趙凌國1 尹江偉1 鐘偉燕1 李紅華1 吳洲銘 楊靈芝

(1.深圳市寶安區(qū)疾病預(yù)防控制中心，深圳 518100；2.深圳大學(xué)藥學(xué)院，深圳 518060)

β受體阻滯劑(Beta Blockers, BBs)是降低心力衰竭患者發(fā)病率和死亡率的一類重要心血管藥物，可競爭性與β受體結(jié)合而產(chǎn)生拮抗β激動劑的效應(yīng)，包括對心臟興奮的抑制作用和對支氣管及血管平滑肌的舒張作用等。在臨床上，β受體阻滯劑廣泛應(yīng)用于多種疾病，包括高血壓、急性心肌梗死、充血性心力衰竭、原發(fā)性震顫、偏頭痛、青光眼和控制焦慮發(fā)作情況下的急性恐慌癥狀等[1，2]。不同構(gòu)型β受體阻滯劑可以具有不同的藥效學(xué)和立體選擇性作用機(jī)理，在藥代動力學(xué)、藥理作用和毒性方面存在差異[3-6]，部分藥物藥效作用可相差百倍[7]，甚至一種具有活性，另外一種對映體完全無活性或具有副作用[8-11]。目前臨床上使用的β受體阻滯劑絕大多數(shù)為外消旋體，因此，β受體阻滯劑藥物的手性分離研究，有利于藥物動力學(xué)、藥效學(xué)研究和藥物質(zhì)量控制，對開發(fā)藥效更高、副作用更小的藥物具有重要的意義。

在眾多手性拆分方法中，毛細(xì)管電泳法(CE)具有高效、快速、分離模式和手性選擇劑種類多、低成本、樣品用量少、低污染特點(diǎn),并可通過在緩沖液中直接添加手性選擇劑來實(shí)現(xiàn)拆分目的，被認(rèn)為是分離對映異構(gòu)體最有效的技術(shù)之一。β-環(huán)糊精(β-CD)被用作CE手性試劑分離了美托洛爾對映體[12]和普萘洛爾對映體[13]。2-甲基-β-CD被用作手性試劑分離了卡維地洛對映體[14]。羥丙基β-CD被用作手性試劑分離了4種β受體阻滯劑及類似物[15]。磺酸化-β-環(huán)糊精被用作手性試劑分離了5 種β受體阻滯劑。6-磺化-β-環(huán)糊精和heptakis (2,3-diacetyl-6-sulfato)-β-CD等帶負(fù)電荷的衍生化環(huán)糊精對β-受體阻滯劑表現(xiàn)出良好的手性識別能力[16，17]。羧甲基β-CD(CM-β-CD)也被單獨(dú)用作手性試劑分離β-受體阻滯劑[18-20]，或者與其它環(huán)糊精或離子液體組成雙手性拆分試劑分離β-受體阻滯劑[21-24]。本研究以羧甲基-β-環(huán)糊精(CM-β-CD)為手性試劑，成功拆分5種β受體阻滯劑，并以普萘洛爾為分離對象，系統(tǒng)探討了相關(guān)分離機(jī)制及影響因素，相比于部分文獻(xiàn)使用低pH值[21-23]和高的環(huán)糊精濃度(0.9%～1.8%)[20-23]，本研究在較寬的pH和電壓范圍內(nèi)，添加少量CM-β-CD，獲得了優(yōu)于文獻(xiàn)報(bào)道的分離度以及基線平穩(wěn)的手性分離效果[12-15, 17，18, 20-23]，并在此基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)普萘洛爾對映體的分離度和分析時(shí)間與CM-β-CD濃度存在線性關(guān)系，此前未見報(bào)道。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

SCIEX P/ACETMMDQ PLUS毛細(xì)管電泳儀(AB Sciex，F(xiàn)ullerton，CA，USA)，配備二極管陣列檢測器、32 Karat 10.2工作站；熔融石英毛細(xì)管(河北永年光纖廠)，內(nèi)徑75 μm，外徑365 μm，有效長度40 cm，總長50 cm；無水甲醇和氫氧化鈉購自天津市大茂化學(xué)試劑廠；無水磷酸氫二鈉、無水磷酸二氫鈉、冰乙酸、無水乙酸鈉、無水檸檬酸和二水合檸檬酸三鈉均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；羧甲基-β-環(huán)糊精購自山東濱州智源生物科技有限公司(2,6位不定位取代度6.879)；(±)-鹽酸普萘洛爾、(S)-(-)-普萘洛爾鹽酸鹽、(R)-(+)-普萘洛爾鹽酸鹽、(±)-酒石酸美托洛爾、阿替洛爾、倍他洛爾、卡拉洛爾購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 緩沖液及樣品制備

緩沖液配置方法如下: 分別配制pH 5.5、6.5、7.5和8.5的磷酸鹽緩沖液(磷酸根濃度為5 mM)，以及10 mM、20 mM、40 mM的磷酸鹽緩沖液(pH5.5)。配制pH 5.5的乙酸-乙酸鈉緩沖液(乙酸根濃度5 mM)及檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(檸檬酸根濃度5 mM)。將羧甲基-β-環(huán)糊精用對應(yīng)的緩沖液溶解，分別配制為0.05%、0.1%、0.2%、0.4%、0.8%(m/v)的運(yùn)行緩沖液(臨用現(xiàn)配)。無水甲醇溶解β受體阻滯劑，配成1mg/mL的儲備液，臨用時(shí)，用對應(yīng)緩沖液配置成0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.3 毛細(xì)管電泳分析方法的建立

毛細(xì)管電泳分析條件如下：20 psi壓力下，用水、0.1 mol/L NaOH、水、運(yùn)行緩沖液沖洗毛細(xì)管各5 min，樣品在0.5 psi壓力下進(jìn)樣5s，柱溫為20℃，檢測波長普萘洛爾為235nm，美托洛爾為224nm，阿替洛爾為225nm，倍他洛爾為225nm，卡拉洛爾為235nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 CM-β-CD濃度對手性分離的影響

研究首先考察手性選擇劑CM-β-CD濃度對普萘洛爾拆分效果的影響，結(jié)果如圖1所示。在0.05%～0.8%范圍內(nèi)，普萘洛爾對映體的分離度Rs和分析時(shí)間t隨CM-β-CD濃度增加呈線性增長(相關(guān)系數(shù)r均為0.988)。這主要是由于在pH5.5時(shí)，CM-β-CD帶負(fù)電荷，其電遷移方向與電滲流EOF相反(圖2)，當(dāng)帶正電的普萘洛爾對映體與CM-β-CD相互作用時(shí)(靜電作用力、疏水作用能以及包合作用)，會降低對映體的表觀遷移速率，從而增加遷移時(shí)間。同時(shí)，隨著CM-β-CD濃度的增加，對映體與CM-β-CD結(jié)合的概率提高，由于R和S對映體與CM-β-CD的包合作用存在差異，結(jié)合概率的升高導(dǎo)致對映體分子間的淌度之差更加顯著，分離度增加。研究發(fā)現(xiàn)，有文獻(xiàn)報(bào)道對映體分離度和分析時(shí)間隨CM-β-CD濃度增加而增大的現(xiàn)象[19-21]，但文獻(xiàn)未作進(jìn)一步探討。本研究首次明確指出低濃度下，普萘洛爾對映體分離度和分析時(shí)間與CM-β-CD濃度的線性關(guān)系。

根據(jù)Wren等[25]提出的理論模型，在CE手性分離中，對映體分子間的淌度之差是手性選擇劑濃度的函數(shù)，存在一個(gè)最大值。但高濃度下，Rs增加緩慢[19]，且電流過大，峰展寬，基線不穩(wěn)[20，21]，并考慮到在0.8%CM-β-CD濃度時(shí)，分析時(shí)間已接近1小時(shí)，高濃度CM-β-CD不具備分析速度優(yōu)勢，未作繼續(xù)探討。

圖1 CM-β-CD濃度對普萘洛爾對映體分離的影響.電壓: +25 kV; 緩沖液：5mM 磷酸鹽緩沖液(pH5.5)

圖2 CM-β-CD分離普萘洛爾對映體機(jī)制示意圖

2.2 pH值對手性分離的影響

考察pH值對普萘洛爾對映體拆分效果的影響，結(jié)果如圖3所示。隨pH值增加，對映體分析速度加快，柱效增加，但選擇因子和分離度下降。這是因?yàn)榫彌_液pH值會影響毛細(xì)管內(nèi)壁硅羥基解離，從而影響電滲流。隨pH值增加，EOF增大，分析時(shí)間縮短，對映體分子朝不同方向縱向擴(kuò)散時(shí)間縮短導(dǎo)致柱效增加。此外，分析時(shí)間縮短會導(dǎo)致對映體與CM-β-CD相互作用時(shí)間減少，對映體表觀趟度差異減少，選擇因子和分離度下降。同時(shí)相互作用的減少相當(dāng)于降低了傳質(zhì)阻力，柱效升高，即所謂的縮短分析時(shí)間，有利于提高柱效，但不利于分離，反之亦然。因此，實(shí)驗(yàn)可以調(diào)節(jié)pH值，操控電滲流，在滿足分離度的情況下，以加快分析速度。緩沖液pH值除了影響電滲流，還可能會影響手性選擇劑和對映體的荷電狀態(tài)，但由于羧甲基的pKa約為4，在pH5.5～8.5的范圍內(nèi)，CM-β-CD分子幾乎全部去質(zhì)子化而帶負(fù)電荷。同樣普萘洛爾的pKa約為9.4，在pH5.5～8.5的范圍內(nèi)始終帶正電荷。因此，在本研究中不考慮pH值對手性選擇劑和對映體荷電狀態(tài)的影響。

圖3 pH值對普萘洛爾分離的影響電壓: +25 kV; 緩沖液: 5mM磷酸鹽緩沖液; CM-β-CD濃度: 0.2%.

2.3 電壓對手性分離的影響

毛細(xì)管電泳具有高柱效的重要原因是內(nèi)徑小，散熱快，從而可使用高電場強(qiáng)度。從圖4可以看到，和調(diào)節(jié)pH值一樣，增大電壓同樣可以加大電滲流，從而產(chǎn)生相似的分離效果，即分析時(shí)間縮短，柱效增加，選擇因子和分離度下降。值得注意的是，增大電壓同樣會提高CM-β-CD朝陽極的電遷移速度(圖2)，但是通常情況下，相比于電滲流，電遷移的速率相差一個(gè)數(shù)量級，本研究中電遷移速率的變化對電泳趟度的影響可以忽略。此外，電壓并非越高越好，從圖4可以看出，當(dāng)電壓達(dá)到25kV時(shí)，體系內(nèi)產(chǎn)生焦耳熱已經(jīng)不能忽略，導(dǎo)致柱效下降。

圖4 電壓對普萘洛爾對映體分離的影響緩沖液: 5mM磷酸鹽緩沖液(pH5.5); CM-β-CD濃度: 0.2%.

2.4 緩沖液種類對手性分離的影響

考察緩沖液種類對普萘洛爾對映體拆分效果的影響，結(jié)果如圖5所示。磷酸鹽緩沖液中，對映體具有最大的分離度，但柱效最低，分析時(shí)間最長。乙酸鹽緩沖液具有最高的柱效，而檸檬酸鹽緩沖液具有最快的分析速度，但分離度最差，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示緩沖液種類對普萘洛爾手性分離具有明顯的影響，是值得考慮的優(yōu)化條件之一。

圖5 緩沖液種類對普萘洛爾對映體分離的影響 電壓:+25 kV; 緩沖液pH: 5.5; CM-β-CD濃度: 0.2%.

2.5 其他4種β腎上腺素受體阻滯劑的分離

β-CD具有疏水內(nèi)腔，手性化合物的疏水結(jié)構(gòu)可以進(jìn)入CD內(nèi)部空腔，同時(shí)β-CD還具有多個(gè)手性作用位點(diǎn)，能夠與手性分子發(fā)生三維立體結(jié)構(gòu)的匹配，形成包合絡(luò)合物。由于對映體構(gòu)型不同，形成的包合絡(luò)合物具有不同的穩(wěn)定性，導(dǎo)致電泳表觀趟度存在差異而分離?？紤]到β受體阻滯劑是堿性藥物，本研究針對性地采用CM-β-CD作為手性選擇劑，以便產(chǎn)生靜電作用。因?yàn)檫@種較強(qiáng)的遠(yuǎn)距離靜電相互作用，可以促進(jìn)CM-β-CD和β受體阻滯劑最初始的非立體選擇性結(jié)合，有利于接下來的近距離定向立體選擇性相互作用，如氫鍵、π-π相互作用以及β-CD手性空腔包合作用等[26]。此外，CM-β-CD電遷移方向與EOF相反，有利于CM-β-CD和β受體阻滯劑發(fā)生相互作用。如圖6和表1所示，以CM-β-CD為手性選擇劑，本研究成功分離了美托洛爾、阿替洛爾、倍他洛爾和卡拉洛爾對映體，分離度均大于1.5，效果良好。

圖6 阿替洛爾(a)、美托洛爾(b)、倍他洛爾(c)和卡拉洛爾(d)對映體電泳分離圖CM-β-CD濃度: 0.4%;緩沖液: 5 mM磷酸鹽緩沖液(pH5.5); 電壓: 25 kV

參數(shù)對應(yīng)體1t1W1/2H1N1對應(yīng)體 2t2W1/2H2N2RSα阿替洛爾8.70.26217960289.60.28208761781.821.09美托洛爾13.40.394698631115.10.305029141132.851.13倍他洛爾15.10.396171830416.20.43414377861.531.07卡拉洛爾7.30.1344850165938.00.1347868195643.431.11

3 結(jié)論

鑒于手性藥物對映體只表現(xiàn)出旋光性差異，故依靠理化性質(zhì)的傳統(tǒng)分離技術(shù)一般難以拆分。本研究以CM-β-CD為手性選擇劑，運(yùn)用毛細(xì)管電泳技術(shù)成功拆分了5種β受體阻滯劑，并探討分離過程中涉及的作用機(jī)理。本研究在較寬的pH和電壓范圍內(nèi)，添加少量CM-β-CD，獲得了分離度良好、基線平穩(wěn)的手性分離效果，完全分離了5種β受體阻滯劑，并發(fā)現(xiàn)普萘洛爾對映體的分離度和分析時(shí)間與CM-β-CD濃度存在線性關(guān)系。本體系采用非強(qiáng)酸環(huán)境，電滲流大，分析速度快，普萘洛爾、阿替洛爾和卡拉洛爾均可在10分鐘內(nèi)實(shí)現(xiàn)完全分離，美托洛爾和倍他洛爾在20分鐘內(nèi)實(shí)現(xiàn)完全分離。本方法快速、高效、靈活方便，對相關(guān)手性藥物分離研究具有一定的理論和實(shí)際參考價(jià)值。