刁立琴 韓婷 高保栓 康莉 付釗 河北省醫(yī)療器械與藥品包裝材料檢驗研究院 （河北 石家莊 050061）

內(nèi)容提要： 目的：評價透明質(zhì)酸鈉修護(hù)貼敷料的生物安全性。方法：根據(jù)醫(yī)療器械生物學(xué)評價標(biāo)準(zhǔn)中的細(xì)胞毒性，皮膚刺激和遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗對三批不同廠家的透明質(zhì)酸鈉修護(hù)貼敷料進(jìn)行安全性評價。結(jié)果：三批透明質(zhì)酸鈉修護(hù)貼敷料細(xì)胞毒性均為1級,均無皮膚刺激反應(yīng)和遲發(fā)型超敏反應(yīng)。結(jié)論：三批透明質(zhì)酸鈉修護(hù)貼敷料具有良好的生物安全性。

透明質(zhì)酸鈉（HA）是一種高分子粘多糖，廣泛存在于人體皮膚和其他組織中，具有很好的保濕作用。由透明質(zhì)酸鈉加工制得的修護(hù)貼敷料，適用于面部激光，光子嫩膚等微創(chuàng)術(shù)后的皮膚護(hù)理，可以減少色素沉著、減輕瘢痕，促進(jìn)皮膚損傷的修護(hù)。近年來，隨著人們對美容養(yǎng)生的要求提高，臨床需求增大。作為Ⅱ類醫(yī)療器械，根據(jù)GB/T的系列標(biāo)準(zhǔn)本文對3批不同廠家的透明質(zhì)酸鈉修護(hù)貼敷料進(jìn)行了細(xì)胞毒性、皮膚刺激和超敏反應(yīng)試驗的生物學(xué)評價。

1.試驗材料與方法

1.1 試驗材料

小鼠成纖維細(xì)胞L-929（中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞資源中心）；1640培養(yǎng)基（北京Solarbio生物科技有限公司）；胎牛血清（Biological Industries Israel Beit Haemek Ltd）；DMSO（SIGMA-ALDRICH）；新西蘭兔（中國食品藥品檢定研究院，動物編號：20170913NZWT)，體重2.2～2.7kg，普通級；DH豚鼠（中國食品藥品檢定研究院，動物編號：20170818DHS)，體重300～500g，SPF級；透明質(zhì)酸鈉修護(hù)貼敷料，選擇不同廠家三批樣品分為A、B、C組。

1.2 試驗方法

1.2.1 細(xì)胞毒性試驗（MTT法）

（1）供試液的制備：樣品浸提液制備：取A、B、C三批樣品，按6cm2/mL的比例加入含10%血清的1640培養(yǎng)基，37°C浸提24h，備用[1]；空白對照液：同批含10%血清的1640培養(yǎng)基；陰性對照液：高密度聚乙烯按0.2g/mL的比例加入含10%血清的1640培養(yǎng)基；陽性對照：5%DMSO的培養(yǎng)液；

（2）試驗方法：按照GB/T14233.2-2005規(guī)定的MTT試驗方法進(jìn)行[2]，將1×104/mL細(xì)胞懸液接種于96孔板，每孔100μL。置5%CO2培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)24h后，棄去原培養(yǎng)液。加入樣品浸提液、空白對照液、陰性對照液和陽性對照液，每孔100μL置5%CO2培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)72h，然后每孔加入20μL 5g/L的MTT溶液，培養(yǎng)4h后棄去孔內(nèi)溶液，加入150μL DMSO，振蕩10min后，在酶標(biāo)儀570nm和630nm雙波長下測定吸光度（OD值）。按下式計算細(xì)胞相對增殖率（RGR）：

注：RGR：相對增殖率，%；A：供試品組（陰性組、陽性組）吸光度；A0：空白對照組吸光度。

按表1進(jìn)行分級判定。

1.2.2皮膚刺激試驗

取體重為2.3kg～2.5kg新西蘭兔9只，試驗前4h在兔脊柱兩側(cè)除去10cm×15cm被毛，作為試驗和對照部位，按照GB/T16886.10-2005動物皮膚刺激試驗方法操作[3]，將樣品（A、B、C）分別裁成2.5cm×2.5cm大小，直接貼敷于試驗部位，對照品用0.9%氯化鈉注射液的浸濕的無菌紗布塊同法操作。封閉固定4h，除去敷貼片后1h、24h、48h、72h記錄各接觸部位皮膚紅斑和水腫反應(yīng)，按記分標(biāo)準(zhǔn)計算樣品的原發(fā)性刺激指數(shù)（PⅡ）。

1.2.3 遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗

取體重為390g～410g豚鼠，于試驗前4h剃除動物左上背被毛。每批樣品取10只豚鼠作為試驗組，另取5只豚鼠作為對照組。按GB/T16886.10-2005中遲發(fā)型超敏反應(yīng)封閉貼敷試驗方法進(jìn)行[3]，三批樣品同法操作。

誘導(dǎo)：將樣品剪取4cm2的小塊共10份，分別貼敷于試驗組10只動物的左上背無毛區(qū)，另取浸濕0.9%氯化鈉注射液的無菌紗布4cm2的小塊共5份，分別貼敷于陰性對照組5只豚鼠的左上背無毛區(qū)作陰性對照，用繃帶包扎固定6h后去除。1周中連續(xù)3d重復(fù)此步驟，同法操作3周。

激發(fā)：最后一次誘導(dǎo)貼敷后14d，將樣品剪取4cm2的小塊共15份，分別貼在試驗組和對照組豚鼠的右上背無毛區(qū)，用繃帶包扎固定6h，進(jìn)行激發(fā)。

觀察：激發(fā)后24h剃去右上背毛，用溫水清洗并擦干。脫毛后至少2h，按Magnusson和Kligman分級標(biāo)準(zhǔn)對試驗部位評分，并在除去激發(fā)敷貼片后48h進(jìn)行再次評分。

2.試驗結(jié)果

2.1 細(xì)胞毒性試驗

MTT結(jié)果顯示，A樣品的細(xì)胞增殖率（RGR）為：87%；B樣品的細(xì)胞增殖率（RGR）為：89%；C樣品的細(xì)胞增殖率（RGR）為：86%，三批樣品的毒性反應(yīng)均為1級，見表2。

表1. 細(xì)胞毒性試驗反應(yīng)分級

表2. 細(xì)胞毒性試驗結(jié)果

2.2 皮膚刺激試驗

9只動物在整個試驗觀察期內(nèi)均沒有發(fā)現(xiàn)皮膚出現(xiàn)紅斑和水腫，結(jié)果表明A、B和C三批樣品的原發(fā)性刺激指數(shù)（PⅡ）都為0，說明在本試驗條件下，三批樣品均未發(fā)現(xiàn)皮膚刺激反應(yīng)。

表3. 遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗結(jié)果

2.3 遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗

動物在去除敷貼24h和48h，觀察試驗結(jié)果表明，樣品組和對照組中豚鼠的反應(yīng)等級均為0，表明A、B、C三批透明質(zhì)酸鈉修護(hù)貼敷料均未發(fā)現(xiàn)遲發(fā)型超敏反應(yīng)，見表3。

3.討論

人體隨著年齡的增長，皮膚中HA的含量降低，從而導(dǎo)致皮膚水分減少，皮膚粗糙，失去彈性，出現(xiàn)皺紋，外源性HA可以有效補(bǔ)充皮膚內(nèi)源性HA，從而能防止皮膚老化，起到美容養(yǎng)顏的作用[4,5]。透明質(zhì)酸鈉修護(hù)貼敷料通過貼敷，可以在皮膚表面形成以大分子聚合物透明質(zhì)酸為主的保護(hù)膜，小分子的透明質(zhì)酸能滲入真皮，改善中間代謝，促進(jìn)皮膚營養(yǎng)吸收，起到良好的保濕和促進(jìn)組織修復(fù)作用。本文根據(jù)GB/T醫(yī)療器械生物學(xué)評價的系列標(biāo)準(zhǔn)對透明質(zhì)酸鈉修護(hù)貼敷料進(jìn)行了細(xì)胞毒性，遲發(fā)型超敏反應(yīng)，皮膚刺激試驗生物學(xué)評價，結(jié)果表明三批透明質(zhì)酸鈉修護(hù)貼敷料均具有良好的生物安全性。