林子根，井維鑫，王 蘭

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太原 030006）

銅（Copper，Cu）是機(jī)體必需的微量元素之一[1]，是超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、細(xì)胞色素c氧化酶（Cytochrome c oxidase）、銅氧化酶（Ceruloplasmin）等許多抗氧化酶的輔因子，且具有促進(jìn)機(jī)體造血、加快生長(zhǎng)繁殖和增強(qiáng)機(jī)體免疫力的功能[2]。然而，過(guò)多的Cu可誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生大量活性氧（Reactive oxygen species，ROS），引起生物膜損傷、蛋白質(zhì)變性、酶失活及DNA突變[3-4]。

近年來(lái)，巢湖、太湖、鄱陽(yáng)湖Cu污染均已達(dá)中度以上水平，其污染來(lái)源主要是采礦廢水、化肥施用等[5-7]。研究表明，Cu可通過(guò)呼吸、進(jìn)食和體表滲透等途徑被水生動(dòng)物吸收[1]，對(duì)水生動(dòng)物的毒性較哺乳動(dòng)物更大[8-9]。貝類(lèi)被認(rèn)為是監(jiān)測(cè)水體重金屬污染的理想指示生物[10-11]，其體內(nèi)的抗氧化酶及小分子抗氧化劑可作為生物標(biāo)志物用來(lái)監(jiān)測(cè)和評(píng)價(jià)水體Cu等重金屬的污染程度[12-15]。

背角無(wú)齒蚌（Anodonta woodiana）是在我國(guó)分布廣泛的淡水蚌，對(duì)Cu具有較強(qiáng)的富集能力[16]，曾作為指示生物用于太湖五里湖重金屬污染監(jiān)測(cè)評(píng)估[17]。然而，有關(guān)Cu對(duì)背角無(wú)齒蚌毒性的研究較少，且鰓是重金屬蓄積的重要靶器官[15]。因此，本研究通過(guò)檢測(cè)亞慢性Cu2+暴露后背角無(wú)齒蚌鰓中抗氧化指標(biāo)，包括超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶（Catalase，CAT）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（Glutathione peroxidase，GPx）和谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶（Glutathione S-transferase，GST）活性，還原型谷胱甘肽（Reduced glutathione，GSH）和丙二醛（Malondialdehyde，MDA）的含量及總抗氧化能力（Total antioxidant capacity，T-AOC）水平，篩選可指示Cu污染的合適的生物標(biāo)志物，為背角無(wú)齒蚌用于淡水Cu污染監(jiān)測(cè)和評(píng)估提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用背角無(wú)齒蚌（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“河蚌”）購(gòu)自湖南省郴州市蘇仙區(qū)棲鳳渡鎮(zhèn)水產(chǎn)市場(chǎng)，將其置于盛有曝氣48 h以上自來(lái)水（pH 6.8，溶氧6.0～6.3 mg·L-1，水溫20±2℃）的塑料箱（長(zhǎng)×寬×高為60 cm×42 cm×35 cm）中暫養(yǎng)3周，馴養(yǎng)期間每2 d換1次水，每日每只河蚌喂3.5×104個(gè)小球藻，并維持室溫20℃左右。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 主要儀器及試劑

儀器:高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf，5804R型），電動(dòng)勻漿儀（FLUKO，F(xiàn)6/10型），電熱恒溫水浴鍋（Eppendorf，HHS型），多功能酶標(biāo)儀（SpectraMax M5型）。

試劑:氯化銅（CuCl2·2H2O，分析純）、氯化鈉（NaCl，分析純），蛋白定量測(cè)定試劑盒，SOD、CAT、GPx、GST測(cè)定試劑盒，GSH和MDA含量測(cè)定試劑盒，T-AOC測(cè)定試劑盒，均購(gòu)于南京建成生物工程所。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

稱(chēng)取5.884 g CuCl2·2H2O于小燒杯中，加入200 mL雙蒸水充分溶解配制10 955 mg·L-1的Cu2+母液。根據(jù)Cu2+對(duì)河蚌96 h的LC50（109.55 mg·L-1）設(shè)置3個(gè)Cu2+（0.137、0.548、2.192 mg·L-1）暴露組和1個(gè)空白對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行28 d。選取個(gè)體大小相近（殼長(zhǎng)6.4±2.7 cm、殼寬4.0±1.7 cm、殼頂高2.2±2.0 cm）的河蚌分別置于4個(gè)塑料箱（長(zhǎng)×寬×高為51 cm×35 cm×30 cm）中，每箱隨機(jī)投放20只，對(duì)照組加入20 L曝氣48 h以上的自來(lái)水，暴露組加入20 L不同濃度的Cu2+溶液。暴露期間與馴養(yǎng)期間飼養(yǎng)條件保持一致。定時(shí)檢查河蚌的死亡情況（本實(shí)驗(yàn)期間河蚌死亡率為87.5%），并及時(shí)挑出死亡個(gè)體。每組設(shè)4個(gè)平行。

1.2.3 樣品制備

Cu2+暴露7、14、21、28 d后，每組隨機(jī)取4只河蚌置于冰上，迅速剖取其鰓組織約0.1 g（稱(chēng)質(zhì)量前用濾紙吸凈組織表面水分），置于離心管中，用液氮速凍后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫冰箱待測(cè)。按質(zhì)量∶體積為1∶4的比例加入預(yù)冷的生理鹽水，在冰上用電動(dòng)勻漿器（FLUKO，F(xiàn)6/10型）制備勻漿，然后4℃下2800 r·min-1離心10 min，取其上清液暫置于冰上。

1.2.4 測(cè)定方法

用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定組織蛋白含量，羥胺法測(cè)定組織SOD活力，可見(jiàn)光法測(cè)定CAT活力，比色法測(cè)定GPx和GST活力，TBA法測(cè)定MDA含量，微板法測(cè)定GSH含量，F(xiàn)RAP法測(cè)定T-AOC。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 18.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），運(yùn)用Duncan法比較各暴露組和對(duì)照組間的差異，組間不同字母表示差異顯著（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cu2+暴露對(duì)河蚌鰓SOD活性的影響

如圖1所示，隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，各暴露組河蚌SOD活性均表現(xiàn)為“誘導(dǎo)-恢復(fù)-誘導(dǎo)”的變化趨勢(shì)。其中，低、中濃度組SOD活性在Cu2+暴露14 d以及高濃度組SOD活性在Cu2+暴露21 d時(shí)恢復(fù)到對(duì)照組水平。在Cu2+暴露28 d時(shí)，隨著Cu2+濃度的增加，SOD活性先升高后降低，且均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。

2.2 Cu2+暴露對(duì)河蚌鰓CAT活性的影響

由圖2可知，經(jīng)Cu2+暴露后，除高濃度組Cu2+暴露28 d CAT活性較對(duì)照組無(wú)顯著差異外，其余各組與對(duì)照組相比均被顯著抑制（P＜0.05）。從Cu2+暴露7 d到14 d，中濃度組CAT活性下降，從Cu2+暴露21 d到28 d，中濃度組CAT活性上升。

2.3 Cu2+暴露對(duì)河蚌鰓GPx活性的影響

由圖3可知，經(jīng)Cu2+暴露后，河蚌鰓GPx活性較對(duì)照組被顯著誘導(dǎo)（P＜0.05）。低、高濃度組GPx活性隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢(shì)，且各暴露組GPx活性均在Cu2+暴露28 d時(shí)達(dá)到最低，但仍顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。Cu2+暴露7、21、28 d時(shí)，中、高濃度組GPx活性較低濃度組均顯著降低（P＜0.05）。

圖1 Cu2+對(duì)背角無(wú)齒蚌鰓組織SOD活性的影響Figure 1 Effect of Cu2+on SOD activities in gills of A.woodiana

圖2 Cu2+對(duì)背角無(wú)齒蚌鰓組織CAT活性的影響Figure 2 Effect of Cu2+on CAT activities in gills of A.woodiana

2.4 Cu2+暴露對(duì)河蚌鰓GST活性的影響

如圖4所示，經(jīng)Cu2+暴露后，河蚌鰓GST活性較對(duì)照組被顯著誘導(dǎo)（P＜0.05）。隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，低濃度組GST活性無(wú)顯著變化，中濃度組GST活性顯著降低，高濃度組GST活性先升高后降低，且中、高濃度組GST活性均在Cu2+暴露28 d時(shí)達(dá)到最低，但仍顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。Cu2+暴露21、28 d時(shí)，中、高濃度組GPx活性較低濃度組均顯著下降（P＜0.05）。

2.5 Cu2+暴露對(duì)河蚌鰓GSH含量的影響

由圖5可知，經(jīng)Cu2+暴露后，河蚌鰓GSH含量較對(duì)照組顯著降低（P＜0.05）。低、中濃度組GSH含量隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)均先升高后降低，且均在Cu2+暴露28 d時(shí)達(dá)到最低。Cu2+暴露7、21、28 d時(shí)，高濃度組GSH含量均顯著高于低濃度組（P＜0.05）。

2.6 Cu2+暴露對(duì)河蚌鰓T-AOC的影響

如圖6所示，Cu2+暴露14、21、28 d時(shí)，河蚌鰓TAOC較對(duì)照組均顯著升高（P＜0.05），且各暴露組TAOC隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)均有所上升。Cu2+暴露21、28 d時(shí)，隨著Cu2+濃度的增加，T-AOC均先升后降，但均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。

圖3 Cu2+對(duì)背角無(wú)齒蚌鰓組織GPx活性的影響Figure 3 Effect of Cu2+on GPx activities in gills of A.woodiana

圖4 Cu2+對(duì)背角無(wú)齒蚌鰓組織GST活性的影響Figure 4 Effect of Cu2+on GST activities in gills of A.woodiana

2.7 Cu2+暴露對(duì)河蚌鰓MDA含量的影響

由圖 7可知，Cu2+暴露 14、21、28 d時(shí)，河蚌鰓MDA含量較對(duì)照組均顯著升高（P＜0.05）。各暴露組MDA含量均隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)而上升。Cu2+暴露14、21、28 d時(shí)，高濃度組MDA含量較低、中濃度組均顯著升高（P＜0.05）。

圖5 Cu2+對(duì)背角無(wú)齒蚌鰓組織GSH含量的影響Figure 5 Effect of Cu2+on GSH content in gills of A.woodiana

圖6 Cu2+對(duì)背角無(wú)齒蚌鰓組織T-AOC的影響Figure 6 Effect of Cu2+on T-AOC in gills of A.woodiana

圖7 Cu2+對(duì)背角無(wú)齒蚌鰓組織MDA含量的影響Figure 7 Effect of Cu2+on MDA content in gills of A.woodiana

3 討論

SOD是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，可清除生物體內(nèi)超氧陰離子（Superoxide anion，O-·2）[18]。CAT是一種主要存在于生物線(xiàn)粒體和過(guò)氧化物酶體中富含巰基的氧化還原酶，可直接快速催化分解過(guò)氧化氫（Hydrogen peroxide，H2O2）轉(zhuǎn)化為水和氧氣[19]。兩者共同組成機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的第一道防線(xiàn)[20]。有研究報(bào)道，厚殼貽貝（Mytilus coruscus）和河蜆（Corbicula fluminea）經(jīng)Cu2+暴露后，其鰓SOD活性均被顯著誘導(dǎo)[21-22]。在本研究中，背角無(wú)齒蚌鰓SOD活性在Cu2+暴露下也被誘導(dǎo)，可能是因?yàn)檫M(jìn)入鰓中的Cu2+誘發(fā)產(chǎn)生的O-2·促使SOD基因的表達(dá)上調(diào)，SOD蛋白的合成增加，酶活水平上升[23-24]。Cu2+暴露28 d時(shí)，各暴露組SOD活性均顯著高于對(duì)照組，但高濃度組SOD活性較中濃度組顯著降低，這與對(duì)葡萄牙牡蠣（Crassostrea angulata）研究所得到的結(jié)果類(lèi)似[25]?？赡苡捎谠陂L(zhǎng)時(shí)間高濃度Cu2+暴露下，背角無(wú)齒蚌鰓中產(chǎn)生了大量金屬硫蛋白（Metallothionein，MT），MT可直接快速與Cu2+結(jié)合來(lái)解毒重金屬，使O-2·生成量減少，以O(shè)-2·為底物的SOD活性下降[26]，隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，各暴露組SOD活性均呈現(xiàn)“誘導(dǎo)-恢復(fù)-誘導(dǎo)”的變化趨勢(shì)，表明Cu2+暴露期間，背角無(wú)齒蚌鰓中O-2·生成量處于波動(dòng)狀態(tài)，受機(jī)體抗氧化系統(tǒng)動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)。經(jīng)Cu2+暴露后，背角無(wú)齒蚌鰓CAT活性受到抑制，這與對(duì)厚殼貽貝的研究結(jié)果一致[21]?？赡苡捎诒辰菬o(wú)齒蚌鰓中積蓄的Cu2+在參與機(jī)體內(nèi)氧化還原反應(yīng)（例如，芬頓反應(yīng)）的過(guò)程中轉(zhuǎn)化為Cu+，而Cu+又可與H2O2反應(yīng)生成羥自由基，使得機(jī)體H2O2的含量降低，由于底物濃度的降低，引起CAT活性下降[27-28]。隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，中濃度組CAT活性先降后升，但均顯著低于對(duì)照組，這可能與中濃度組SOD活性變化有關(guān)。從Cu2+暴露7 d到14 d，中濃度組SOD活性下降，H2O2生成量的減少不足以為CAT提供底物，使CAT活性降低；從Cu2+暴露21 d到28 d，中濃度組SOD活性上升，H2O2生成量增加，CAT活性上升[26]。

GPx在H2O2存在的情況下，可促進(jìn)H2O2與GSH反應(yīng)生成水及氧化型谷胱甘肽（Oxidized glutathione，GSSG）[29]。GST是機(jī)體內(nèi)具有清除有機(jī)過(guò)氧化物和解毒雙重功能的酶，可催化某些外源有害物質(zhì)的親電子基團(tuán)與GSH的巰基偶聯(lián)，增強(qiáng)外源毒物疏水性，使其易于被分解排出體外，從而發(fā)揮解毒作用以保護(hù)機(jī)體細(xì)胞免受毒害[29-30]。GSH是機(jī)體內(nèi)的非蛋白巰基化合物，具有清除自由基、解毒、維持紅細(xì)胞膜完整性等多種重要生理功能[31]。研究發(fā)現(xiàn)，河蜆及淡水貝Anodonta anatina經(jīng)Cu2+暴露后，其鰓GPx活性均被誘導(dǎo)[32-33]；菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum）和翡翠貽貝（Perna viridis）經(jīng)Cu2+暴露后，其鰓GST活性均被誘導(dǎo)[34-35]。在本研究中，經(jīng)Cu2+暴露后，背角無(wú)齒蚌鰓GPx活性被顯著誘導(dǎo)，推測(cè)這可能是機(jī)體對(duì)CAT活性受到抑制作出代償性調(diào)節(jié)的表現(xiàn)[36]。背角無(wú)齒蚌鰓GST活性在Cu2+暴露下也被顯著誘導(dǎo)，可能由于在Cu2+刺激下，GST基因表達(dá)上調(diào)，GST蛋白合成量增加，酶活水平升高[37]，加快催化了Cu2+與GSH的巰基相結(jié)合，從而達(dá)到解毒目的[30-31]。然而，經(jīng)Cu2+暴露后，背角無(wú)齒蚌鰓GSH含量顯著降低，這與對(duì)背角無(wú)齒蚌進(jìn)行急性鎘暴露實(shí)驗(yàn)所得出的結(jié)果一致[38]?？赡苁且?yàn)镚SH一方面在GPx的催化下還原H2O2，并在此過(guò)程中最終轉(zhuǎn)化為GSSG[29]，另一方面在GST催化下通過(guò)自身分子中的巰基或肽鍵等結(jié)構(gòu)綁定結(jié)合重金屬，從而降低重金屬毒性[30-31]。GSH作為GPx和GST兩種酶的共同底物，在GPx和GST兩者活性均被顯著誘導(dǎo)的情況下被大量消耗。Cu2+暴露7、21、28 d，各暴露組GPx和GST活性均顯著高于對(duì)照組，GSH含量顯著低于對(duì)照組，高濃度組GPx和GST活性較低濃度組顯著降低而高濃度組GSH含量較低濃度組顯著上升，可能是因?yàn)楫?dāng)Cu2+濃度升高到超出機(jī)體調(diào)節(jié)能力范圍時(shí)，機(jī)體內(nèi)ROS的產(chǎn)生與消除間的動(dòng)態(tài)平衡被打破，ROS不斷增加，機(jī)體細(xì)胞毒性反應(yīng)加重，酶合成受阻，GPx和GST兩者活性下降，GSH消耗減少，GSH 含量回升[27，31]。

T-AOC是衡量機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)與非酶促系統(tǒng)整體功能狀態(tài)的綜合性指標(biāo)，表現(xiàn)為機(jī)體內(nèi)各種抗氧化大分子、小分子和酶的總體水平[39-40]。本研究結(jié)果顯示，Cu2+暴露14、21、28 d，背角無(wú)齒蚌鰓T-AOC較對(duì)照組均顯著升高，且隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，各暴露組T-AOC均有所上升，表明隨Cu2+暴露時(shí)間延長(zhǎng)，背角無(wú)齒蚌鰓中產(chǎn)生較為劇烈的氧化應(yīng)激反應(yīng)，TAOC適應(yīng)性增高[41]。在對(duì)美麗蚌（Lampsilis siliquoidea）和三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）的研究中也得到了類(lèi)似的結(jié)果[42-43]。

MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的重要產(chǎn)物之一，其含量?？芍苯臃从硻C(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，間接反映出細(xì)胞損傷的程度[44]。研究表明，ROS可攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化物，從而對(duì)細(xì)胞造成損傷[2]。本研究發(fā)現(xiàn)，Cu2+暴露14、21、28 d，背角無(wú)齒蚌鰓MDA含量較對(duì)照組均顯著升高，且隨Cu2+濃度增加和暴露時(shí)間延長(zhǎng)，MDA含量逐漸上升，表現(xiàn)出明顯的“劑量-效應(yīng)”和“時(shí)間-效應(yīng)”關(guān)系，類(lèi)似的結(jié)果在對(duì)紫貽貝（Mytilus galloprovinciali）和溝紋蛤仔（Ruditapes decussatus）的研究中也被發(fā)現(xiàn)[40，45]?？赡苡捎谠陂L(zhǎng)時(shí)間高濃度Cu2+暴露下，背角無(wú)齒蚌鰓中ROS累積超過(guò)一定限度，盡管機(jī)體充分調(diào)動(dòng)抗氧化系統(tǒng)來(lái)應(yīng)對(duì)Cu2+引起的氧化脅迫，但仍不足以保護(hù)鰓免受氧化損傷，脂質(zhì)過(guò)氧化程度加深。

4 結(jié)論

（1）亞慢性Cu2+暴露對(duì)背角無(wú)齒蚌鰓SOD、GPx、GST活性均有誘導(dǎo)作用，對(duì)CAT活性有抑制作用。背角無(wú)齒蚌鰓抗氧化系統(tǒng)在Cu2+暴露下被激活，但仍受到了氧化損傷。

（2）背角無(wú)齒蚌鰓中GPx、GST和GSH對(duì)Cu2+暴露響應(yīng)最為靈敏，可以作為生物標(biāo)志物用于水體Cu污染的監(jiān)測(cè)和評(píng)估。