鄧曉瑜 張倩倩 侯鳳春 徐山山 張帆 于艷玲

隨著人們生活水平和美觀意識的不斷提高，成年人正畸治療需求量日益增加[1]。無托槽隱形矯治作為正畸學領域出現(xiàn)的一種新興的治療理念和技術，更順應了人們追求美觀、舒適、健康的現(xiàn)代治療觀念[2-3]。Karkhanechi等[4]研究表明，隱形矯治技術不存在托槽，弓絲等復雜的裝置，口腔衛(wèi)生維護相對比較好，對牙周健康更具有優(yōu)勢。但是一體化覆蓋于牙面改變了齦上菌斑的生存環(huán)境，也可能對牙周健康存在一定程度的影響。所以本實驗通過隱形矯治和固定矯治的牙周指數(shù)及牙周菌群的對比，探討兩種不同的矯治技術對牙周健康的影響是否存在差異。

1 資料與方法

1.1 病例選擇

納入2017-06～2018-05青島市口腔醫(yī)院正畸科患者60 例。30 例固定矯治患者為A組，采用Gemini MBT金屬正畸托槽(3M， 美國)，男性13 例，女性17 例， 平均年齡(25±5.3) 歲； 30 例無托槽隱形矯治患者為B組， 采用Invisalign隱形矯治器(Align Technology公司， 美國)，男性16 例， 女性14 例，平均年齡(30±8.6) 歲。

納入標準：①患者年齡18～35 歲；②下前牙無擁擠或輕度擁擠，正畸治療前均無齲齒或齲齒已充填；③牙齦色形質(zhì)正常，無附著喪失，正畸治療前均進行齦上潔治術； ④所有受試者均進行相同的口腔衛(wèi)生宣教，能嚴格遵守早晚刷牙，刷牙時間不少于 5 min； ⑤無全身系統(tǒng)性疾病，女性患者非妊娠或哺乳期；實驗前3 個月內(nèi)未服用激素或抗菌藥物；⑥經(jīng)患者本人同意試驗且能按時復診者。

1.2 臨床牙周檢查

由同1 名接受過專業(yè)培訓的牙周醫(yī)師分別對治療前，治療3 個月，治療6 個月的牙周指數(shù)進行檢測，對所有受試者的4 顆下頜中切牙，每顆牙3 個位點(包括近中頰點，正中位點，遠中頰點)共12 個位點進行檢查，每個位點測量3 次取平均值，個人記數(shù)為12 個位點記數(shù)的平均值。檢測指標包括牙齦菌斑指數(shù)(plaque index，PLI)，探診深度 (probing depth，PD)和牙齦指數(shù)(gingival index，GI)，方法參照《臨床牙周病學》第2版[5]。

1.3 實驗方法

1.3.1 標本采集 齦溝液樣本的收集：每位受檢者復診前常規(guī)BASS法刷牙，棉卷隔濕，吹干牙面，將無菌紙尖伸入齦溝內(nèi)，插入至有阻力，靜置35 s后取出放入1.5 ml EP管中，加入1ml PBS溶液后保存在-20 ℃凍存，受血漬和唾液污染則棄之。

1.3.2 標準菌株及齦溝液 DNA提取 按照天根細菌基因組DNA提取試劑盒操作說明進行齦溝液樣品中細菌基因組DNA的提取。用超微量UV/可見光分光光度計對樣品濃度及純度進行測定。

1.3.3 實時熒光定量PCR檢測 首先根據(jù)牙齦卟啉單胞菌(NR_074234)(Porphyromonasgingivalis,Pg)、福賽坦氏菌(NR_074140)(Tannerellaforsythiain,Tf)16S rRNA序列的可變區(qū)設計其各自的特異引物，同時參考熒光假單胞菌、副溶血弧菌、大腸桿菌等細菌16S rRNA序列的保守區(qū)設計細菌的通用引物。經(jīng)序列分析及預實驗溶解曲線分析，引物具有良好的特異性，合成引物序列見表 1。

表 1 引物序列

其次，采用實用熒光定量PCR儀(ThermoFisher, Pikoreal96， 美國)進行定量檢測， 10 μl反應體系包括2×的反應預混液5 μl， 上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μl， 模板1 μl， 水3.2 μl； 反應程序： 95 ℃ 7 min； (95 ℃ 5 s， 60 ℃ 30 s， 收集熒光信號)40 個循環(huán)； 60 ℃ 30 s； 60～95 ℃(0.2 ℃/s)逐漸升溫收集溶解曲線熒光信號； 20 ℃ 10 s。

最后繪制標準曲線：分別將通用菌、Pg及Tf的標準品DNA按10 倍梯度進行系列稀釋，作為熒光定量PCR實驗繪制標準曲線的陽性模板。將標準品與待測樣品同時進行熒光定量PCR反應，以不同濃度陽性模板的拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標，以PCR反應過程中出現(xiàn)熒光信號的初始循環(huán)數(shù)(Cq)為縱坐標繪制標準曲線。將待測樣品的Cq值帶入標準曲線獲得其拷貝數(shù)。每個樣本檢測設3 個復孔。

1.4 統(tǒng)計學方法

用SAS 9.2統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，以P=0.05為檢驗標準?；颊叽魅氤C治器前測量的數(shù)據(jù)作為基線，組內(nèi)比較臨床牙周指數(shù)、Pg和Tf構成比在不同觀測點的變化，進行方差分析及多重比較；組間對比不同時間點的各項檢測結果，采用t檢驗進行對比分析。

2 結 果

2.1 臨床牙周指數(shù)的檢查結果

治療前A組和B組的口腔衛(wèi)生良好，牙齦邊緣無明顯菌斑，牙齦健康，牙周探針深度小于2 mm， 2 組的牙周指數(shù)(PLI、 GI、 PD)無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；在治療3 個月， 2 組的下切牙近齦緣區(qū)可見不同程度的菌斑堆積，牙齦色澤的改變，牙周探診深度增加但小于2 mm， B組牙周指數(shù)在各個時期均低于實驗A組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)； 治療6 個月，A組的牙周指數(shù)持續(xù)上升， B組的部分牙周指數(shù)呈下降趨勢， B組的指數(shù)均低于A組，PD差異顯著性意義(P<0.01)(表 2～4)。

2.2 Pg和Tf的檢查結果

治療前， 組間對比Pg和Tf的構成比， 差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)； 治療3 個月， B組的Pg構成比低于實驗A組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，Tf的構成比無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；治療6 個月，組間對比Pg和Tf的構成比均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

表 2 T0期2 組牙周指數(shù)比較

表 3 T3期2 組牙周指數(shù)比較

表 4 T6期2 組牙周指數(shù)比較

組內(nèi)不同時間點對比，A組的Pg的構成比在治療3 個月達到高峰，隨著時間延長在治療6 個月呈下降趨勢，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)； B組的Pg的構成比變化不明顯，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)； A組和B組Tf的構成比均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(表 5～6)。

3 討 論

對于正畸治療是否會造成牙周的損害一直存在較大爭議。Levrini等[6]認為缺乏證據(jù)證明正畸治療會對牙周健康造成一定的影響，但是Harradine[7]表明固定矯治裝置會改變口腔微生態(tài)環(huán)境，增加牙周炎的風險。Lu等[8]認為隱形矯治比固定矯治更有利于維護牙周健康，牙齒更接近整體運動，可以防止齦上菌斑從牙齦轉移到齦下破壞牙周組織。本實驗選擇兩組不同矯治器的患者，口腔衛(wèi)生狀況和依從性良好，排除青春期激素水平和各種社會環(huán)境等影響牙周健康的因素，以增加試驗數(shù)據(jù)的可靠性。

表 5 Pg百分含量方差分析表

表 6 Tf百分含量方差分析表

牙菌斑生物膜是牙周病最主要的致病因素，菌斑的細菌及其產(chǎn)物是引發(fā)牙周病必不可少的始動因子[9]。Pg是牙周炎病變區(qū)中最主要的優(yōu)勢菌群，Tf常在重度牙周炎附著喪失處的齦下菌斑中檢出，且與Pg存在著共生關系。隨著齦下菌斑中革蘭陰性厭氧菌種類和數(shù)量的增多，機體免疫的抵抗與修復同細菌破環(huán)之間的平衡被打破，繼而出現(xiàn)牙齦炎癥，甚至向下破壞導致牙周附著喪失[10]。因此，對于細菌的檢測是非常有必要的[11]。聚合酶鏈反應(PCR)是通過酶促反應在體外擴增特異DNA片段的一種技術方法，可直接用于菌斑、齦溝液、唾液或牙周組織樣本微生物的微量DNA檢測[12]，應用敏感性和特異性高的DNA技術,在超過1/3的個體中可檢測到Pg等牙周可疑致病菌[12-13]。而傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)法研究低估了牙周致病菌的發(fā)生率， 限制了臨床的應用[9]。

本實驗研究結果顯示，無論是固定矯治還是隱形矯治的牙周指數(shù)均隨著矯治的開始而逐漸上升，到3 個月時達到高峰，并在之后的矯治中維持治療前的水平或略降低。Lindel等[14]研究表明初戴矯治器時，矯治器周圍會形成初始生物膜，宿主產(chǎn)生免疫反應，牙齒在受到持續(xù)力的作用下會發(fā)生一過性的牙齦炎癥，導致臨床牙周指數(shù)值升高。同時也可以看到A組的Pg的構成比也在矯治3 個月達到高峰，之后呈下降趨勢。這說明Pg的構成比與牙周指數(shù)呈正相關。Kawada等[15]應用定量PCR方法同樣也發(fā)現(xiàn)Pg數(shù)量隨牙周指數(shù)的升高而增加。從臨床試驗觀察，固定矯治器等復雜裝置還是會影響牙齒的自潔，容易堆積菌斑，但是隨著每次復診口腔衛(wèi)生的深入指導， A組在第6 個月時，細菌的構成比和牙周指數(shù)降低或維持穩(wěn)定。B組的Pg構成比隨著時間延長變化不顯著，在治療3個月呈略微降低趨勢，更加說明隱形矯治可摘戴的方式有利于患者自潔，這也跟患者更加注重刷牙，使用牙線等維護口腔健康的方式有關。 2 組的Tf的構成比變化不顯著，無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，有研究表明Tf常常出現(xiàn)在嚴重的牙周炎患者中，說明2 種矯治器在維護良好的口腔衛(wèi)生條件下并沒有對牙周組織造成不可逆的損害[16-17]。

綜上，本實驗通過了牙周致病菌的檢測，發(fā)現(xiàn)兩種矯治方式在第6 個月和矯治前相比牙周狀況較穩(wěn)定，說明牙周定植菌和宿主固有免疫之間達到了動態(tài)平衡，也可能由于牙齒排齊更有利于口腔衛(wèi)生的; 2 組患者在重視口腔衛(wèi)生的情況下，兩種矯治方式均能維持牙周的健康。從牙周指數(shù)及菌群變化看出，固定矯治器第3 個月達到高峰，隱形矯治變化不顯著，說明隱形矯治更有利于口腔衛(wèi)生的維護。