李建偉，唐呈瑞，向君亮，劉 瑀，申永瑞，殷奎德，張興梅*

（1．黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2．中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所，遼寧 沈陽 110016；3．黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；4．黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，黑龍江 大慶 163319）

土壤鹽堿化會使其自身營養(yǎng)下降，破壞其內(nèi)部良好的團粒結(jié)構(gòu)，對植物造成嚴(yán)重的滲透脅迫，嚴(yán)重影響植物的生長發(fā)育［1］。而通過接種或浸種的方式將耐鹽堿微生物與植物共生，可緩解脅迫對植物的危害，降低鹽堿對植物的不利影響，從而利用微生物改良鹽堿土［1-3］。苜蓿（Medicago sativa L.）是世界上利用最早、栽植最廣的多年生豆科牧草，因其具有營養(yǎng)豐富，品質(zhì)好，蛋白含量高，能生物固氮等優(yōu)點，被譽為“牧草之王”［4］。它不只是重要的飼草作物，還能改良土壤和保持水土，對畜牧業(yè)發(fā)展和生態(tài)環(huán)境建設(shè)做出了重要貢獻(xiàn)。然而，隨著土地鹽堿化面積的逐漸擴大，苜蓿產(chǎn)業(yè)化受到嚴(yán)重威脅。對于微生物改善鹽堿脅迫并提高苜蓿生長的研究報道較少，目前叢枝菌根真菌已經(jīng)被證實可促進(jìn)鹽堿脅迫下苜蓿的生長。如，趙琦等［5］在鹽堿混合脅迫條件下，接種叢枝菌根真菌（AMF）能夠改變紫花苜蓿體內(nèi)酚酸的含量，積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，促進(jìn)自身生長，從而提高其耐鹽堿性。但耐鹽堿細(xì)菌對NaHCO3脅迫下苜蓿的生長并未見報道。本研究從大慶草原鹽堿土中分離篩選到一株動性球菌屬的細(xì)菌，該菌具有耐鹽性、固氮和產(chǎn)ACC脫氨酶等促生特性；測試該菌株對苜蓿種子萌發(fā)和NaHCO3脅迫下苜蓿幼苗生長的影響，對其進(jìn)行分析，以期初步揭示其對苜蓿的促生和緩解NaHCO3脅迫的作用機理，在微生物緩解NaHCO3脅迫對植物的傷害方面有著重要的作用。

1 材料與方法

1.1 鹽堿土的采集與處理

采用5點法于黑龍江省大慶市龍鳳區(qū)采集未經(jīng)人為破壞的鹽堿土，挑出枯草、草根及石塊，混合均勻，放置于無菌袋中冷藏運送回實驗室。經(jīng)測定其鹽堿土的理化性質(zhì)為pH 8.34，堿解氮為315 mg/kg，有效磷為 19.2 mg/kg，速效鉀為 398 mg/kg，有機質(zhì)含量為33.7 g/kg，含鹽量為0.30%。

1.2 供試材料

供試苜蓿為敖漢苜蓿，由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命學(xué)院草業(yè)科學(xué)實驗室提供。

1.3 主要試劑和培養(yǎng)基

分別按照李艷星等［6］和劉莎莎［7］的方法進(jìn)行菌株的固氮和產(chǎn)ACC脫氨酶能力鑒定。

1.4 S38的分離和鑒定

采用傳統(tǒng)涂布劃線法于篩選培養(yǎng)基上分離獲得該菌，獲得純培養(yǎng)物后，利用引物27F和1492R擴增其16S rDNA基因，純化PCR產(chǎn)物后與pGM-T載體連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中，經(jīng)藍(lán)白斑篩選后，用引物T7和SP6進(jìn)行PCR驗證，驗證正確后，委托上海生工公司完成序列的測定。利用NCBI Blastn尋找一致性高的序列（構(gòu)建16S rRNA基因系統(tǒng)樹時選一致性高的模式種序列）作為系統(tǒng)發(fā)育分析的參比序列；然后用MEGA 7.0軟件內(nèi)置的Clustal W程序?qū)Λ@得的序列進(jìn)行對比，用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，其中，Bootstrap method值設(shè)為 1 000，其余參數(shù)為默認(rèn)值。

1.5 苜蓿種植和堿脅迫處理

苜蓿萌發(fā)期處理：將菌株接種于S-G改良培養(yǎng)基中，在 37 ℃，175 r/min 培養(yǎng) 24 h，于 10 000 g 離心15 min，棄上清液，沉淀用無菌蒸餾水洗滌并重懸，重復(fù)3次后調(diào)節(jié)OD600至0.5，將表面消毒后的苜蓿種子分別浸泡于重懸菌液（S1）和無菌蒸餾水（CK1）中，24 h后分別將其擺放于無菌培養(yǎng)皿中并加入10 mL無菌蒸餾水，放置于培養(yǎng)箱中（溫度25 ℃，光暗周期 12 h/ 12 h），培養(yǎng)過程中適量補充水分。

苜蓿幼苗期處理：實驗采用蛭石澆灌營養(yǎng)液的培養(yǎng)方式，每盆中央分別播種5粒剛剛萌發(fā)的苜蓿種子，覆蛭石1 cm。實驗過程中，設(shè)置2種處理和3次重復(fù)，即NaHCO3脅迫處理不施加菌液和施加菌液，2種處理分別以CK2和S2表示，S2的菌液量為每盆施加 20 mL（OD=0.5，108cfu/mL），同時 CK2相應(yīng)施加等量的無菌蒸餾水20 mL；每個處理播種20盆，放置于溫室培養(yǎng)（溫度25℃，光暗周期14 h/10 h）；為了模擬取樣的鹽堿土pH，每隔7 d澆一次含有 25 mmol/L 的 pH 8.5 NaHCO3的營養(yǎng)液，每次50 mL，施用后 24 h 測量其 pH，使之恒定 pH 8.5。

1.6 苜蓿生長性狀及生理指標(biāo)測定

苜蓿萌發(fā)期：待培養(yǎng)5 d后統(tǒng)計種子發(fā)芽率，7 d后測定其芽長、根長和鮮重。

苜蓿幼苗時期：苜蓿出苗生長22 d后，觀察并測定其形態(tài)、株高、根長、鮮重和干重等生長指標(biāo)；采用95%乙醇提取法測定葉片中葉綠素含量；利用半微量凱氏定氮法測定地上部及地下部氮含量和離子含量（K+）；應(yīng)用蒽酮比色法測定地上部和地下部可溶性糖含量；參照張志良等［8］著《植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)》測定地上部和地下部抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用 SPSS 18.0 對測定的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析及差異顯著性分析（顯著差異水平0.05，用小寫字母表示），用 Excel 2016 處理數(shù)據(jù)和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種分離和鑒定

圖1 菌落形態(tài)和促生特性鑒定

采集的鹽堿土分別在pH 8.5終濃度為50 mmol/L Na2CO3和 100 mmol/L NaHCO3的篩選壓力下，經(jīng)過分離純化共獲得43株不同菌落形態(tài)的耐鹽堿細(xì)菌。其中1株編號為38的細(xì)菌（S38）（圖1A）對植株促生有較明顯的作用，將其在阿須貝無氮培養(yǎng)基和以ACC為唯一碳源的ADF培養(yǎng)基上生長（圖1B和C），從而預(yù)測38號菌株具有固氮和產(chǎn)ACC脫氨酶的能力?；?6S rRNA基因序列測定，S38部分16S rRNA 基因序列長度為 1 455 bp。該序列經(jīng) NCBI Blastn分析表明，此株細(xì)菌的16S rRNA基因序列與現(xiàn)有模式菌株P(guān)lanococcus rif i etoensisM8T（CP013659）的相似性最高，為98.14%。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果（圖2）也表明，S38 與Planococcus rifietoensisM8T（CP013659）菌株親緣關(guān)系最近，且其處于進(jìn)化樹Planococcus屬模式種進(jìn)化支上，表明該菌株屬于Planococcus屬。

圖2 S38基于16S rRNA的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

2.2 S38對苜蓿種子萌發(fā)的影響

從表1中可以發(fā)現(xiàn)，S1（菌液處理）與CK1（無菌蒸餾水）相比，培養(yǎng)5 d的苜蓿種子發(fā)芽率顯著提高，達(dá)到了93.33%；培養(yǎng)7 d的苜蓿苗長增加了1.04倍，鮮重增加69.57%，均在0.05水平下達(dá)到了顯著水平?？梢?，菌液對苜蓿種子有顯著的促生作用，這更有助于其后期的繼續(xù)生長發(fā)育。

表1 苜蓿生長性狀

2.3 S38對NaHCO3脅迫苜蓿幼苗生長性狀及生理特性的影響

2.3.1 幼苗生長性狀

NaHCO3脅迫下苜蓿幼苗生長22 d時，對比觀察和測定了地上部和地下部生物量、株高和根長。結(jié)果（圖3，表2）表明，CK2（NaHCO3脅迫處理）與S2（NaHCO3脅迫加菌液處理）對堿脅迫下苜蓿幼苗生長影響有顯著差異。S2與CK2相比，株高增高了8.44%，根長增長了12.34%，地上部和地下部生物量分別提高32%和50%，根冠比增加16.76%；其中，除地上部和地下部生物量在0.05水平下達(dá)到顯著差異以外，其它均未達(dá)到顯著水平。可見，S38可以影響NaHCO3脅迫下苜蓿形態(tài)，尤其是根形態(tài)的建成。

圖3 NaHCO3脅迫下苜蓿植株形態(tài)

表2 NaHCO3脅迫苜蓿生長性狀

表3 NaHCO3脅迫苜蓿光合色素含量

2.3.2 光合色素含量

葉綠素包括葉綠素a（Chla）和葉綠素b（Chlb），葉綠素在植物體內(nèi)負(fù)責(zé)光能的吸收、傳遞和轉(zhuǎn)化，其中一部分特殊的Chla負(fù)責(zé)將植物吸收的光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能；Chla和Chlb分別吸收紅橙光和藍(lán)紫光，Chla/Chlb提高更有利于葉片對長波光聚集。因此，植物的光合色素含量的高低是衡量植物光合作用的重要指標(biāo)。從表3可以看出，S2與CK2相比，Chla、Chlb和Chla+Chlb含量分別增加了1.33、1.15和1.28倍，Chla/Chlb增加了8.47%，且均達(dá)到了顯著水平（P＜0.05）?？梢?，S38可以影響NaHCO3脅迫下苜蓿光合作用，對苜蓿幼苗生長產(chǎn)生積極作用。

2.3.3 氮含量

堿脅迫下營養(yǎng)缺乏是形成植物受害的重要原因之一，并且植物同化氮素的能力降低，造成氮營養(yǎng)的缺乏，維持較高的氮同化能力對于增強植物的耐性具有重要作用。如圖4所示，CK2與S2對NaHCO3脅迫下苜蓿幼苗氮含量影響無顯著差異。

圖4 NaHCO3脅迫下苜蓿幼苗氮含量

2.3.4 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)（可溶性糖含量）

可溶性糖作為有機滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)合成的能量和碳骨架的來源，在堿脅迫條件下，植株體內(nèi)細(xì)胞液可溶性糖含量增加使其濃度增大，從而增強細(xì)胞吸水能力，保持細(xì)胞的膨壓，以便水分在跨膜運輸過程中保證植物細(xì)胞對水分需求，從而保持細(xì)胞生理生化過程在正常狀態(tài)，使植物免受生理干旱。如圖5所示，S2與CK2相比，地上部可溶性糖含量降低了8.59%，地下部可溶性糖含量降低了17.56%，且均達(dá)到了顯著水平。由此可見，S38能夠降低NaHCO3脅迫下苜蓿幼苗的可溶性糖含量，緩解了苜蓿幼苗通過積累可溶性糖含量來進(jìn)行保水以對抗NaHCO3脅迫傷害的作用。

圖5 NaHCO3脅迫下苜蓿幼苗可溶性糖含量

2.3.5 抗氧化酶活性（SOD、POD、CAT）

植物在自然條件下生長也可能會受到逆境脅迫，這些脅迫會導(dǎo)致植物形成過量的活性氧自由基（reactive oxide species，ROS），而 ROS 對細(xì)胞膜系統(tǒng)、脂類、蛋白質(zhì)和核酸等大分子具有很強的破壞作用，同時，植物體內(nèi)的抗氧化保護酶系統(tǒng)也可以清除體內(nèi)多余的氧自由基，防止ROS的毒害，提高抗逆性，ROS清除系統(tǒng)由許多酶和還原性物質(zhì)組成。其中，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）是主要的抗氧化酶。SOD是清除超氧自由基的關(guān)鍵酶，從圖6A可知，S2與CK2相比，地上部和地下部SOD活性分別降低了31.22%和41.21%，且均達(dá)到了顯著水平。POD是逆境條件下酶促防御系統(tǒng)的關(guān)鍵酶，由圖6B可以發(fā)現(xiàn)，S2與CK2相比，地上部和地下部POD活性均有所降低，但均未達(dá)到顯著水平。在植物體中，CAT具有雙重作用，第一，適量的過氧化氫通過誘導(dǎo)一系列防御機制來保護植物細(xì)胞免受氧化脅迫；第二，過量的過氧化氫則導(dǎo)致過氧化損傷，對植物體造成傷害，如圖6C所示，S2與CK2相比，地上部和地下部CAT活性分別降低了20.73%和29.72%，且均達(dá)到了顯著水平。可見，堿脅迫導(dǎo)致了葉片活性氧的積累，進(jìn)而通過反饋調(diào)節(jié)，增加了SOD和CAT活性，而S38緩解了NaHCO3脅迫對苜蓿幼苗的負(fù)向影響，以維持其正常的生長發(fā)育。

圖6 NaHCO3脅迫下苜蓿幼苗抗氧化酶活性

2.3.6 無機陽離子含量（K+）

植物在堿脅迫下被迫吸收無機離子，造成植物體內(nèi)離子平衡遭到破壞，造成離子毒害。K+是維持細(xì)胞膨壓的主要陽離子。從圖7中可以發(fā)現(xiàn)，S2與CK2相比，地上部和地下部K+含量分別增加了11.66%和18.25%，且均達(dá)到了顯著水平?？梢?，NaHCO3脅迫使苜蓿的生長環(huán)境增加大量Na+，從而影響苜蓿體內(nèi)水勢，為了維持體內(nèi)Na+/K+含量平衡，K+含量降低，而S38緩解了Na+在苜蓿體內(nèi)的積累，使苜蓿體內(nèi)K+含量增加。

圖7 NaHCO3脅迫下苜蓿幼苗K+含量

3 小結(jié)與討論

以促進(jìn)植物生長為特性的耐鹽細(xì)菌，自發(fā)現(xiàn)對促進(jìn)鹽漬土壤植物生長以來而備受關(guān)注［9-10］。本文以傳統(tǒng)的涂布劃線法，在采集的鹽堿土中篩選獲得1株耐鹽堿且預(yù)測具有固氮和產(chǎn)ACC脫氨酶能力的細(xì)菌，為驗證該菌的功能還需要補充固氮基因等相關(guān)實驗。通過系統(tǒng)發(fā)育樹分析可知，該菌是 Planococcus屬細(xì)菌，與 Planococcus rif i etoensis M8T（CP013659）相似性極大（98.14%），很可能菌本身的特性和對植株的作用也很相似。Planococcus rif i etoensis M8T（CP013659）是一種中度耐鹽菌，它能通過將氨轉(zhuǎn)化為氮，從而促進(jìn)小麥生長［11］；2016年，See-Too等［12］第一次對Planococcus rif i etoensis M8T進(jìn)行了完整的基因組分析；在高鹽脅迫的土壤中施入Planococcus rif i etoensis，可以減少植物細(xì)胞的離子失衡［13］；在鹽脅迫下，Planococcus rif i etoensis可以改善植物生長和土壤肥力［14］；同時，Planococcus rif i etoensis在甜菜上也有應(yīng)用，不僅增加了種子的發(fā)芽和生物量，更提高了甜菜的光合能力和降低了甜菜在不同NaCl濃度（50 ～ 125 mmol/L）下乙烯的產(chǎn)量［15］。本研究利用S38對苜蓿種子進(jìn)行浸種處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，浸種后苜蓿種子的發(fā)芽率、苗長和鮮重均明顯地增加。逆境對植物個體形態(tài)發(fā)育具有顯著影響，主要表現(xiàn)就是逆境抑制了植物組織和器官的生長。生長抑制是植物對逆境脅迫最直接的表現(xiàn)，也是評價植物耐性最直觀的指標(biāo)。本研究在NaHCO3脅迫下，施加S38菌液相比不施加菌液處理的苜蓿幼苗，地上部和地下部干重均顯著增加，這可能是施加S38菌液促進(jìn)苜蓿幼苗光合色素含量增加（Chla、Chlb和Chla+Chlb均顯著提高），導(dǎo)致光合能力增強，積累更多的有機物，同時運輸?shù)降叵虏浚受俎Ｓ酌绲厣喜亢偷叵虏可锪匡@著增加。在植物細(xì)胞的正常代謝過程中，幾乎所有的需氧反應(yīng)都可以產(chǎn)生活性氧，ROS的產(chǎn)生與清除始終處于動態(tài)平衡。逆境脅迫下，ROS濃度會增加，使細(xì)胞產(chǎn)生大量的ROS，會誘導(dǎo)抗氧化酶類活性、積累抗氧化物質(zhì)，以清除植物體內(nèi)過多的ROS，緩解對植物的傷害，維持植物正常的生長發(fā)育。滲透調(diào)節(jié)也是植物對逆境脅迫的應(yīng)激手段之一，可溶性糖等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)在逆境條件下會大量積累，以降低細(xì)胞滲透勢，緩解水分的流失。本研究發(fā)現(xiàn)在NaHCO3脅迫下，施加S38菌液與不施加菌液處理相比，苜蓿幼苗地上部與地下部可溶性糖含量、SOD和CAT活性均顯著降低，可能是施加S38菌液促進(jìn)了植株的無機陽離子含量顯著增加（地上部和地下部K+含量分別增加了11.66%和18.25%）并適當(dāng)積累，足以維持苜蓿幼苗正常的生理代謝，因此，施加38號菌液的苜蓿幼苗不需要產(chǎn)生過多的抗氧化酶，合成大量的可溶性糖就可以維持細(xì)胞內(nèi)的滲透平衡。雖然本研究表明了S38對苜蓿種子萌發(fā)有促進(jìn)作用，也對NaHCO3脅迫下的苜蓿幼苗有緩解作用，說明該菌在促進(jìn)植物適應(yīng)逆境脅迫方面具有良好的應(yīng)用潛力，但對NaHCO3脅迫下苜蓿整個生長周期的生長和產(chǎn)量等的影響及其機理等方面還有待更進(jìn)一步的研究。