熊 煒 ,蔡一村 ,王楷宬 ,張 強 ,黃保續(xù) ,田楨干 ,林穎崢,李 健

(1.上海市檢驗檢疫科學技術研究院,上海浦東200135 ;2.中國動物衛(wèi)生與流行病學中心,山東青島 266032)

犬冠狀病毒(Canine coronavirus,CCV)是一種以胃腸炎為主要癥狀的高度接觸性傳染病,臨床上以犬嚴重脫水、嘔吐、腹瀉和血便為主要特征,致死率較低,但與其他傳染病混合感染時,死亡率提高,對幼犬危害嚴重,是養(yǎng)犬業(yè)危害較大的疫病之一[1-4]。CCV 為代表的冠狀病毒極易變異,導致冠狀病毒血清型眾多,且新的血清型還在不斷出現(xiàn),如嚴重急性呼吸綜合征(Severe acute respiratory syndrome,SARS)的病原就是一種新型冠狀病毒。由于寵物飼養(yǎng)者數(shù)量日益增多,犬的健康與否與人類健康密切相關,因此,研制犬冠狀病毒快速檢測技術、縮短檢測周期,對控制犬冠狀病毒的傳播具有重要的意義[5-6]。除病毒分離、電鏡檢測、ELISA 等方法外,反轉錄聚合酶鏈式反應(RTPCR)方法是目前檢測CCV 最常用的方法,此外還有膠體金、實時熒光RT-PCR 等多種檢測方法[7-9]。實時熒光重組酶聚合酶擴增(real-time recombinase Polymerase Amplification assay,real-time RPA)是一種新型的、可以替代傳統(tǒng)PCR 檢測技術的核酸快速檢測方法,它能夠在20 min 內完成常溫下核酸的擴增和檢測,檢測設備小巧、便攜,特別適合野外及檢疫現(xiàn)場使用。本研究建立了實時熒光RPA 檢測CCV 的方法,并對方法的特異性、敏感性和穩(wěn)定性進行了驗證。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 TRIzol 購自Invitrogen 公司;Taq酶、AMV 逆轉錄酶、RNA 酶抑制劑、dNTP、隨機引物、DNA Marker(DL-2 000),購自TaKaRa 公司;RPA 檢測試劑購自英國TwistDx Inc 公司;DNA 抽提試劑盒(QIAamp DNA Blood Mini Kits)購自QIAGEN 公司;磷酸鹽緩沖液(PBS,pH 值7.4)購自Gibico 公司;其他試劑購自國藥集團上?；瘜W試劑有限公司。

1.2 病毒樣品來源及處理 CCV 病毒、陽性核酸和組織病料為本室保存,來自上?？诎度刖车膶櫸锛吧虾５貐^(qū)寵物醫(yī)院的病犬,組織病料包括病犬的血液、尿液、糞便等,及病死犬的肝、脾、肺、腸等組織。本研究使用的其他病毒,如犬瘟熱病毒(CDV)、犬細小病毒(CPV)、犬副流感病毒(CPIV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、貓傳染性腹膜炎病毒(FIPV)、小鼠肝炎病毒(MHV)等均由本室保存。將待檢組織或糞便樣品加等體積PBS 研磨勻漿,3 000 g 離心15 min,收集上清液待檢。

1.3 核酸抽提及cDNA 模板制備 取100 μL 待檢上清液或血清,加1 mL TRIzol 試劑進行RNA 提取;加30 μL DEPC 水溶解RNA 沉淀。取11 μL RNA溶液,加5 倍逆轉錄酶濃縮緩沖液4 μL、dNTP 1 μL、隨機引物1 μL、RNA 酶抑制劑1 μL、AMV 逆轉錄酶2 μL,置PCR 儀上42 ℃反應60 min,即得cDNA 模板。取100 μL 上清液或體液樣本用DNA抽提試劑盒說明書進行病毒DNA 提取,最后將DNA 用50 μL 水溶解。

1.4 PCR 檢測 引物針對CCV 核衣殼蛋白(Nucleocapsid)基因設計,擴增基因片段大小為461 bp,其上游引物(CCVF)序列為:5′-CTA AGA CAA GAG ACA CTA CAC C-3′,下游引物(CCVR)序列為:5′-CTC AAC CTG TGT GTC ATC AAA C-3′。在PCR 薄壁管中,加cDNA 或DNA 模板1 μL、10 倍Taq酶濃縮緩沖液2.5 μL、dNTP 0.5 μL、上下游引物各0.25 μL、Taq 酶0.25 μL,加水補足總體積至25 μL。將PCR管置PCR 儀上,按如下程序擴增:首先94 ℃3 min;然后94 ℃15 s,56 ℃15 s,72 ℃30 s,35 個循環(huán);最后72 ℃3 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后,用凝膠成像系統(tǒng)拍攝。

1.5 熒光RPA 引物和探針設計 使用Vector NTI Suite 軟件分析不同國家和地區(qū)分離的CCV 核蛋白(nucleoprotein)編碼基因的保守序列,用Primer Express 軟件設計RPA 引物和探針。實時熒光RPA 檢測的上游引物(RPAY-CCVF)序列為:5′-CTG GAA GAG AAC TGC AGG TAA AGG TGA TGT GAC-3′,下游引物(RPAY-CCVR) 序列為:5′-TCG CCA TCT TCC TTT GCA GTC CAA TAG CTT CC-3′,RPA 探針(RPAY-CCVP)序列為:5′-CAT TAC CCA CAA CTG GCT GAA TGT GTT CCA TCT G(FAM-dt)(THF)(BHQ1-dt)TAG CAT TCT G-C-3′。引物和探針由上海輝睿生物科技有限公司合成。

1.6 實時熒光RPA 檢測 采用GENIE Ⅱ恒溫擴增PCR 儀。反應體系為:25 μL 2 倍反應緩沖液、7.2 μL dNTP、5 μL 10 倍探針酶混合物、上下游引物(RPAYCCVF、RPAY-CCVR)各2.1 μL、10 μmol/L 熒光探針0.6 μL;混勻后,再加入2.5 μL 20 倍核心反應液、1 μL 50 倍RT 反應液、1 μL 50 倍Exo 反應液;混勻后,最后加入2.5 μL 280 mmol/L 醋酸鎂、1 μL待檢核酸溶液。反應條件為:39 ℃孵育25 min。反應結束后,查看熒光擴增曲線進行結果判定。

2 結果

2.1 實時熒光RPA 檢測CCV 的特異性試驗 分析CCV 核蛋白基因序列,設計引物及探針,建立實時熒光RPA 檢測CCV 方法,并分別使用其他犬病毒(如:CDV、CPV、CPIV)和其他物種的冠狀病毒(如:TGEV、FIPV、MHV)作為對照,確認所建立方法的特異性。結果顯示,經(jīng)實時熒光RPA 檢測,CCV 陽性樣品在反應7 min 后熒光信號出現(xiàn)顯著增強,其他病毒未檢測到熒光信號(見中插彩版圖1)。

圖1 實時熒光RPA 檢測CCV 的特異性

2.2 實時熒光RPA 檢測CCV 的敏感性試驗 為測試建立的實時熒光RPA 方法的敏感性,將CCV陽性樣品cDNA 進行定量并梯度稀釋,制備濃度分別為1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL、1 fg/μL 的模板,再分別用實時熒光RPA 和PCR 方法檢測。結果顯示,RPA 檢測CCV cDNA 模板的下限量為100 fg,與之對應PCR檢測CCV cDNA 模板的下限量為1 pg(見中插彩版圖2 及圖3)。

圖2 實時熒光RPA 檢測CCV 的敏感性

2.3 實時熒光RPA 檢測CCV 感染犬的臨床樣本為了進一步驗證建立的實時熒光RPA 方法的可靠性,將其應用于CCV 病死犬的組織器官及血液、尿液和糞便等易于采集的體表樣本以及30 份CCV陰性犬糞便樣本的檢測。結果顯示,經(jīng)實時熒光RPA 檢測,4 份CCV 病死犬的組織樣品(小腸、肝、肺、脾等)和3 份CCV 感染犬的體表樣本(血液、尿液和糞便)均可檢測到熒光信號的顯著擴增,而空白對照和所有CCV 陰性樣品均未檢測到熒光信號(見中插彩版圖4);使用傳統(tǒng)的RT-PCR 方法,對所有臨床樣本進行復檢,其檢測結果與實時熒光RPA一致,符合率為100%(圖5)。

圖3 RT-PCR 檢測CCV 的敏感性試

圖4 實時熒光RPA 檢測CCV 陽性犬的臨床樣本

圖5 RT-PCR 檢測CCV 陽性犬的臨床樣本

圖6 實時熒光RPA 檢測不同地區(qū)犬中分離到的CCV 陽性樣本

2.4 實時熒光RPA 檢測不同地區(qū)犬中分離到的CCV 陽性樣本 用建立的實時熒光RPA 方法檢測本室于2007 年至2015 年從口岸入境犬中分離到的6 份CCV 陽性樣本,這其中2 份來自日本入境犬(CCV-JP1、CCV-JP2)、2 份來自澳大利亞入境犬(CCV-AU1、CCV-AU2)、2 份來自俄羅斯入境犬(CCV-RU1、CCV-RU2)。結果顯示,6 份CCV 陽性樣本經(jīng)實時熒光RPA 檢測均出現(xiàn)了熒光信號的顯著擴增,而空白對照未檢測到熒光信號(見中插彩版圖6);經(jīng)RT-PCR 復測,這6 份樣本均擴增出了目的大小的基因片段(圖7)。

圖7 RT-PCR 檢測不同地區(qū)犬中分離到的CCV 陽性樣本

3 討論

CCV 屬于套氏病毒目(Nidovirales)、冠狀病毒科(Coronaviridae)、冠狀病毒屬(Coronavirus)I 群病毒,其基因組為不分節(jié)段單正鏈RNA,大小在27～32 kb 之間,是所有RNA 病毒中最大的。CCV 是的一種重要的感染犬的病毒,其發(fā)病率高,通常與多種犬病并發(fā),具有一定的致死性,對犬養(yǎng)殖業(yè)危害嚴重,是我國出入境口岸寵物及野生動物檢疫監(jiān)測的重要對象。為適應口岸對進出境寵物快速檢疫的需要,本研究建立了實時熒光RPA 快速檢測CCV的方法。該方法具有良好的特異性,其與對照犬病毒(如:CDV、CPV、CPIV)和TGEV、FIPV、MHV 等同屬的冠狀病毒均未出現(xiàn)交叉反應。通過與RT-PCR方法的比對檢測,證實本研究建立的實時熒光RPA方法的敏感性比傳統(tǒng)RT-PCR 方法高了一個數(shù)量級。通過與RT-PCR 對比檢測CCV 臨床組織樣本(如:肝、脾、肺、小腸)、易于采集的體表樣本(如:血液、尿、糞便),以及30 份CCV 陰性樣品,證實本研究建立的實時熒光RPA 方法具有與RT-PCR 一致的穩(wěn)定性和可靠性,未出現(xiàn)陽性樣品的漏檢以及陰性樣品的誤檢出;將該方法應用于復檢不同時期從不同國家地區(qū)分離到的6 份CCV 陽性樣本也均得到了陽性結果。另外,CCV 感染犬糞便的熒光信號峰值較血液和尿液均高,也更易于采集,是良好的篩查CCV 的樣本。與傳統(tǒng)PCR 方法相比,本研究建立的實時熒光RPA 檢測方法的優(yōu)勢在于其檢測周期極短(包括結果判讀在內,僅需10 -20 min)、操作簡單(只需將核酸與檢測體系混合放于恒溫設備中即可,RNA 檢測不需逆轉錄過程)、檢測設備便攜(筆記本大小,一次充電可運行12 h)、結果判定簡便直觀,特別適合于現(xiàn)場及野外使用。本研究建立的熒光RPA 檢測CCV 的新方法,不僅可應用于出入境口岸寵物及野生動物的檢疫,同時也特別適合野外監(jiān)測點、犬貓科動物繁育場和一線獸醫(yī)檢測實驗室的使用,這對控制CCV 的傳播,減少特種動物養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟損失,以及提升動物和公眾的健康都具有重要的意義。