任 明，劉建民，孫 榮，滕安娜

（1.山東惠仕萊生物科技有限公司，山東 濟南 250101；2.泰山職業(yè)技術(shù)學院 生物技術(shù)工程系，山東 泰安 271000）

橙皮苷是枳實中重要的活性成分之一，屬于黃酮類化合物，其純品為白色針狀晶體，能溶于稀堿和吡啶溶液，常溫下難溶于水，微溶于甲醇、乙醇、冰醋酸，無臭、無味[1]。橙皮苷具有降低血管脆性、降血壓、抗過敏、抑制腫瘤、抗氧化和清除自由基等作用，臨床用于心血管系統(tǒng)疾病的輔助治療，還作為天然抗氧化劑用于食品和化妝品行業(yè)[2-3]。

橙皮苷的提取方法眾多，包括堿提酸沉法、乙醇或甲醇提取法、超聲波輔助提取法、層板法、熱水提取法等，其中堿提酸沉法和熱水提取法操作簡單、提取率較高，是目前工業(yè)化生產(chǎn)橙皮苷的主要方法[4]。但該方法也存在料水比大、污染嚴重、環(huán)保成本高等缺點。

本文首次將復合酶提取法應用于枳實中橙皮苷的提取研究，利用纖維素酶、木聚糖酶、蛋白酶、果膠酶等降解枳實細胞壁及間質(zhì)成分，打開細胞結(jié)構(gòu)對橙皮苷的包裹，促進有效成分的溶出，提高產(chǎn)品收率[5]。并通過正交試驗對復合酶酶解條件進行優(yōu)化，為枳實中橙皮苷的工業(yè)化生產(chǎn)提供新思路。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-20AT高效液相色譜系統(tǒng)（SPD-20A紫外檢測器，CTO-20A柱溫箱，7725i手動進樣器，LCsolution色譜工作站管理軟件，超聲波脫氣裝置等，日本島津公司）；水浴恒溫振蕩器（天津賽得利斯）；PHS-3C型酸度計（上海雷磁）；分析天平（北京賽多利斯）。

1.2 藥品與試劑

橙皮苷對照品（Sigma公司）；川枳實（橙皮苷含量為25.2 %，成都金堂）；生物復合酶為本公司復配制成，包括：40 %酸性纖維素酶（40萬U/g，山東隆科特），40 %木聚糖酶（29萬U/g，山東隆科特），10 %果膠酶（5萬U/g，河南圣斯德），10 %β-葡聚糖酶（3萬U/g，南寧東恒華道），最適pH為4.8；水為重蒸水；甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 橙皮苷檢測

色譜柱：Inertsil ODS-3（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：甲醇-2.5 %乙酸水溶液（40:60）；流速：1 ml/min；柱溫：30 ℃；波長：283 nm。該色譜條件下理論塔板數(shù)以橙皮苷峰計算不低于2000[6]。

2.2 橙皮苷提取

將枳實粉碎后過60目篩，取一定量的枳實加水后用鹽酸調(diào)pH 4.8，加入生物復合酶，水浴恒溫振蕩，酶解完畢后調(diào)pH 12，靜置10 min，定容過濾，取濾液待測[7]。

2.3 橙皮苷收率計算

取濾液1 ml，加50倍體積甲醇，用鹽酸調(diào)pH 7.0，用甲醇定容至100 ml，0.45 μm濾膜過濾，經(jīng)HPLC檢測獲得橙皮苷峰面積，按標準曲線計算提取液中橙皮苷含量，進而計算橙皮苷的收率。橙皮苷收率按以下公式計算。

橙皮苷收率（%）=提取得到的橙皮苷質(zhì)量（g）×100 %／枳實質(zhì)量（g）。

2.4 酶處理條件初步篩選

采用單因素試驗，初步確定最適加酶量、料水比、酶解時間、酶解溫度。

2.4.1 加酶量 稱取枳實10 g，加入100 ml水，調(diào)pH 4.8，分別添加占底物0.1 %，0.5 %，1 %，2 %，5 %的復合酶，同時設置不加酶對照，40 ℃水浴恒溫振蕩6 h。取樣經(jīng)HPLC檢測橙皮苷含量，計算收率，確定最適加酶量。

2.4.2 料水比 稱取枳實10 g，分別加水30，50，80，100，200 ml，調(diào)pH 4.8，按最適加酶量添加復合酶，40 ℃水浴恒溫振蕩6 h。取樣經(jīng)HPLC檢測橙皮苷含量，計算收率。確定最適料水比，即酶解底物濃度。

2.4.3 酶解時間 稱取枳實10 g，按最適料水比加水，調(diào)pH 4.8，按最適加酶量添加復合酶，40 ℃水浴恒溫振蕩，酶解時間分別為1，2，4，6，8，10 h。取樣經(jīng)HPLC檢測橙皮苷含量，計算收率，確定最適酶解時間。

2.4.4 酶解溫度 稱取枳實10 g，按最適料水比加水，調(diào)pH 4.8，按最適加酶量添加復合酶，按最適酶解時間，分別采用20，30，40，50，60 ℃水浴恒溫振蕩。取樣經(jīng)HPLC檢測橙皮苷含量，計算收率。確定最適酶解溫度。

2.5 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，設計了4因素3水平正交試驗，重點研究加酶量、料水比、酶解時間、酶解溫度4個因素對橙皮苷收率的影響，確定枳實酶解的最佳工藝參數(shù)。正交試驗因素水平設計見表1。

表1 正交試驗因素水平設計

3 結(jié)果與分析

3.1 橙皮苷的HPLC測定結(jié)果

配置不同濃度的橙皮苷對照品溶液，按2.1項色譜條件進樣測定，制作橙皮苷對照品標準曲線，以峰面積Y對濃度X（mg/L）進行線性回歸， 得回歸方程：Y=16 746.7X-23 652.7，r=0.9995，線性范圍：10.783～80.902 mg/L。橙皮苷與其他組分分離良好，保留時間為12.753 min。對照品和供試品溶液的HPLC圖譜見圖1～2。

圖1 橙皮苷對照品HPLC圖譜

圖2 橙皮苷提取液HPLC圖譜

3.2 單因素試驗結(jié)果

3.2.1 加酶量 結(jié)果見圖3。酶添加量在0～0.5 %范圍內(nèi)，橙皮苷收率隨酶用量的增加而增大，酶添加量為0.5 %，1 %，2 %時收率相當，當酶添加量大于2 %時，收率反而下降，可能是由于酶相對于底物已達到過飽和，繼續(xù)增加酶用量則會包裹住枳實顆粒，從而阻礙橙皮苷成分的溶出。綜上，從橙皮苷收率和用酶成本綜合考慮，確定加酶量為0.5 %。

圖3 加酶量對橙皮苷收率的影響

3.2.2 料水比 結(jié)果見圖4。料水比為1:5，1:8，1:10時，橙皮苷收率相當，從減少廢水排放角度考慮，確定料水比為1:8。

圖4 料水比對橙皮苷收率的影響

3.2.3 酶解時間 結(jié)果見圖5。酶解時間為4～6 h，收率達到最高。隨著時間的延長，收率反而下降，其可能原因是橙皮苷在長時間的處理下發(fā)生了氧化。因此，從試驗周期和動力消耗方面考慮，選擇酶解時間為4 h。

圖5 酶解時間對橙皮苷收率的影響

3.2.4 酶解溫度 結(jié)果見圖6。橙皮苷收率隨酶解溫度的升高而增大，當酶解溫度達50 ℃后，隨著酶解溫度的進一步升高而呈下降趨勢。這是因為溫度過低，不利于酶活性的發(fā)揮；溫度過高則會引起酶變性、失活。因此確定最適酶解溫度為50 ℃。

圖6 酶解溫度對橙皮苷收率的影響

3.3 正交試驗

在單因素試驗結(jié)果的基礎上，進行了4因素3水平的正交試驗。結(jié)果見表2。4個因素對橙皮苷提取得率的影響大小依次為DABC，即，酶解溫度＞加酶量＞料水比＞酶解時間。其中D、A 為主要影響因素。各因素最佳水平為A2B1C2D3，即加酶量為0.5 %、料水比1:5、酶解時間2 h、酶解溫度50 ℃。在此條件下，經(jīng)過一次提取能將枳實中99.2 %的橙皮苷提取出來。

在優(yōu)化工藝條件下進行了5 次重復試驗驗證，最佳酶解條件下橙皮苷的平均收率為24.9 %，RSD為1.8 %。由此可得，優(yōu)選后的酶解條件穩(wěn)定可行，重復性好。

4 討論

橙皮苷作為一類重要的天然黃酮類化合物，廣泛應用于醫(yī)學、食品、化學、生物學等多個領域[8-10]。目前，從枳實中提取橙皮苷多采用堿提酸沉法，該工藝雖有較高的收率，但存在料水比高、酸堿用量大、提取周期長等問題。本文采用的復合酶法提取工藝，將料水比從1:20降低至1:5，酸堿用量也相應減少75 %，并將傳統(tǒng)的至少3次反復提取減為1次提取。該提取工藝用酶量少，條件溫和易控制，在保證原有收率的基礎上，大大降低了生產(chǎn)的環(huán)保成本，為枳實中橙皮苷提取工藝的改進提供參考依據(jù)。