(河北科技師范學(xué)院動物科技學(xué)院 河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點實驗室,河北秦皇島 066604)

肺炎克雷伯菌是腸桿菌科克雷伯菌屬的一種革蘭陰性桿菌,該菌無鞭毛,無動力,有較厚的莢膜,個別菌株具有菌毛結(jié)構(gòu),主要存在人和多種動物腸道、呼吸道、泌尿生殖道內(nèi),為臨床中典型的人獸共患條件性致病菌[1-2]。肺炎克雷伯菌屬包括肺炎克雷伯肺炎亞種、臭鼻亞種及鼻硬結(jié)亞種3 個亞種,其中肺炎克雷伯肺炎亞種分布最為廣泛,是引發(fā)雞、鴨、山羊、梅花鹿、牛等多種動物及人肺炎、腹瀉、泌尿道、膽道感染、敗血癥和化膿性腦膜炎等嚴(yán)重疾病的病原菌之一[3-4]。當(dāng)雞感染肺炎克雷伯菌后,可以引起雞的傷口感染、肺炎、肝膿腫、眼內(nèi)炎甚至全身敗血癥等,對不同日齡的雞均易感,尤其是雛雞的發(fā)病率與死亡率都較高[5-6]。肺炎克雷伯菌可能對養(yǎng)業(yè)雞具有潛在威脅,應(yīng)引起重視。國內(nèi)關(guān)于雞源肺炎克雷伯菌報道較少。本試驗從發(fā)病致死的雛雞體內(nèi)分離1 株肺炎克雷伯菌,并對該菌的16S rRNA 基因序列進(jìn)行同源性,致病性檢測及耐藥性分析,為臨床中該菌的防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來源 秦皇島地區(qū)某雞場9 日齡病死的雛雞,無菌采集發(fā)病致死雛雞的肝臟、心血等病料組織。

1.2 主要試劑與儀器MIAC 培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯,購自北京陸橋生物技術(shù)股份有限公司;革蘭染色液試劑盒,購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司;藥敏紙片,購自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司;ID32E 腸桿科菌鑒定試紙條,購自Bio-Merieuxsa 公司;DL-2 000 Marker,購自北京中生瑞泰科技有限公司;2 ×TaqMarker Mix,購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;7%脫纖綿羊血培養(yǎng)基由本實驗自制;梯度PCR 由儀德國Eppendorf 公司生產(chǎn);隔水式恒溫培養(yǎng)箱,購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司;ATB 自動化微生物生化鑒定系統(tǒng)由法國生物梅里埃股份有限公司生產(chǎn)。

1.3 試驗動物 健康9 日齡海蘭褐雛雞10 只,購自秦皇島市金牧種雞場。

1.4 細(xì)菌分離培養(yǎng)與鑒定 無菌采集病死雛雞肝臟、心血等病料組織劃線接種于7%綿羊脫纖血培養(yǎng)基,37 ℃恒溫培養(yǎng)12 -18 h,挑取優(yōu)勢單個菌落接種于MIAC 鑒別培養(yǎng)基上37 ℃恒溫培養(yǎng)12 -18 h。挑取單個菌落落接種于營養(yǎng)肉湯中進(jìn)行純化培養(yǎng),革蘭染色后在顯微鏡下觀察分離菌株形態(tài)。

1.5 生化試驗鑒定 取純化培養(yǎng)的分離菌調(diào)整菌液濃度為0.5 個麥?zhǔn)蠞岫?按照說明書,將分離菌株接種于ID32E 腸桿科菌鑒定試紙條中,37 ℃恒溫過夜培養(yǎng)12 -24 h,用ATB 自動化微生物生化鑒定系統(tǒng)進(jìn)行生化特性鑒定。

1.6 細(xì)菌的16S rRNA PCR 鑒定及測序分析 用水煮法提取分離菌株的基因組DNA,用細(xì)菌通用引物16S rRNA 基因序列進(jìn)行檢測。細(xì)菌通用16S rRNA 基因序列引物5′-CCGTCTTCAGTTCCAGTGTG-3′/5′-GTGGCGGACGGGTGAGTAA-3′由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為50 μL:2 ×TaqMix 25 μL,上、下游引物各2 μL,DNA 模板3 μL,ddH2O 18 μL。反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性50 s,58 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,30 個循環(huán),72 ℃延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測分離菌株的目的條帶,將PCR 產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行序列測定,測序結(jié)果與Gen-Bank 數(shù)據(jù)庫中登錄基因序列進(jìn)行對比分析,構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,分析其同源性。

1.7 致病性試驗 將10 只9 日齡健康雛雞分為2組,每組5 只,試驗組每只雛雞腹腔注射0.25 mL(108CFU/mL),對照組每只雛雞給予等量的生理鹽水,攻毒12 h 后,觀察7 d,記錄每組的發(fā)病情況和死亡情況。

1.8 藥敏試驗 參照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)推薦的標(biāo)準(zhǔn)K-B 紙片法進(jìn)行試驗操作和結(jié)果判斷。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng) 分離菌株在7%脫纖綿羊血培養(yǎng)基上長出扁平、圓形、灰白色的半透明菌落(見中插彩版圖1);在鑒別MIAC 培養(yǎng)基上為圓形、光滑、大小一致的桃紅色菌落(見中插彩版圖2);革蘭染色鏡檢為兩端鈍圓粗短桿菌狀的陰性菌(見中插彩版圖3)。

圖1 7%脫纖綿羊血培養(yǎng)基上的菌落

圖2 MIAC 培養(yǎng)基上的菌落

圖3 革蘭染色結(jié)果 (1 000 ×)

2.2 生化鑒定結(jié)果 分離菌株甲基紅試驗、V-P 試驗均呈陽性;不產(chǎn)生H2S;L-阿拉伯醇、精氨酸雙水解酶、鳥氨酸脫羧酶、接觸酶、尿素酶為陰性;不發(fā)酵D-麥芽糖、D-葡萄糖、D-纖維二糖、D-海藻糖、L-阿拉伯糖、D-甘露醇、D-山梨醇、L-鼠李糖等;用ATB自動化微生物生化鑒定系統(tǒng)鑒定為肺炎克雷伯菌,評定結(jié)果合格率為99.9%。

2.3 細(xì)菌的16S rRNA 測序結(jié)果與系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 分離菌株用細(xì)菌的16S rRNA 的通用引物,擴(kuò)增出1 492 bp 的目的條帶(圖4);其測序結(jié)果與GenBank 登錄的肺炎克雷伯菌參考株基因序列同源性在98%～99%之間,從而證實了分離菌株為肺炎克雷伯菌;系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果表明:分離菌株HB-3 與肺炎克雷伯桿菌參考株KP262416.1 聚于一支,與KJ803938.1 聚于一大支,本試驗分離的肺炎克雷伯菌HB-3 株與肺炎克雷伯菌參考株KP262416.1 和KJ803938.1 存在密切的遺傳進(jìn)化關(guān)系(圖5)。

2.4 致病性試驗結(jié)果 試驗組雛雞攻毒12 -48 h 后,雛雞死亡2 只,至96 h 雛雞全部死亡。剖檢死亡雛雞,無菌采集發(fā)病致死雛雞的肝臟、心血等病料組織,從中分離到了肺炎克雷伯菌,對照組的雛雞無明顯癥狀。表明了從病死雛雞的體內(nèi)分離到的肺炎克雷伯菌具有很強(qiáng)的致病性。

2.5 藥敏試驗 結(jié)果見表1,分離菌株對頭孢曲松、頭孢克肟、頭孢拉啶、恩諾沙星4 種藥物敏感;對環(huán)丙沙星、新霉素、丁胺卡那霉素、氟苯尼考、大觀霉素、林可霉素6 種藥物中敏;對氨芐西林、阿莫西林、青霉素、慶大霉素、多西環(huán)素、多粘菌素6 種藥物耐藥。

圖4 分離菌株16S rRNA PCR 擴(kuò)增結(jié)果

圖5 分離菌株16S rRNA 基因序列進(jìn)化樹發(fā)育樹

表1 藥敏試驗結(jié)果

3 討論

肺炎克雷伯菌是一種重要的人獸共患病原菌,該菌在臨床中的感染率僅次于大腸桿菌和綠膿桿菌,廣泛存在于人和動物的腸道、呼吸道和泌尿生殖道及水、土壤等環(huán)境中的一種常見條件性致病菌,呈世界性分布,該菌可以導(dǎo)致動物體內(nèi)的菌群失調(diào),引起不同種類的動物感染發(fā)病,嚴(yán)重者造成死亡[7-8]。本試驗從發(fā)病致死的雛雞體內(nèi)分離到了1 株致病性性肺炎克雷伯菌,該菌的16S rRNA 基因序列與GenBank 登錄的12 株肺炎克雷伯菌參考株同源性在98%～99%之間,與肺炎克雷伯桿菌參考株KP262416.1 聚于一支,與KJ803938.1 聚于一大支,且2 株參考株存在密切的遺傳進(jìn)化關(guān)系。該菌的遺傳進(jìn)化是否與其他宿主源及人的肺炎克雷伯菌存在遺傳進(jìn)化有待進(jìn)一步研究。賈艷等[9]報道了從病死雞體內(nèi)分離5 株雞源肺炎克雷伯菌,該菌對小鼠具有很強(qiáng)的致病性。金天明[10]報道了從死亡的肉雛雞體內(nèi)分離到肺炎克雷伯菌是致病性肺炎克雷伯菌。當(dāng)外界條件改變時,如飼養(yǎng)密度過大、氣候驟變、衛(wèi)生條件差等應(yīng)激因素存在時,常常引發(fā)該病的暴發(fā)與流行[6]。因此,在雛雞養(yǎng)殖的過程中應(yīng)引起重視,加強(qiáng)飼養(yǎng)管理,減少環(huán)境中的應(yīng)激。

目前,對細(xì)菌性疾病主要依靠抗菌藥物進(jìn)行控制,由于不合理的使用,導(dǎo)致了病原菌對藥物耐藥性的產(chǎn)生與擴(kuò)散,多重耐藥菌株出現(xiàn)的越來越多,降低了治療效果,其中肺炎克雷伯菌對抗菌藥物產(chǎn)生很強(qiáng)的耐藥性[11]。本試驗藥敏試驗表明,分離菌株對頭孢曲松、頭孢克肟、頭孢拉啶、恩諾沙星4 種藥物敏感;對環(huán)丙沙星、新霉素、丁胺卡那霉素、氟苯尼考、大觀霉素、林可霉素6 種藥物中敏;對氨芐西林、阿莫西林、青霉素、慶大霉素、多西環(huán)素、多粘菌素6 種藥物耐藥。因此,在養(yǎng)殖過程中,當(dāng)雞發(fā)生肺炎克雷伯菌病時,應(yīng)進(jìn)行藥敏試驗分析其耐藥性,合理使用藥物,減少耐藥性產(chǎn)生,提高治療療效。