羅穎 羅葉強(qiáng)

【摘要】目的：探討葉酸對(duì)糖尿病腎病大鼠足微循環(huán)的改善機(jī)制。方法：將25只健康雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為2組，分別為正常組（5只）和造模組（20只）。給模型組大鼠每天喂高脂高糖日糧，正常組喂基礎(chǔ)日糧。4周后稱量體重，造模大鼠空腹腹腔注射1%的鏈脲佐菌素溶液（sTZ，30mg/kg），正常組注射相等容量的檸檬酸鹽緩沖液。喂養(yǎng)2周后，測(cè)定正常組與模型組的血糖和胰島素水平。用基礎(chǔ)飼料統(tǒng)一喂養(yǎng)造模后的大鼠和正常組大鼠。模型大鼠隨機(jī)分為s證組、和低劑量（1.5mg/kg）、中劑量（3mg/kg）、高劑量（5mg/kg）葉酸組進(jìn)行干預(yù)，再檢測(cè)大鼠鼠尾血糖濃度。各組均在干預(yù)灌胃3d后心臟無(wú)菌取血制備血清。在底面積75 cm2的培養(yǎng)瓶中加入完全培養(yǎng)基進(jìn)行小鼠足細(xì)胞培養(yǎng)。將正常組和模型組小鼠足細(xì)胞的培養(yǎng)依次分為空白對(duì)照組、stz組、正常鼠血清對(duì)照組和添加低、中、高劑量葉酸血清組。刺激24h之后用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)大鼠血清VEGF水平，后通過(guò)PCR技術(shù)檢測(cè)mRNA中VEGF水平，后用蛋白質(zhì)印跡法（wB）檢測(cè)蛋白質(zhì)VEGF表達(dá)水平。結(jié)果：在高糖組和正常鼠血清組小鼠足細(xì)胞觀察到VEGF的陽(yáng)性表達(dá)。添加葉酸的血清組足細(xì)胞VEGF在蛋白質(zhì)和mRNA中的表達(dá)比高糖組和正常鼠血清組有所降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：葉酸能夠介導(dǎo)血管內(nèi)皮因子（VEGF）水平從而改善糖尿病腎病大鼠足的微循環(huán)。

【關(guān)鍵詞】葉酸 糖尿病腎病 足細(xì)胞 血管生長(zhǎng)內(nèi)皮因子

糖尿病腎?。―N）是目前糖尿病病人最重要的并發(fā)癥之一。在中國(guó)，糖尿病腎病的發(fā)病率呈現(xiàn)出明顯的上升趨勢(shì)。其中糖尿病腎病的發(fā)生機(jī)制中就有眾多細(xì)胞因子的活化，其中就包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、血管生成素（Ang）等。研究人員在對(duì)糖尿病患者的長(zhǎng)期觀察中發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的濃度較非糖尿病患者顯著升高。已有研究表明補(bǔ)充葉酸能有效降低糖尿病腎病的發(fā)病率，但補(bǔ)充葉酸對(duì)降低糖尿病腎病的發(fā)病率的理論機(jī)制并不十分清楚。本研究假設(shè)通過(guò)補(bǔ)充葉酸能夠介導(dǎo)血管內(nèi)皮因子（VEGF）水平從而改善糖尿病腎病大鼠足的微循環(huán)?，F(xiàn)報(bào)告如下：

一、材料

（1）動(dòng)物。健康雄性sD大鼠25只，體重200～220g。

（2）藥物。葉酸片購(gòu)于天津力生葉酸片。分別配置低（1.5mg/kg）、中（3mg/kg）、高劑量（5mg/kg）葉酸。

二、實(shí)驗(yàn)方法

（一）分組與細(xì)胞培養(yǎng)

將25只健康雄性sD大鼠基礎(chǔ)喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為2組，分別為正常組（5只）和造模組（20只）。模型組大鼠喂每日喂養(yǎng)高脂高糖飼料（基礎(chǔ)飼料加20%的豬油、15%的蔗糖、5%的奶粉），正常組喂以基礎(chǔ)飼料。4周后，稱量體重。造模大鼠空腹腹腔注射1%的鏈脲佐菌素溶液（sTz，30mg/kg），正常組注射相同體積的檸檬酸鹽緩沖液。喂養(yǎng)2周后，在正常組和模型組中測(cè)量血糖和胰島素水平。模型組大鼠和正常組大鼠繼續(xù)喂食基礎(chǔ)飼料。將成模大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、1%鏈脲佐菌素溶液組（30mg/kg）和低（1.5mg/kg）、中（3mg/kg）、高劑量（5mg/kg）葉酸并注射1%鏈脲佐菌素溶液組（30mg/kg）組進(jìn)行干預(yù)，干預(yù)后檢測(cè)大鼠鼠尾血糖濃度。在灌胃3天后心臟無(wú)菌取血制備血清。小鼠足細(xì)胞培養(yǎng)：將完全培養(yǎng)基加入到底面積為75cm²的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。將正常組和模型組小鼠足細(xì)胞培養(yǎng)分為空白對(duì)照組（Nc）、stz高糖組（HG）、正常鼠血清對(duì)照組（NR）、和加入低劑量（LJ）、中劑量（N1））、高劑量（H1））葉酸血清組。

（二）指標(biāo)檢測(cè)

（1）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）計(jì)算確定實(shí)驗(yàn)所需的板條數(shù)量，并將其取出后再放置于框架中。設(shè)置空白孔并僅添加TMB顯色液和終止液在空白孔中。對(duì)每次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試，并繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。將不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品加入到相應(yīng)孔中，并在室溫下溫育120分鐘。將板洗滌5次并加入生物素化的抗體工作溶液。在室溫下孵育60分鐘。將板洗滌5次，加入酶結(jié)合物工作溶液，在室溫下進(jìn)行避光孵育20分鐘。將板洗滌5次，再加入顯色劑TMB100ul/孔，黑暗中溫室孵育20分鐘，加入50u1/孔的終止液，混合均勻后立刻測(cè)量0D450的值。

（2）熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)用于檢測(cè)mRNA中VEGF水平。

（3）免疫印跡法蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）分析蛋白質(zhì)中VEGF的表達(dá)水平

（三）統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。測(cè)量數(shù)據(jù)中計(jì)量資料表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，統(tǒng)計(jì)方法使用單因素方差分析和LSD檢驗(yàn)。

三、結(jié)果

（一）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）測(cè)大鼠血清VEGF水平

正常組和高糖組的細(xì)胞漿與核周均可見(jiàn)VEGF陽(yáng)性表達(dá)且表達(dá)量接近。然而，添加了低、中、高劑量的葉酸組中VEGF的表達(dá)較低。

（二）熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)mRNA中VEGF水平

添加葉酸組mRNA中VEGF表達(dá)水平較高糖組和正常鼠血清組明顯降低。（p<0.05）葉酸劑量與VEGF表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。

（三）蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）檢測(cè)蛋白質(zhì)VEGF表達(dá)水平

由表1結(jié)果可知與正常大鼠血清組相比高糖組中VEGF的表達(dá)情況明顯升高。添加不同劑量葉酸后各組大鼠VEGFmRNA表達(dá)量均有所降低。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（P<0.05）

四、討論

VEGF（血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子）是促進(jìn)血管新生的促血管生成因子。研究表明慢性高血糖癥能刺激VEGF合成和分泌，并引發(fā)一系列代謝和血液動(dòng)力學(xué)效應(yīng)，導(dǎo)致VEGF增加，并導(dǎo)致DM微血管并發(fā)癥。葉酸是一種水溶性維生素，在基因調(diào)控所需的甲基化過(guò)程中起著甲基供體的作用。Sonny Bherwani等人通過(guò)測(cè)量糖尿病腎病患者血清葉酸與尿微量白蛋白比值發(fā)現(xiàn)葉酸水平的下降與糖尿病腎病有關(guān)。葉酸的顯著降低使糖尿病腎病的機(jī)會(huì)增加19.9%。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，糖尿病腎病小鼠的足細(xì)胞VEGF表達(dá)較對(duì)照小鼠高，顯示其在DN微血管病變中的意義重大。我們?cè)陲暳现刑砑硬煌瑒┝康娜~酸，結(jié)果顯示添加葉酸的血清組小鼠足細(xì)胞VEGF在蛋白質(zhì)和mRNA中的表達(dá)均較高糖組和正常鼠血清組降低，由此說(shuō)明補(bǔ)充葉酸能夠介導(dǎo)血管內(nèi)皮因子（VEGF）水平改善糖尿病腎病大鼠足的微循環(huán)。為降低糖尿病患者的發(fā)病率和死亡率提供了新的科學(xué)參考依據(jù)。