蔡 爽， 阮成江， 杜 維， 丁 健， 韓 平， 王海明

(生物技術(shù)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大連民族大學(xué)資源植物研究所，遼寧大連 116600)

沙棘(HippophaerhamnoidesL.)為胡頹子科(Elaeagnaceae)沙棘屬落葉灌木或小喬木，主要分布于歐亞大陸的溫帶地區(qū)，是一種珍貴的藥食同源植物[1]。沙棘果實(shí)和葉片富含維生素、氨基酸、微量元素、萜類和黃酮類化合物等生物活性物質(zhì)，其中沙棘黃酮具有降低膽固醉、改善心肌供血狀態(tài)、凈化血液、抗氧化、抗衰老，以及抗腫瘤和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等生理功效及顯著的藥理功能[2 - 3]。

黃酮類化合物種類多，且大多與不同糖結(jié)合形成苷，較難測(cè)定，而建立合理的測(cè)定方法是黃酮類化合物分析的難題[4]。目前常用的黃酮類物質(zhì)測(cè)定方法有分光光度法、高效液相色譜法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)。分光光度法用于測(cè)定黃酮總含量，易受雜質(zhì)干擾致定量準(zhǔn)確性差、重現(xiàn)性低[5]；高效液相色譜法分離度要求高且只能對(duì)少數(shù)幾種黃酮進(jìn)行定量[6]。HPLC-MS/MS法具有檢測(cè)器選擇性強(qiáng)、靈敏度高、抗干擾強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)[7 - 9]，能快速、準(zhǔn)確的定量，利于從植物的提取物中發(fā)現(xiàn)微量目標(biāo)成分[10]；作為一種軟電離的電噴霧離子源，能產(chǎn)生分子和離子碎片來解析化合物結(jié)構(gòu)，現(xiàn)已在鑒定天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)研究中被廣泛應(yīng)用[11 - 12]。采用HPLC-MS/MS法已分別從沙棘葉和果實(shí)中檢測(cè)出的黃酮類物質(zhì)主要有：山奈酚、槲皮素、蘆丁、異鼠李素和柚皮素[13 - 17]，但未見應(yīng)用HPLC-MS/MS同時(shí)檢測(cè)沙棘種子和葉片中黃酮類化合物及其含量的報(bào)道。本研究以14份沙棘樣品(11份種子：新俄、渾金、芬蘭、TF-23、2013-10、34、HS-22、06卷葉、大長果42、向陽Ⅰ和TF2-13；3份葉片：5、7、8)為材料，探索了乙醇提取沙棘種子和葉片中的黃酮類成分的樣品處理方法，建立了HPLC-MS/MS法同時(shí)分離檢測(cè)沙棘種子和葉片中異鼠李素、槲皮素、山奈酚、表沒食子兒茶素、蘆丁、沒食子兒茶素沒食子酸酯、柚皮素、表兒茶素沒食子酸酯、木犀草素、柚皮苷和表兒茶素11種黃酮類物質(zhì)的方法。本方法簡便快速、準(zhǔn)確可靠，可作為一種高通量的快速測(cè)定沙棘種子和葉片中黃酮類化合物的方法，對(duì)沙棘種質(zhì)資源的選擇和開發(fā)利用具有重要意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

API3200三重四極桿質(zhì)譜儀(美國，AB公司)；DGU-20A液相色譜系統(tǒng)(日本，島津公司)；SB52000超聲波清洗機(jī)(寧波新藝超聲波設(shè)備有限公司)。

黃酮類化合物：異鼠李素、槲皮素、山奈酚、表沒食子兒茶素、蘆丁、沒食子兒茶素沒食子酸酯、柚皮素和表兒茶素沒食子酸酯標(biāo)準(zhǔn)品購自上海源葉生物科技有限公司，純度均在99.99%以上；木犀草素、柚皮苷和表兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品購自上海安普實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司，純度均在99.99%以上；無水乙醇為分析純(科密歐)；甲酸和甲醇為色譜純(Honeywell)。

2017年8月，在黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院漿果研究所沙棘種質(zhì)資源圃內(nèi)，分別采收11份沙棘種子樣品及3份沙棘葉片樣品。取樣后經(jīng)液氮冷凍，于-80 ℃保存。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制

精確稱取各標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，溶于5 mL甲醇，配制成1 mg/mL的單標(biāo)儲(chǔ)備液；分別取50 μL各單標(biāo)儲(chǔ)備液于新棕色瓶中，加甲醇稀釋到5 mL，濃度為10 μg/mL；各取50 μL 10 μg/mL的溶液，加甲醇稀釋到5 mL，濃度為0.1 μg/mL，用于優(yōu)化質(zhì)譜條件。單標(biāo)儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋成6個(gè)濃度梯度(10、20、50、100、500、1 000 ng/mL)，配制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用于標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定。

1.3 供試品溶液配制

準(zhǔn)確稱取1～2 g經(jīng)液氮研磨后的樣品粉末，溶于10 mL 75%的乙醇，超聲提取1 h后，離心(4 ℃、4 500 r/min、20 min)，重復(fù)提取2次，合并上清液。上清液用20 mL石油醚反復(fù)萃取除去色素。取0.5 mL萃取溶液，加甲醇定容到5 mL。取1 mL稀釋后的溶液，經(jīng)0.22 μm微孔有機(jī)濾膜過濾，待測(cè)。

1.4 實(shí)驗(yàn)條件

1.4.1 色譜條件色譜柱：島津C18色譜柱(50×2.1 mm，1.9 μm)；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸溶液，B為甲醇；70%B等度洗脫程序，流速為0.2 mL/min；采集時(shí)間為10 min；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為2 μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件電噴霧離子源，負(fù)離子模式(ESI-)；干燥氣(N2)溫度為550 ℃；氣簾氣壓力為30 psi；離子化電壓為-4 500 V；掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式。

2 結(jié)果與討論

2.1 分析方法選擇

分別采用75%、50%和30%乙醇提取沙棘種子和葉片中的黃酮類化合物，再經(jīng)聚酰胺柱凈化，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，采用分光光度法測(cè)定總黃酮含量，所得結(jié)果相差在4.5倍以上。這主要由于分光光度法的前處理過程過長，結(jié)果不穩(wěn)定，很難精確測(cè)定總黃酮含量。本研究建立的方法為：樣品用75%乙醇水解后，經(jīng)超聲提取，再用HPLC-MS/MS法測(cè)定，能同時(shí)快速準(zhǔn)確的定量多種黃酮類物質(zhì)。

2.2 色譜條件優(yōu)化

采用柱長為150 mm的色譜柱，進(jìn)行梯度洗脫，但僅能測(cè)出部分樣品中的部分黃酮成分。為有效進(jìn)行黃酮成分分離，本方法采用柱長為50 mm的色譜柱，各黃酮組分得到了較好分離。流動(dòng)相對(duì)色譜分離效果和被測(cè)物的檢測(cè)靈敏度存在影響。本研究分別對(duì)比了三種流動(dòng)相體系：0.1%甲酸溶液-甲醇、0.1%甲酸溶液-乙醇和0.1%甲酸溶液-水。結(jié)果表明，0.1%甲酸溶液-甲醇作為流動(dòng)相時(shí)色譜峰分離度較好，峰形對(duì)稱，基線平穩(wěn)，保留時(shí)間適中，同時(shí)被檢物檢出限低，最低(柚皮苷)能達(dá)到0.1 μg/L。因此，本方法采用0.1%甲酸溶液-甲醇作為流動(dòng)相，等度洗脫，在此條件下監(jiān)測(cè)得到的11種黃酮的MRM色譜圖質(zhì)量好，清晰度高，如圖1所示。

2.3 質(zhì)譜條件優(yōu)化

電噴霧的“離子霧化”只產(chǎn)生高豐度的準(zhǔn)分子離子峰，既可測(cè)定不穩(wěn)定的極性化合物，又可直接分析混合物；同時(shí)，多電荷離子的形成也可分析大分子量化合物。為獲得二次碎裂產(chǎn)生的子離子，需分別對(duì)母離子進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離。定性離子對(duì)需選擇離子豐度高、基線噪聲低的兩對(duì)離子，其中前者可作定量離子對(duì)；在此基礎(chǔ)上，逐個(gè)優(yōu)化對(duì)靈敏度影響較大的碰撞能量及源內(nèi)碎裂電壓，使選定的子離子組成的特征離子的豐度和比例達(dá)到最佳[4]。質(zhì)譜分析參數(shù)的最終優(yōu)化結(jié)果見表1。

表1 沙棘11種黃酮類化合物的保留時(shí)間及質(zhì)譜分析參數(shù)

(續(xù)表1)

No.NameRetention time(min)Parent ion(m/z)Daughter ion(m/z)Collision energy(eV)Declusteringpotential(V)9Luteolin1.36284.7133.0?135.8-46.4-65.010Naringin0.77579.5150.9?116.0-52.0-80.011L-Epicatechin0.71289.1245.0?123.9-20.0-58.0

*Quantitative ions.

2.4 線性范圍、檢出限和定量限

將質(zhì)量濃度為10、20、50、100、500、1 000 ng/mL的11種混合對(duì)照品溶液分別在最優(yōu)條件下測(cè)定，得出11種物質(zhì)濃度與峰面積的關(guān)系，每個(gè)校準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)r均大于0.99，呈高度線性相關(guān)。以3倍信噪比(S/N=3)和10倍信噪比(S/N=10)分別確定分析方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)。相關(guān)參數(shù)見表2。

2.5 精密度和基質(zhì)效應(yīng)考察

最佳實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)日內(nèi)精密度和日間精密度進(jìn)行考察，每個(gè)濃度水平連續(xù)測(cè)定6次。結(jié)果表明，11種黃酮類化合物的日內(nèi)精密度和日間精密度分別在5.3%和8.0%以下，回收率>90.9%(表2)，滿足定量分析要求。液-質(zhì)聯(lián)用中基質(zhì)效應(yīng)體現(xiàn)在被測(cè)物的離子化程度會(huì)受到樣品中雜質(zhì)的影響，使結(jié)果升高或降低，如雜質(zhì)在某種程度上會(huì)抑制ESI離子源中被測(cè)物的電離[16]?；|(zhì)效應(yīng)強(qiáng)弱的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)是將被測(cè)物標(biāo)準(zhǔn)品加入到不含被測(cè)物成分的樣本中測(cè)定，與預(yù)期結(jié)果相比，觀察測(cè)定數(shù)據(jù)變化[17 - 18]。本研究采用處理后加標(biāo)法考察基質(zhì)效應(yīng)，異鼠李素、蘆丁和表兒茶素沒食子酸酯的加標(biāo)回收率范圍在90.9%～100.2%，接近100%，說明基質(zhì)對(duì)這3種黃酮成分的抑制效應(yīng)很弱。表兒茶素和槲皮素的加標(biāo)回收率分別為90.9%和91.85%，表明這2種黃酮組分受基質(zhì)抑制作用相對(duì)較強(qiáng)。其他7種黃酮組分的加標(biāo)回收率范圍在94.25%～97.6%之間，抑制作用較弱。結(jié)果表明，基質(zhì)對(duì)大部分黃酮成分有較低抑制效應(yīng)，且效應(yīng)不明顯。這可能由于各物質(zhì)已充分分離或樣品稀釋倍數(shù)較大，所以目標(biāo)物質(zhì)的定量不受基質(zhì)影響。

表2 11種黃酮類化合物的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限(LODs)、定量限(LOQs)和精密度

Note：1:isorhamnetin;2:quercetin;3:kaempferol;4:(-)-epigallocatechin;5:rutin;6:(-)-gallocatechingallate;7:naringenin;8:(-)-epicatechingallate;9:luteolin;10:naringin;11:L-epicatechin.

2.6 方法的實(shí)際應(yīng)用

采用本研究建立的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)沙棘種子和葉片中11種黃酮類化合物，檢測(cè)結(jié)果表明，不同種質(zhì)種子和種質(zhì)葉片中的不同黃酮類化合物間存在明顯差異。沙棘葉片中檢測(cè)出了除柚皮素外的10種黃酮類化合物，種子中檢測(cè)出了除山奈酚外的10種黃酮類化合物，結(jié)果見表3。

表3 11份沙棘種子中的10種黃酮類成分含量(μg/g)

Note：1:isorhamnetin;2:quercetin;3:(-)-epigallocatechin;4:rutin;5:(-)-gallocatechingallate;6:naringenin;7:(-)-epicatechingallate;8:luteolin;9:naringin;10:L-epicatechin； “-”:undetected；Totalcontent：sumofcontentsoftenflavonoids；Totalcontentofmailflavonoids:sumofcontentsof(-)-gallocatechingallate,(-)-epicatechingallate,rutinandquercetin.

3 結(jié)論

本研究建立了一種基于高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定沙棘種子和葉子中11種黃酮物質(zhì)的定量分析方法。將所建立的方法用于11份沙棘種質(zhì)樣品分析發(fā)現(xiàn)，不同種質(zhì)不同器官之間的黃酮類物質(zhì)含量相差很大，葉片中10種黃酮總含量明顯高于種子。本方法簡便快速、準(zhǔn)確可靠、覆蓋面廣，可作為一種高通量快速測(cè)定沙棘種子和葉片中黃酮類化合物的方法，對(duì)沙棘種質(zhì)資源的選擇和開發(fā)利用具有重要意義。