楊 穎，王愛娜

(渭南職業(yè)技術學院，陜西 渭南 714026)

褐飛虱(Nilaparvata lugens Stal)，半翅目飛虱科屬，是農作物水稻最具破壞性的農業(yè)害蟲，主要通過直接吸食水稻韌皮部汁液傳播水稻草狀矮化病毒［1］，目前防控飛虱的主要措施仍以化學防治為主［2］，盡管利用殺蟲劑較為便捷，但也存在廣泛使用造成環(huán)境污染，飛虱抗藥性的產(chǎn)生，由于其非選擇性的滅殺對一些有益生物也是有害的，例如傳粉昆蟲和自然天敵［3］，而不加選擇性的使用殺蟲劑尤其是在作物早期，也會引起刺吸式害蟲的大爆發(fā)［4］。因此，選擇抗性靶基因，采取新的防治手段，對褐飛虱治理具有重要意義。

RNA 干擾(RNA interferenee，RNAi)作為一種重要基因沉默機制，可通過dsRNA 的介導，高效特異性降解目的基因的mRNA，抑制(Knockdown)目的基因的表達。目前利用RNAi 技術對于昆蟲的研究，主要利用注射或飼喂的方法，將dsRNA 或siRNA 導入昆蟲細胞或活體昆蟲體內從而實施干擾［5］，通過檢測靶基因的沉默效率或相應生物表型分析從而研究相應基因功能，為進一步篩選出可有效防控害蟲的基因資源提供了保障。孟山都公司Baum 等研究發(fā)現(xiàn)，利用表達玉米根葉甲VATPase 基因dsRNA 的轉基因玉米，飼喂玉米根葉甲幼蟲，幼蟲出現(xiàn)發(fā)育受阻或死亡現(xiàn)象［6］。

V-ATPases 是一類ATP 驅動的質子泵，存在于真核生物細胞質膜和細胞器內膜上，通過ATP水解產(chǎn)生的能量，將H +泵出包膜形成跨膜質子梯度，維持細胞正常生理活動，在胞內外pH 環(huán)境，離子和代謝物的轉運中發(fā)揮著重要作用［7，8］。此外V-ATPases 是由多個亞基構成的功能性復合物，該復合體包括V1 和V0 兩大結構域，位于外周的V1 由8 個亞基組成，負責催化ATP 水解，跨膜的V0 結構域由6 個亞基組成，負責質子轉移［9，10］。為利用RNAi 技術進行褐飛虱防治，本研究將褐飛虱V-ATPase D 亞基基因片段和VATPase H 亞基基因片段進行融合，獲得約800 bp的V-ATPase D-H (VAD-H)融合基因，其以反向重復方式連入經(jīng)改造含有Pdk 內含子的中間載體pUCm-T。通過重組PCR 將上述兩種基因融合后構建具有反向重復發(fā)夾結構的RNAi 表達載體，旨在為利用RNAi 技術培育雙價轉基因抗蟲水稻新種質提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 材料 本試驗飼養(yǎng)飛虱所用水稻材料為日本晴水稻，褐飛虱由本校植物抗逆研究中心提供，在光照培養(yǎng)箱內(溫度25 ±2 ℃，相對濕度70%～80%，15 h 光照/9 h 黑暗)利用水稻幼苗進行飼養(yǎng)繁育。后續(xù)生測實驗中，選取同齡期幼蟲并分成3 組每組20 只左右。

1.1.2 主要試劑 試驗所用大腸桿菌(Escherichia.coli)菌株DH5α，載體pUCm-T 均由本實驗室保存和提供。引物由擎科生物合成，RNA 抽提試劑Trizol 購自Invitrogen 公司，MEGAscriptTM T7 Transcription Kit (ambion，AM1334)轉錄試劑盒購自ThermoFisher scientific 公司，Ex Taq、內切酶和T4 ligase 購自Takara 公司，cDNA 合成和qPCR 試劑盒均購自全式金公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 V-ATPase D-V-ATPase H(VAD-H)融合基因的獲取 利用半翅目點蜂緣蝽(Riptortus pedestris)的vacuolar H+ATPase subunit 氨基酸序列(Genebank:BAN20615)，作為探針在褐飛虱數(shù)據(jù)庫中進行tBlastn 檢索，發(fā)現(xiàn)褐飛虱的V-ATPase H 亞基基因序列(GenBank:XM _022328393.1)，根據(jù)該基因不同轉錄本選其共有序列，以及褐飛虱V-ATPase D (GenBank:XM_022330230)基因的保守序列分別設計特異性擴增引物(表1)，采用重組PCR 擴增獲取V-ATPase D-V-ATPase H(簡稱VAD-H)的融合基因。以3 齡飛虱若蟲cDNA 為模板，VAD-H-α-F1 和VAD-H-α-R1 為引物，擴增獲取V-ATPase D 亞基的基因片段;以VAD-H-F2 和VAD-H-R2 為引物，擴增獲取V-ATPase H 亞基基因片段，再以PCR 擴增產(chǎn)物V-ATPase D 和V-ATPase H 亞基基因為模板，VAD-H-F1 和VAD-H-R2 為引物進行重組PCR，擴增VADH 融合基因。

圖1 hp(VAD-H)結構示意

PCR 反應體系:2 ×Prime STAR Buffer (Mg2+Plus)12.5 μl，10 mmol/L dNTP 1 μl，Prime STAR HS DNA Polymerase(2.5 U/μl)0.5 μl，10 μmol·L-1上游引物0.5 μl，10 μmol·L-1下游引物0.5 μl，模板0.5 μl，加ddH2O 至25 μl。PCR 反應:98℃變性10 s，56℃退火15 s，72℃延伸50 s，30 個循環(huán)。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收并純化后，將融合基因片段連入pMD19-T 載體，得T-VAD-H 并測序驗證。

表1 引物序列

1.2.2 dsRNA 的體外合成 上述獲得的VAD-H 融合基因，在擴增該序列所設計的特異性引物VAD-H-F1、R2 的5'端分別加上T7 啟動子序列(TAATACGACTCACTATAGGG)，以及添加T7 啟動子序列的dsGFP F 和dsGFP R(表1)，利用試劑盒MEGAscript T7 Kit (ambion，AM1334)在體外分別進行干擾片段VAD-H 的dsRNA 和dsGFP 合成。

1.2.3 體外飼喂dsRNA 通過體外飼喂法進行飛虱RNAi 研究，選TN1 水稻幼苗上的3 齡褐飛虱生測，體外實驗所用飛虱先經(jīng)過2 d 人工飼料(未加dsRNA)喂食適應再進行dsRNA 飼喂。喂食含400 ng·μL-1ds-VAD-H 的人工飼料為試驗組，添加400 ng·μL-1dsGFP 的作為對照組，每天按時更換人工飼料。褐飛虱飼喂采用雙通玻璃管，其一端用parafilm 膜密封，另一端采用雙層parafilm 膜中間添加人工飼料而成，管內接入生長發(fā)育一致的3 齡待測褐飛虱，每管接入30 頭，重復3 次，每天記錄飛虱存活率和生長發(fā)育情況。實驗在人工氣候室中進行，實驗條件:溫度27 ±1℃，濕度75 ±5%，光照周期為16 h 光照，8 h 黑暗。

1.2.4 實時定量RT-PCR 分析檢測 用Trizol提取總RNA，經(jīng)反轉錄試劑盒(TransScript One-step cDNA Synthesis SuperMix)合成cDNA。將合成的第一鏈cDNA 稀釋10 倍后作為模板，進行定量檢測，所用引物為如表2 所示。qPCR 反應體系為20 μL:2 ×TransStart Tip Green qPCR Super-Mix 10 μL，F(xiàn)orward Primer(10 μmol·L-1)0.4 μL，Reverse Primer(10 μmol·L-1)0.4 μL，cDNA模板(20 ng·μL-1)1 μL，ddH2O 8.2 μL。qPCR反應程序為:94℃30 s;94℃5 s，60℃30 s，40 個循環(huán)。Real-Time qPCR 所用的儀器為ABI Prism 7300，選用揭飛虱β-actin 基因(GenBank:EUl79846)作為內參，基因相對表迖量計算采用Livak 和Schmittgen［11］的方法。

2 結果與分析

2.1 重組PCR 擴增獲取VAD-H 融合基因

以3 齡飛虱若蟲cDNA 為模板，VAD-H-F1 和VAD-H-R1 為引物，擴增獲取了約400 bp 的V-ATPase D 亞基基因片段。以VAD-H-F2 和VAD-H-R2 為引物，擴增獲取400 bp的V-ATPase H 亞基基因片段。再以PCR 擴增產(chǎn)物V-ATPase D 和V-ATPase H 亞基基因為模板，VAD-H-F1 和VAD-H-R2 為引物進行重組PCR，擴增獲得約800 bp 的VAD-H 融合基因片段(圖2)。將融合基因片段連入pMD19-T載體，經(jīng)測序驗證，所得序列為基因重組序列(圖2)。

圖2 VAD-H 融合基因片段的PCR 擴增

2.2 pUCm-hp(VAD-H)重組載體構建

為獲取發(fā)夾結構的RNAi 載體，利用經(jīng)改造含有Pdk 內含子的中間載體pUCm-T 構建干擾片段的發(fā)夾結構。采用限制性內切酶Sac I 和Kpn I 對T-VAD-H 質粒進行酶切，獲得大小為800 bp 的融合基因片段VAD-H，酶切片段回收后連入經(jīng)Sac I/Kpn I 酶切的pUCm-T 載體，獲得pUCm-T-VAD-H-Intron 重組載體。再用Sal I 和Xho I 對重組載體T-VAD-H 進行酶切，酶切片段回收后連入經(jīng)Sal I/Xho I 酶切的重組載體pUCm-T-VAD-H-Intron，獲取含有發(fā)夾結構的pUCm-hp(VAD-H)重組載體(圖3)。

圖3 pUCm-hp(VAD-H)載體結構示意圖

2.3 體外喂食dsRNA 后褐飛虱的存活率

選取生長發(fā)育一致的3 齡飛虱若蟲，用人工飼料飼喂2 d 后再用于dsRNA 飼喂試驗，持續(xù)8 d后各處理存活的若蟲均羽化變?yōu)槌上x。測試用融合基因VAD-H 的dsRNA 通過體外合成，添加到人工飼料中濃度為0.4 μg·μl-1，與對照組進行比較，從第2 天開始處理組飛虱存活率便出現(xiàn)降低，當飼喂至第8 天時VAD-H 干擾組存活率僅為48.3%，并且VAD-H 干擾組與對照組差異顯著(圖4)

圖4 飼喂dsRNA 后褐飛虱的存活率

2.4 體外喂食dsRNA 后對飛虱靶基因影響

為檢測飛虱取食dsRNA 后對其體內靶標基因mRNA 的影響，利用熒光定量PCR 對靶基因的轉錄水平進行測定，實驗所用飛虱為上述喂食添加dsGFP 的對照組和添加dsRNA 試驗組，4 到8天后選取生長發(fā)育一致的褐飛虱，分別抽提RNA反轉錄為cDNA 后，用qRT-PCR 檢測褐飛虱體內靶基因的相對表達量。

持續(xù)飼喂dsRNA 4 d、6 d 至8 d 后，褐飛風體內靶標mRNA 水平均發(fā)生不同程度的降低，降低水平隨著飼喂時間的延長而升高。如圖5 靶基因的轉錄水平從第4 天開始降低，飼喂至第八天飛虱靶基因V-ATPase D 轉錄水平降低了47.6%，靶基因V-ATPase H 的轉錄水平降低了29.7%(圖5)。

圖5 飼喂dsRNA 后褐飛虱靶基因表達量(*，P ＜0.05;＊＊，P ＜0.01.)

3 討論

目前利用RNAi 進行昆蟲功能基因的研究主要通過注射法和飼喂法。Liu 等利用顯微注射向褐飛虱體內注射組成型表達的鈣網(wǎng)蛋白(Calr)和腸道特異蛋白(Ctsb)基因的dsRNA［12］，注射后第4 天兩種基因表達水平均降低了40%左右。Chen等利用添加靶基因海藻糖磷酸合酶(NlTPS)dsRNA 的人工飼料飼喂褐飛虱［13］，使該基因在mRNA 水平和酶活性顯著降低，此外隨著飼喂時間延長褐飛虱發(fā)育水平也受到影響，甚至出現(xiàn)死亡。上述研究表明dsRNA 進入褐飛虱體內后能夠特異性地沉默相關靶基因，由于注射法對飛虱、蚜蟲等體型較小的昆蟲易造成機械損傷，死亡率較高，因此本實驗采用人工飼料喂食法。

筆者研究將褐飛虱V-ATPase D 亞基基因片段和V-ATPase H 亞基基因片段進行融合，獲得約800 bp 的融合基因，構建針對該融合基因的RNAi 干擾載體。相比于之前有關RNAi 抗蟲研究，只針對單個目的基因，本實驗通過基因融合形成新的干擾基因片段，同時構建了雙價干擾載體。褐飛虱取食添加有融合基因VAD-H dsRNA 的人工飼料，飼喂8 天后褐飛虱死亡率為51.7%，與對照相比差異顯著(圖3)，此外我們對取食dsRNA的褐飛虱靶標基因轉錄水平，進行熒光定量PCR，結果表明實驗組體內相關基因表達量與對照相比顯著下降(圖5)，表明攝入體外表達的融合基因dsRNA，能夠引發(fā)褐飛虱體內RNAi 效應。

由于人工飼料飼喂時添加dsRNA 的濃度與蟲體RNAi 呈劑量效應，因此當外界不能持續(xù)提供dsRNA 時，干擾效果會受到限制。因此本研究后面將通過構建RNAi 植物表達載體，獲取體外穩(wěn)定表達dsRNA 的植株，進一步驗證轉基因植物抗飛虱方面作用。