馬凌云，王 月，蔡芳芳，張詩雨，羅培宇，楊勁峰，韓曉日

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)土地與環(huán)境學(xué)院/土壤肥料資源高效利用國家工程實驗室/農(nóng)業(yè)部東北玉米營養(yǎng)與施肥科學(xué)觀測實驗站，遼寧沈陽 110866）

硝化作用是土壤氮素轉(zhuǎn)化的主要途徑之一，由氨氧化 (NH3氧化成NO2-) 和亞硝酸氧化 (NO2-氧化成NO3-) 兩個步驟組成，其中氨氧化過程是關(guān)鍵的限速步驟[1]，會影響土壤氮的利用效率與損失，對土壤氮循環(huán)起著重要作用。長久以來一直認(rèn)為只有氨氧化細(xì)菌 (ammonia oxidation bacteria，AOB) 是氨氧化過程的主導(dǎo)者，直至氨氧化古菌 (ammonia oxidation archaea，AOA) 被發(fā)現(xiàn)[1]，并被證實在一些土壤中AOA的數(shù)量和分布均較AOB更豐富，在硝化作用中起主導(dǎo)作用[2-3]。國內(nèi)外眾多學(xué)者在多種土壤上就施肥對氨氧化微生物的影響進(jìn)行了深入、系統(tǒng)的研究。大量研究表明，不同的土壤和施肥條件對土壤氨氧化過程影響不同，目前較為一致的觀點是土壤pH、氨濃度、有機(jī)質(zhì)等是影響土壤氨氧化微生物的主要因子。

然而近年來，隨著氯化銨和氯化鉀等含氯化肥的廣泛施用，使大量的伴隨離子—氯離子 (Cl-) 進(jìn)入農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)，參與了土壤和植物營養(yǎng)體系的物質(zhì)循環(huán)。盡管Cl-極易隨水流失，在土壤中的總殘留率極低，但長期積累還是使施氯處理土壤Cl-含量顯著增加[4-5]。一些研究認(rèn)為，長期施用含氯化肥改變了土壤的理化性質(zhì)、微生物活性和多樣性[4，6-8]。有研究表明，含氯化肥對硝化作用有抑制作用[9]，但長期施用含氯化肥對硝化作用影響的報道較少。盧紅霞[10]通過土培試驗研究了不同濃度Cl-對濱海鹽土、潮土、紅壤中氮轉(zhuǎn)化、土壤微生物數(shù)量的影響，結(jié)果表明凡施氯的處理亞硝酸細(xì)菌數(shù)量均明顯減少。辜運富等[11]研究認(rèn)為，施用KCl降低了土壤中硝化細(xì)菌的種群豐富度，可能是由于Cl-對硝化細(xì)菌形成毒害作用所致。秦子嫻等[7]研究也表明，在中性紫色水稻土上經(jīng)過21年施用含氯化肥，氨氧化潛勢顯著低于CK，認(rèn)為可能是由于該處理pH顯著降低而不適合AOB的生長，抑或是Cl-本身對AOB產(chǎn)生抑制作用所致。以上研究只是關(guān)注了AOB，而未對在硝化過程中起重要作用的AOA進(jìn)行研究。Zhou等[8]在紫色土上研究結(jié)果顯示，與其他處理相比，長期施用含氯化肥+有機(jī)肥的處理具有更顯著的AOA群落結(jié)構(gòu)和豐富的多樣性，但該處理氨氧化潛勢最低，認(rèn)為在紫色土中pH在控制AOA群落結(jié)構(gòu)和氨氧化活性中起重要作用?？梢姾然蕦ο趸饔玫囊种茩C(jī)理并不明確，在特定條件下，研究在硝化作用中起關(guān)鍵作用的AOB和AOA對長期施用含氯化肥的響應(yīng)，可從微生物角度揭示含氯化肥抑制硝化作用的機(jī)理。

棕壤是遼寧省的主要耕作土壤之一，面積約7000多萬畝，占全省耕作總面積的36.32%，是糧食的主產(chǎn)區(qū)。目前，關(guān)于長期施用含氯化肥對棕壤中氨氧化微生物影響的報道較少。本研究以沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)棕壤含氯化肥長期定位試驗 (始于1984年) 為基礎(chǔ)，研究長期施用高氯和低氯化肥對棕壤AOA、AOB豐度以及氨氧化活性的影響，通過分析土壤基本性質(zhì)、氨氧化活性和AOA、AOB豐度的相關(guān)性，探究影響棕壤AOA、AOB豐度的環(huán)境因子，以進(jìn)一步認(rèn)識施用含氯化肥對土壤硝化過程的影響及其機(jī)制，為含氯化肥的合理施用及氮素調(diào)控提供指導(dǎo)依據(jù)，確保農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

本研究土壤樣品采自沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)棕壤含氯化肥長期定位試驗地 (40°48′N、123°33′E)，為黃土性母質(zhì)上發(fā)育的棕壤。該地屬于溫帶濕潤-半濕潤季風(fēng)氣候，年平均氣溫7～8.1℃，年降雨量為574～684 mm。該試驗始于1984年，開始供試作物為玉米-玉米-大豆輪作，自2009年開始改為玉米-花生輪作，一年一季。共設(shè)置8個處理：T1 (不施肥)；T2(單施尿素)；T3 (尿素 + 氯化鉀)；T4 (尿素 + 過磷酸鈣)；T5 (尿素 + 過磷酸鈣 + 氯化鉀)；T6 (尿素 + 磷酸一銨 + 氯化鉀)；T7 (尿素 + 氯磷銨 + 氯化鉀)；T8(硝酸磷肥 + 過磷酸鈣 + 氯化鉀)。除CK外，各處理施用等量氮、磷、鉀，其中T1、T2、T4為不施氯處理，T3、T5、T6、T8為低氯處理，T7為高氯處理。氮、磷、鉀肥混合均勻，均做基肥一次施入。微區(qū)面積為2 m2，每個處理重復(fù)3次，完全隨機(jī)區(qū)組排列。2009年后各處理具體施肥量如表1。

1.2 土壤樣品的采集與處理

2017年種植花生，品種為 ‘花育20'；2018種植玉米，品種為 ‘東單6531'。于2018年4月種植前采集0—20 cm土壤樣品。每個小區(qū)“S”形取5點土樣均勻混合后，裝入無菌塑料袋內(nèi)用冰盒保持低溫帶回實驗室，同時用鋁盒采集土樣進(jìn)行含水量測定。將土樣去除植物殘體等雜質(zhì)后過2 mm篩，分成三部分：一部分置于-80℃冰箱，用于DNA提取及后續(xù)氨氧化微生物豐度測定；一部分于4℃冰箱保存，并盡快測定銨態(tài)氮 (NH4+-N)、硝態(tài)氮 (NO3

表 1 2009年后種植玉米/花生年份各處理肥料施用量Table 1 Application rates of fertilizers in maize/peanut of each treatment after 2009 (kg/hm2)

--N)含量及土壤硝化潛勢；其余樣品風(fēng)干，用于測定土壤氯離子 (Cl-) 含量及其他基本化學(xué)性質(zhì)。

1.3 試驗方法

土壤pH的測定以水土比2.5∶1浸提，用pH計(上海雷磁，PHS-3C)進(jìn)行測定。

土壤中氯離子含量采用莫爾法測定。土壤中NH4+-N、NO3--N用0.01 mol/L氯化鈣 (液土比 = 10∶1)浸提后，用AA3多通道流動分析儀(德國SEAL，AutoAnalyzer3)測定。其他基本化學(xué)性質(zhì)按照常規(guī)方法[12]進(jìn)行測定。土壤硝化潛勢的測定采用氯酸鹽抑制法[13]：以水土比4∶1向5 g土壤中加入含1 mmol /L(NH4)2SO4的磷酸鹽緩沖液(NaCl 8.0 g/L，KCl 0.2 g/L，Na2HPO40.2 g/L，NaH2PO40.2 g/L；pH 值7.4)，并加入10 mmol/L KClO3溶液抑制亞硝酸鹽的氧化。土樣于25℃黑暗培養(yǎng)24 h后加入5 mL 2 mol/L KCl 溶液浸提NO2--N。NO2

-以 N-(1-萘基)-乙二胺顯色，在540 nm波長下測定。硝化潛勢用單位時間內(nèi)單位土壤產(chǎn)生的NO2--N表示。

土壤總DNA提?。翰捎肈neasy PowerSoil土壤微生物DNA提取試劑盒 (QIAGEN GmbH，Germany)提取，所得DNA樣品于-20℃冰箱中保存待用。

氨氧化細(xì)菌和氨氧化古菌豐度分析[14]：以氨氧化細(xì)菌 (AOB)amoA基因和氨氧化古菌 (AOA) archamoA基因的拷貝數(shù)分別表示AOB和AOA的豐度。利用實時熒光定量PCR (Real-time PCR)技術(shù)檢測amoA和arch-amoA基因拷貝數(shù)，每個樣品重復(fù)3次。AOB的引物為amoA-1F (5′-GGGGTTTCTACTGGTGGT-3′) 和 amoA-2R (5′-CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC-3′)，反應(yīng)程序為預(yù)變性95℃ 30 s，94℃變性10 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環(huán)；AOA的引物為arch-amoAF (5′-STAATGGTCTGGCTTAGACG-3′) 和 arch-amoAR (5′-GCGGCCATCCATCTGTATGT-3′)，反應(yīng)程序為預(yù)變性95℃ 30 s，94℃變性10 s，53℃退火30 s，72℃延伸1 min，共40個循環(huán)。采用 TB GreenTMPremix Ex TaqTM(2 ×) (Takara，大連)試劑盒，Real-time PCR反應(yīng)體系為20 μL，其中DNA 模板 1 μL，19 μL 反應(yīng)液，反應(yīng)液包括 10 μL 2 ×TB Green、上下游引物各1 μL，滅菌超純水7 μL。標(biāo)準(zhǔn)曲線以黑龍江黑土提取的DNA為模板進(jìn)行AOA arch-amoA基因和amoA基因克隆制備質(zhì)粒。將質(zhì)粒連續(xù)稀釋6個數(shù)量級作為標(biāo)曲，其中AOA擴(kuò)增效率為0.9，AOB擴(kuò)增效率為1.04。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用PASW statistics18、Excel、Canoco等軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析處理。含量明顯高于不施肥處理，其中T8的NH4+-N含量最低，與T1處理相比下降了15.2%。高氯處理T7的NH4+-N含量最高為3.40 mg/kg，是T1處理的

2 結(jié)果與分析

2.1 不同施肥處理對土壤基本化學(xué)性質(zhì)的影響

不同施肥處理對土壤基本化學(xué)性質(zhì)的影響較大(表2)。其中，初始土為1984年耕層土壤。經(jīng)過34年連續(xù)施用含氯化肥，土壤Cl-含量為高氯處理 ＞ 低氯處理 ＞ 不施氯處理，施氯的土壤Cl-含量顯著高于不施氯的處理，其中高氯處理土壤Cl-含量為43.62 mg/kg，顯著高于其他處理，是T1處理的3.5倍。與T1相比，所有施肥處理的土壤pH均顯著降低，且高氯處理土壤pH最低為5.27，顯著低于其他處理；其次是T2、T3處理，配施過磷酸鈣的T4、T5、T8三個處理之間pH差異不顯著，但顯著高于T2、T3處理。施肥處理的土壤全氮、有機(jī)質(zhì)均高于T1處理，施用含氯化肥對這2種養(yǎng)分含量影響較小。高氯處理土壤中堿解氮、速效磷、速效鉀含量均最高，分別為91.01、24.88、131.05 mg/kg，其中速效磷含量顯著高于其他處理。

2.2 不同施肥處理對土壤硝化作用的影響

2.2.1 不同施肥處理對土壤銨態(tài)氮、硝態(tài)氮的影響圖1表明，除T5、T8處理外，其他施肥處理NH4+-N 2倍，且與其他處理差異顯著。不同施肥處理對土壤NO3

--N含量影響較大，NO3

--N含量為10.02～15.38 mg/kg。其中T4處理NO3

--N含量最高，與T1處理相比提高了10.17%。T3處理NO3

--N含量顯著高于其他低氯處理，與T1、T4處理間差異不顯著，而低氯處理T5、T6和高氯處理T7間NO3

--N含量沒有顯著差異。2.2.2 不同施肥處理對土壤硝化潛勢的影響 土壤硝化潛勢可以用來表征土壤的氨氧化能力。由圖2可見，不同處理的土壤硝化潛勢范圍為1.48～4.48 mg/(kg·d)，處理間差異顯著。其中高氯處理T7的土壤硝化潛勢最低，顯著低于其他處理，與T4相比降低了74.6%。與T1相比，T2、T3處理硝化潛勢降低，但差異不顯著；除高氯處理外，配施磷肥的T4、T5、T6、T8幾個處理的硝化潛勢顯著高于未施磷肥的T1、T2、T3處理，且T4處理的土壤硝化潛勢最高為4.48 mg/(kg·d)，與T1處理相比提高了60%。

2.3 不同施肥處理對土壤AOA、AOB豐度的影響

通過實時熒光定量PCR技術(shù)對AOA與AOB的amoA基因拷貝數(shù)進(jìn)行了測定分析。從圖3可以看出，各處理土壤中AOA豐度均顯著高于AOB的豐度，且不同施肥處理土壤中氨氧化微生物豐度差異顯著。AOA 豐度為 1.53 × 107～5.53 × 107copies/g 干土，AOB 豐度為 7.91 × 105～1.99 × 106copies/g 干土。

表 2 不同處理的土壤基本化學(xué)性質(zhì)Table 2 Basic chemical properties of the tested soil in different treatments

圖 1 不同施肥處理土壤銨態(tài)氮、硝態(tài)氮含量Fig. 1 Contents of soil ammonium and nitrate nitrogen in different treatments

圖 2 不同施肥處理土壤硝化潛勢Fig. 2 Soil nitrification potential in different treatments

圖 3 不同施肥處理對土壤AOA、AOB豐度的影響Fig. 3 Abundance of archaeal and bacteria amoA gene in soils in different treatments

高氯處理T7的AOA豐度最低且顯著低于其他處理，與T1相比降低了71.9%。T2、T3處理AOA豐度也較T1處理顯著降低，分別降低了39.9%和30.2%，T4處理與T1處理差異不顯著。除高氯處理外，同時施用氮磷鉀肥的T5、T6、T8三個處理AOA豐度均低于T1處理，但顯著高于T2、T3處理。與T1相比，除高氯處理外，各施肥處理均顯著增加了土壤中AOB的豐度。高氯處理的AOB豐度最低，與T1差異不顯著。與AOA類似，T4處理的土壤中AOB豐度最高為1.99 × 106copies/g干土，與T5差異不明顯，但顯著高于其他處理，比T1處理提高了151%。

2.4 AOA、AOB豐度與土壤化學(xué)性質(zhì)、硝化潛勢的相關(guān)性

由表3可知，不同施肥處理土壤AOA豐度、AOB豐度與土壤硝化潛勢均呈顯著正相關(guān)關(guān)系，且與AOA呈極顯著正相關(guān)關(guān)系。AOA豐度與土壤pH呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.835，而AOB豐度與土壤pH無顯著相關(guān)性。土壤AOA豐度、AOB豐度與其他土壤化學(xué)性質(zhì)均無顯著相關(guān)性。

由冗余分析(圖4)也可看出，施用含氯化肥34年后，AOA和AOB豐度均對土壤硝化潛勢產(chǎn)生明顯影響，土壤pH僅對AOA豐度有明顯影響，而速效磷、速效鉀、堿解氮等其他化學(xué)性質(zhì)對土壤氨氧化微生物豐度無顯著影響。

表 3 AOA、AOB豐度與土壤化學(xué)性質(zhì)、硝化潛勢的相關(guān)性Table 3 Correlation coefficient among AOA and AOB abundance and soil chemical properties

圖 4 土壤氨氧化微生物與基本化學(xué)性質(zhì)的冗余分析Fig. 4 Relationship among soil cochemical properties and ammonia-oxidizing microorganisms in soil described with redundancy analysis

3 討論

3.1 長期施用含氯化肥對土壤化學(xué)性質(zhì)和硝化作用的影響

連續(xù)施用含氯化肥34年后，土壤基本性質(zhì)發(fā)生了顯著變化。盡管高氯處理土壤中Cl-含量顯著增加，但不會對作物產(chǎn)生危害，因其濃度遠(yuǎn)低于作物耐氯臨界值[15]。長期施用含氯化肥降低了土壤pH，鄒長明等[16]、侯小娟等[17]研究也表明，長期施用含氯化肥土壤pH有下降趨勢，會造成土壤酸化，與本試驗結(jié)果一致。其中高氯處理降低得更多，顯著低于其他處理，與T1相比降低了22.16%。這與吳金桂等[18]的研究結(jié)果類似。造成土壤酸化的原因，一方面是由于含氯肥料為生理酸性肥料，長期施用會導(dǎo)致土壤pH下降；另一方面可能是由于氯能抑制銨態(tài)氮的硝化作用[9]，而使作物在吸收銨態(tài)氮的同時，釋放出大量氫離子，提高了土壤的酸度。除高氯處理外，配施磷肥的幾個處理緩解了土壤酸化。速效氮、磷、鉀均在高氯處理的土壤中含量最高，李海云等[19]研究也表明，含氯化肥有利于土壤中速效氮、磷、鉀積累。

本研究中，高氯處理的土壤NH4+-N含量顯著高于其他處理，且硝化潛勢最低。表明施高氯抑制了土壤硝化作用，使更多的氮素以銨的形式存在，這與周丕東等[20]的研究結(jié)果一致。這應(yīng)該是由于高氯處理土壤pH顯著降低，影響了土壤中硝化微生物的活性導(dǎo)致硝化作用減弱[21]，或是高濃度的Cl-對氨氧化微生物產(chǎn)生了毒害作用所致[11]。除高氯處理外，其他配施磷肥的處理硝化潛勢均顯著高于未施磷肥的處理，T4 ＞ T2，T5 ＞ T6 ＞ T8 ＞ T3，其中 T4 處理硝化潛勢最高，說明施用磷肥促進(jìn)了土壤的硝化潛勢，這與以往的研究結(jié)果一致[8,14,22-23]。T1、T2、T3處理之間硝化潛勢沒有差異，而且這些處理中速效磷含量相對較低，進(jìn)一步表明磷可能是土壤硝化潛勢的限制因子，這與Zhou等[8]在紫色土上的研究結(jié)果類似。

3.2 長期施用含氯化肥對土壤AOA、AOB豐度的影響

在所有處理中，氨氧化古菌AOAamoA基因的豐度 (1.53 × 107～5.53 × 107copies/g) 均顯著高于氨氧化細(xì)菌 AOB (7.91 × 105～1.99 × 106copies/g)，二者比值為18.0～68.8，土壤中AOA的數(shù)量明顯多于AOB，這與羅培宇等[24]在棕壤上的研究結(jié)果一致。AOA的數(shù)量及AOA與AOB數(shù)量的比值均與土壤pH呈極顯著正相關(guān)關(guān)系 (r= 0.835**、r= 0.894**，P＜ 0.01)，即隨土壤pH的增加而增加，而AOB的數(shù)量與pH之間沒有相關(guān)性。李秀玲[25]在棕壤上的研究也認(rèn)為，AOA的豐度與土壤pH呈顯著正相關(guān)關(guān)系，與本研究結(jié)果一致，而張苗苗等[14]在南方酸性紅壤上的研究結(jié)果顯示AOA的數(shù)量及AOA與AOB數(shù)量的比值隨土壤pH的增加而降低，與本研究結(jié)果相反，這可能是由于土壤類型不同而造成的差異。本研究中施用高氯的處理AOA和AOB的豐度均顯著低于其他施肥處理，可能是由于高氯處理進(jìn)一步降低了土壤的pH，致使AOA和AOB的數(shù)量降低，或是該處理中累積的高濃度氯離子對氨氧化微生物產(chǎn)生了抑制作用，其具體機(jī)理還有待進(jìn)一步驗證。除高氯處理外，其他配施磷肥的處理AOA的數(shù)量均顯著高于不施磷處理，AOB的數(shù)量也是除T6和T7處理外施磷處理顯著高于不施磷處理，這說明磷也會影響土壤中氨氧化微生物，這與以往的研究結(jié)果類似[14]。

4 結(jié)論

經(jīng)過34年連續(xù)施用含高氯化肥顯著增加了棕壤中Cl-含量，并且顯著降低了土壤pH，加重了土壤的酸化。施用高氯化肥還顯著降低了土壤中AOA和AOB的豐度，減弱了土壤的硝化潛勢，抑制了硝化作用。土壤pH僅對土壤中AOA豐度具有顯著影響，對AOB豐度沒有明顯影響。