PMR使用2-△△Ct量化方法計(jì)算[9],具體公式為

2 結(jié)果

2.1 受試者臨床基線特征

我們一共收集了538名CHD患者(63±10歲,男性378名,女性160名)及453名正常對(duì)照(59±10歲,男性249名,女性204名)。其中,CHD組吸煙及糖尿病患者人數(shù)顯著高于對(duì)照組(吸煙,P=0.001;糖尿病,P=0.019,表1),但白蛋白水平顯著低于對(duì)照組(P=0.001,表 1)。此外,AST、ALP 及 γ-GT 水平在CHD組中顯著高于對(duì)照組(AST,P=3.0E-04;ALP,P=0.001;γ-GT,P=0.018,表 1)。

年齡是CHD的重要影響因素[10],因此我們進(jìn)一步根據(jù)年齡分層進(jìn)行亞組分析。以CHD組的平均年齡63歲為界,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在年齡≥63歲的人群中,CHD組白蛋白水平顯著低于對(duì)照組(P=0.016,表2)。在年齡＜63歲的人群中,CHD組糖尿病患者人數(shù)顯著高于對(duì)照組(P=0.001,表2)。在兩個(gè)亞組中,CHD組吸煙人數(shù)顯著多于對(duì)照組(≥63歲,P=0.001;＜63歲,P=5.0E-05,表 2);AST、ALP 水平在CHD組中顯著高于對(duì)照組(表2)。

2.2 APP啟動(dòng)子CpG島區(qū)域的靶序列說明

啟動(dòng)子CpG島異常甲基化與基因轉(zhuǎn)錄失活有關(guān)[11]。由于甲基化往往發(fā)生在CpG二核苷酸的位置,所以我們選擇了啟動(dòng)子區(qū)域CpG島位置的位點(diǎn)(chr21:26 169 970～26 170 045)進(jìn)行研究(圖1A)。同時(shí),我們的研究是基于平均甲基化率,而不是針對(duì)某個(gè)特定的cg位點(diǎn)。Sanger測(cè)序結(jié)果表明,擴(kuò)增片段與目標(biāo)序列吻合,亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化效果良好(圖1B)。毛細(xì)管電泳結(jié)果(圖1C)證實(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為76 bp。

表1 根據(jù)CHD進(jìn)行血管造影研究的人群的基線特征Table 1 Baseline characteristics of the population undergoing angiographic study according to CHD

2.3 CHD患者APP甲基化與正常對(duì)照之間的比較

qMSP檢測(cè)發(fā)現(xiàn)APP基因甲基化水平在CHD組顯著高于對(duì)照組(P=0.026,表3)。進(jìn)一步的性別分層分析發(fā)現(xiàn),APP基因甲基化水平在男性CHD組顯著高于男性對(duì)照組(P=0.025,表3)。

2.4 CHD患者APP甲基化與冠脈狹窄程度之間的相關(guān)性

冠狀動(dòng)脈狹窄程度是CHD的主要評(píng)判依據(jù)。在CHD患者中,我們發(fā)現(xiàn)不吸煙患者的APP甲基化水平和狹窄程度(Gensini冠脈狹窄評(píng)分)呈正比(r=0.076,P=0.046,表4)。在CHD伴高血壓患者中,APP甲基化水平和狹窄程度也呈正比(r=0.096,P=0.029,表4)。性別分層分析發(fā)現(xiàn),在男性CHD伴高血壓患者中,APP甲基化水平和狹窄程度呈正比(r=0.135,P=0.019,表 4)。

進(jìn)一步的年齡分層分析發(fā)現(xiàn),在年齡≥63歲的男性CHD伴高血壓患者中,APP甲基化水平與狹窄程度呈正比(r=0.219,P=0.020,表5);在年齡＜63歲的不吸煙或非高血壓CHD患者中,APP甲基化水平與狹窄程度呈負(fù)相關(guān)(不吸煙,r=-0.223,P=0.008;非高血壓,r=-0.216,P=0.010,表 5)。

2.5 受試者APP甲基化與臨床特征之間的關(guān)系

如表6所示,在男性CHD患者中,APP甲基化水平與年齡呈正相關(guān)(r=0.163,P=0.001);在女性CHD患者中,APP甲基化水平與年齡呈負(fù)相關(guān)(r=-0.192,P=0.015)。此外,在正常對(duì)照組中,APP甲基化水平與Lp(a)水平呈正相關(guān)(r=0.108,P=0.031,表6)。在男性正常對(duì)照組中,APP甲基化水平與年齡呈負(fù)相關(guān) (r=-0.203,P=0.001,表6);在女性正常對(duì)照組中,APP甲基化水平與ApoB、白蛋白及ALT水平呈負(fù)相關(guān)(ApoB,r=-0.160,P=0.028;白蛋白,r=-0.151,P=0.036;ALT,r=-0.163,P=0.024,表6)。

進(jìn)一步的年齡分層分析發(fā)現(xiàn),在年齡≥63歲的CHD患者及女性CHD患者中,APP甲基化水平與HDL水平呈正相關(guān)(總體,r=0.160,P=0.008;女性,r=0.261,P=0.012,表7)。在年齡≥63歲的女性CHD患者中,APP甲基化水平與ALP水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.250,P=0.040,表7)。在年齡≥63歲的正常對(duì)照組及女性正常對(duì)照組中,APP甲基化水平與ALP呈正相關(guān)(總體,r=0.223,P=0.009;女性,r=0.242,P=0.047,表7)。在年齡≥63歲的正常對(duì)照組中,APP甲基化水平與ApoB水平呈正相關(guān)(r=0.180,P=0.025,表7)。在年齡＜63歲的男性CHD患者中,APP甲基化水平與年齡呈正相關(guān)(r=0.145,P=0.049,表8)。在年齡＜63歲的正常對(duì)照組中,APP甲基化水平與年齡、白蛋白水平呈負(fù)相關(guān)(年齡,r=-0.124,P=0.038;白蛋白,r=-0.134,P=0.030,表8),與Lp(a)水平呈正相關(guān)(r=0.127,P=0.046,表8)。在年齡＜63歲的女性正常對(duì)照組中,APP甲基化水平與白蛋白水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.197,P=0.036,表8)。在年齡＜63歲的男性正常對(duì)照組中,APP甲基化水平與ALP水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.061,P=0.042,表 8)。

表2 根據(jù)CHD進(jìn)行血管造影研究的人群的基線特征(按年齡分層)Table 2 Baseline characteristics of the population undergoing angiographic study according to CHD(age stratification)

表3 CHD患者與正常對(duì)照的APP甲基化差異Table 3 The difference of APP methylation between CHD patients and normal controls

表4 CHD患者APP甲基化與冠狀動(dòng)脈狹窄積分的相關(guān)性Table 4 Correlation between APP methylation and stenosis score in CHD patients

圖1 APP啟動(dòng)子CpG島的引物及目標(biāo)擴(kuò)增序列(A)目標(biāo)序列定位及功能注釋。根據(jù)人類2013(GRCh38/hg38)裝配,來自UCSC基因組瀏覽器。目標(biāo)序列位于APP的CpG島區(qū)域,引物用下劃線標(biāo)示,F和R分別為正向引物和反向引物。圖中淡藍(lán)色代表HUVEC細(xì)胞系,紫色代表NHEK細(xì)胞系,綠色代表HSMM細(xì)胞系,紅色代表GM12878細(xì)胞系,橘黃代表H1-hESC細(xì)胞系,粉紅色代表NHLF細(xì)胞系,深藍(lán)色代表K562細(xì)胞系。6個(gè)CpG位點(diǎn)為綠色;(B)部分Sanger測(cè)序結(jié)果;(C)毛細(xì)管電泳擴(kuò)增片段結(jié)果。Fig.1 The target sequence and primers in APP promoter CpG island region(A)The location and functional annotation of the target sequence from the University of California Santa Cruz genome browser based on human 2013(GRCh38/hg38).The target sequence is located in the CpG island region of APP,and the primers are underlined and six CpG sites are in green.F and R are forward and reverse primers,respectively.Light blue represents HUVEC cell line,purple represents NHEK cell line,green represents HSMM cell line,red represents GM12878 cell line,orange represents H1-hESC cell line,pink represents NHLF cell line,and dark blue represents K562 cell line;(B)Sanger sequencing of the converted DNA;(C)The size verification of the amplified product by capillary electrophoresis.

表5 CHD患者APP甲基化與冠狀動(dòng)脈狹窄積分的相關(guān)性(按年齡分層)Table 5 Correlation between APP methylation and stenosis score in CHD patients(age stratification)

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)CHD組的年齡、男性人數(shù)、吸煙及糖尿病患者人數(shù)均高于對(duì)照組;CHD組白蛋白水平顯著低于對(duì)照組,而AST、ALP及γ-GT的水平在CHD組中顯著高于對(duì)照組(表1)。在總體樣本及男性樣本中,我們均發(fā)現(xiàn)APP基因甲基化水平在CHD組顯著高于對(duì)照組(表3)。在非吸煙CHD患者中,我們發(fā)現(xiàn)APP甲基化水平與狹窄程度呈正比。在總體CHD伴高血壓患者及男性CHD伴高血壓患者中,APP甲基化水平和狹窄程度呈正比(表4)。年齡分層分析后發(fā)現(xiàn),在年齡≥63歲的男性CHD伴高血壓患者中,APP甲基化水平與狹窄程度呈正比;在年齡＜63歲的不吸煙或非高血壓CHD患者中,APP甲基化水平與狹窄程度呈負(fù)相關(guān)(表5)。性別分層分析結(jié)果顯示,在男性CHD患者中,APP甲基化水平與年齡呈正相關(guān);在女性CHD患者中,APP甲基化水平與年齡呈負(fù)相關(guān)。此外,在男性正常對(duì)照組中,APP甲基化水平與年齡呈負(fù)相關(guān);在女性正常對(duì)照組中,APP甲基化水平與ApoB、白蛋白及ALT水平呈負(fù)相關(guān);在正常對(duì)照組中,APP甲基化水平與Lp(a)水平呈正相關(guān)(表 6)。

血管會(huì)隨著年齡的增長(zhǎng)而老化,表現(xiàn)為血管彈性下降、血液難以透過血管壁。同時(shí),被稱為斑塊的脂肪沉積也會(huì)沿著動(dòng)脈壁堆積,進(jìn)而減緩心臟的血液流動(dòng)。因此,隨著年齡的增長(zhǎng),CHD的患病風(fēng)險(xiǎn)也會(huì)增加。Fukumoto等[12]在628名日本CHD患者中發(fā)現(xiàn),年齡、男性、HbA1c、血脂異常均能增加患CHD的風(fēng)險(xiǎn)。Abbott等[13]對(duì)18 456名年齡在45～93歲的樣本進(jìn)行了6年的隨訪,結(jié)果發(fā)現(xiàn)677名發(fā)生CHD,并且隨著年齡的增長(zhǎng),危險(xiǎn)因素(如高血壓等)對(duì)CHD發(fā)病的影響增加。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)CHD組的年齡均高于對(duì)照組,且在男性CHD患者中,APP甲基化水平與年齡呈正相關(guān)。年齡分層分析后發(fā)現(xiàn),在年齡≥63歲的男性CHD伴高血壓患者中,APP甲基化水平與狹窄程度呈正比。已有的研究表明,在血小板活化后,sAPP由α-顆粒分泌并抑制凝血因子,從而防止腦、冠狀動(dòng)脈和外周動(dòng)脈中的血栓形成[14]。APP能在血小板中表達(dá),且是凝血酶的抑制劑,DNA甲基化很可能通過調(diào)控APP基因的表達(dá)水平,從而影響血小板的活性,進(jìn)而對(duì)CHD的發(fā)生發(fā)展過程產(chǎn)生影響。

表6 受試者APP甲基化與臨床特征的相關(guān)性分析Table 6 Correlation analysis between APP methylation and clinical characteristics of subjects

表7 年齡63歲以上受試者APP甲基化與臨床特征的相關(guān)性分析Table 7 Correlation analysis between APP methylation and clinical characteristics of subjects above 63 years old

表8 年齡63歲以下受試者APP甲基化與臨床特征的相關(guān)性分析Table 8 Correlation analysis between APP methylation and clinical characteristics of subjects under 63 years old

性別也是CHD患病風(fēng)險(xiǎn)的影響因素之一。近30年來,我國CHD發(fā)病率、死亡率呈上升趨勢(shì),且在不同的性別中呈現(xiàn)不同的發(fā)病率和死亡率,男性的患病率和死亡率明顯高于女性[15]。Fukumoto等[12]在日本人群中的研究亦表明,男性患CHD的風(fēng)險(xiǎn)高于女性。另外,李威等[16]發(fā)現(xiàn)2010-2014年間,天津市報(bào)告的居民急性冠心病事件中,男性平均粗發(fā)病率多于女性,且男性平均發(fā)病年齡早于女性。本研究的結(jié)果表明,CHD組的男性人數(shù)高于對(duì)照組,且在總體樣本及男性樣本中,均發(fā)現(xiàn)APP基因甲基化水平在CHD組顯著高于對(duì)照組。此外,在男性CHD患者中,APP甲基化水平與年齡呈正相關(guān)。兩性的CHD患病風(fēng)險(xiǎn)因素及臨床特征存在差異,很可能是DNA和組蛋白修飾的差異、X和Y染色體攜帶基因的不同、性激素等共同作用的結(jié)果[17]。由此,根據(jù)我們的結(jié)果推測(cè),APP基因啟動(dòng)子甲基化水平存在性別差異是以上因素共同調(diào)節(jié)所導(dǎo)致的。

王廣娟等[18]在山東人群中發(fā)現(xiàn),冠心病組吸煙率及同型半胱氨酸血癥(homocysteine,Hcy)均高于對(duì)照組,吸煙者患冠心病的風(fēng)險(xiǎn)是不吸煙者的4.832倍,高同型半胱氨酸血癥(hyperhomocysteinemia,HHcy)者患冠心病的風(fēng)險(xiǎn)是正常Hcy者的1.019倍,有HHcy且吸煙者患冠心病的風(fēng)險(xiǎn)是無HHcy且不吸煙者的2.473倍。HHcy正是高血壓的一個(gè)獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素[19],且能夠刺激血管平滑肌細(xì)胞增殖,增強(qiáng)凝血功能和誘導(dǎo)血栓形成,促進(jìn)炎癥因子表達(dá)[20]。我們的研究發(fā)現(xiàn)CHD組的吸煙人數(shù)高于對(duì)照組,而且在總體CHD伴高血壓患者及男性CHD伴高血壓患者中,APP甲基化水平和狹窄程度呈正比。我們猜測(cè),APP基因甲基化水平或許通過吸煙及HHcy水平的調(diào)節(jié),對(duì)CHD的發(fā)病機(jī)制產(chǎn)生作用。

Booth等[21]在加拿大人群中發(fā)現(xiàn),糖尿病患者較非糖尿病患者提前15年進(jìn)入心血管疾病高風(fēng)險(xiǎn)狀態(tài)。CHD合并糖尿病患者具有更高的斑塊負(fù)荷、動(dòng)脈粥樣硬化體積和相對(duì)狹窄的冠脈血管直徑[22]。和他們的研究結(jié)果一致,我們亦發(fā)現(xiàn)CHD組的糖尿病患者人數(shù)高于對(duì)照組。

本研究是通過qMSP技術(shù)來檢測(cè)APP基因甲基化水平與CHD的相關(guān)性,從而探究CHD的發(fā)生與發(fā)展機(jī)制。qMSP技術(shù)是一種具有高度特異性、敏感性和重現(xiàn)性的方法,基因啟動(dòng)子的甲基化水平可以以百分比的形式實(shí)現(xiàn),從而更精確、更容易解釋高甲基化狀態(tài)的識(shí)別[23]。結(jié)合高度精確的設(shè)置,qMSP技術(shù)適用于檢測(cè)完全甲基化和未甲基化DNA的部分,可顯示正確的甲基化和非甲基化DNA的比例[23]。同時(shí),基于SYBR-green的PCR技術(shù)檢測(cè)高甲基化基因表達(dá)的能力已被確定為診斷良性前列腺增生早期非侵襲性癌變的一個(gè)有價(jià)值的工具[24]。另外,目前關(guān)于APP基因啟動(dòng)子甲基化和CHD的研究國內(nèi)外都很少,因此本研究具有一定的新穎性和創(chuàng)新性,填補(bǔ)了APP基因啟動(dòng)子甲基化與CHD關(guān)系的空白。此外,本研究收集了大量的樣本,對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行研究,在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有很好的可靠性,所得結(jié)果具有一定的指導(dǎo)價(jià)值。但也存在以下不足:病例組與對(duì)照組之間的年齡、性別等存在一定的差別,且未進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)水平的研究等。

綜上所述,APP基因甲基化水平和年齡呈正相關(guān)。隨著年齡的增長(zhǎng),APP基因的表達(dá)下降,從而導(dǎo)致血小板功能增強(qiáng),進(jìn)一步加重CHD的病程。此外,男性吸煙很可能是導(dǎo)致男性CHD患病年齡早于女性的原因。同以往的研究結(jié)果[25]一致,糖尿病和高血壓都是CHD重要的風(fēng)險(xiǎn)因素?？偟膩碇v,應(yīng)及時(shí)開展干預(yù)措施,降低吸煙率,加大CHD預(yù)防措施的宣傳,以減少該疾病的發(fā)生率。