壽艷紅 張臻 駱肖群 陳圣安 李峰 朱小華 林盡染 秦海紅 杜鵑 陳蓀奕 楊永生 徐金華
復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院皮膚科,上海 200040
程序性壞死是一種可調(diào)控的胱天蛋白酶(caspase)非依賴性細(xì)胞程序性死亡方式,細(xì)胞呈壞死樣結(jié)構(gòu)特點(diǎn)[1]。以往研究證實(shí),腫瘤壞死因子α(TNF-α)誘導(dǎo)的程序性壞死可發(fā)生在小鼠成纖維細(xì)胞L929、人組織淋巴瘤細(xì)胞U937 和Fas 相關(guān)死亡域蛋白缺陷型人白血病T 細(xì)胞系Jurkat 細(xì)胞中[2-4],干擾素γ(IFN-γ)和TNF 相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)可分別誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞和小鼠胚胎成纖維細(xì)胞程序性壞死[2,5]。較為公認(rèn)的機(jī)制是受體相互作用蛋白1(receptor interaction protein kinase 1,RIP1)/RIP3/混合系激酶區(qū)域樣蛋白(mixed lineage kinase domainlike protein,MLKL)通路傳遞死亡信號,活性氧參與死亡執(zhí)行[6-7]。關(guān)于角質(zhì)形成細(xì)胞(keratinocyte,KC)的程序性壞死研究較少,主要集中于中毒性表皮壞死松解癥(TEN)和Stevens-Johnson 綜合征(SJS)的發(fā)病機(jī)制研究[8-9]。TEN/SJS 是以 KC 廣泛性壞死為特征的疾病,Saito等[9]用電鏡發(fā)現(xiàn)TEN患者中KC 發(fā)生的壞死是程序性壞死,小鼠實(shí)驗(yàn)中通過抑制程序性壞死可以完全阻斷TEN 樣病變也證明了這一點(diǎn)。此外,以往研究證實(shí),IFN-γ 在TEN患者皰液和外周血中濃度升高[7,10]。de Araujo等[11]還發(fā)現(xiàn),皰液中TRAIL濃度有明顯升高。由此我們推測,IFN-γ 和 TRAIL 是 SJS/TEN 發(fā)病中重要的細(xì)胞因子,因此我們探索應(yīng)用IFN-γ 和TRAIL 誘導(dǎo)KC 程序性壞死,探討程序性壞死在TEN/SJS 發(fā)病機(jī)制及治療中的作用。
HaCaT 細(xì)胞來自美國ATCC 細(xì)胞庫;高糖DMEM、胎牛血清、0.25%胰酶產(chǎn)自美國Gibco公司;細(xì)胞凋亡檢測試劑盒產(chǎn)自美國BD 公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒產(chǎn)自日本TaKaRa公司;RIP3、MLKL 引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成;兔抗人RIP1、RIP3、MLKL和磷酸化 RIP1(pRIP1)、RIP3(pRIP3)、MLKL(pMLKL)抗體產(chǎn)自美國 CST 公司;IFN-γ、TRAIL 產(chǎn)自美國PeproTech 公司?;钚匝鯔z測試劑盒、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG、Alexa Fluor 488標(biāo)記的山羊抗兔IgG、Alexa Fluor 555標(biāo)記的山羊抗兔IgG產(chǎn)自上海碧云天生物技術(shù)公司。
將HaCaT細(xì)胞接種于含1%青鏈霉素和10%胎牛血清的高糖DMEM,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),取對數(shù)生長期細(xì)胞用于各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。
取對數(shù)生長期HaCaT 細(xì)胞按1×104/孔接種于96孔板,在37 ℃及5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)24 h,去上清液,分別加入12.5、25、50、100 μg/L IFN-γ或1、2、4、8 μg/L TRAIL,或同時(shí)加入不同濃度的 IFN-γ 和TRAIL,對照組不加IFN-γ和TRAIL,空白孔不加細(xì)胞,只加培養(yǎng)基,每種處理設(shè)5 個(gè)復(fù)孔,培養(yǎng)48 h后,每孔加入10 μl MTT溶液,在37 ℃、5%C02環(huán)境中孵育4 h,棄上清液,加入二甲基亞砜溶液110 μl,置搖床上充分振蕩10 min,在酶標(biāo)儀490 nm波長下測量各孔吸光度(A值)。細(xì)胞存活率=[各處理組平均A490 值-空白組平均A490 值)/(對照組平均A490 值-空白組平均A490 值)]×100%。預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),50、100 μg/L IFN-γ或4、8 μg/L TRAIL均可抑制細(xì)胞生長,但 50 μg/L IFN-γ 和 4 μg/L TRAIL 及更高濃度IFN-γ、TRAIL 同時(shí)作用可顯著抑制細(xì)胞存活,因此選擇 50 μg/L IFN-γ、4 μg/L TRAIL 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。此外,為了確定caspase 抑制劑zVAD(美國Pepro Tech 公司)作用時(shí)間及濃度,分別加入10、20、40、60、80 μmo/L zVAD 預(yù)處理0.5、1、1.5 h,再加入 50 μg/L IFN-γ 和 4 μg/L TRAIL 處理48 h 后檢測各孔A值,發(fā)現(xiàn) ≥ 40 μmo/L zVAD 預(yù)處理 1、1.5 h 均可顯著抑制細(xì)胞存活,因此選擇40 μmo/L zVAD預(yù)處理1 h作為實(shí)驗(yàn)條件。
取對數(shù)生長期HaCaT 細(xì)胞按1 × 106/孔接種于6 孔板,預(yù)培養(yǎng)24 h;去上清液,陰性對照組不加IFN-γ 或TRAIL,處理組分別加入50 μg/L IFN-γ(IFN-γ 組)、4 μg/L TRAIL(TRAIL 組)、50 μg/L IFN-γ +4 μg/L TRAIL(細(xì)胞因子聯(lián)合組)或40 μmol/L zVAD預(yù)處理1 h后同時(shí)加入50 μg/L IFN-γ及4 μg/L TRAIL(zVAD 聯(lián)合組),作用48 h,光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)后用于以下實(shí)驗(yàn)。
收集細(xì)胞,用含有乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶溶液消化,移至流式檢測管,PBS洗滌2次,1×結(jié)合緩沖液洗滌1次,重懸細(xì)胞,加入5 μl膜聯(lián)蛋白V混勻后,加入5 μl碘化丙錠,混勻,室溫下避光孵育15 min;每管加入400 μ1結(jié)合緩沖液,混勻,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞壞死率。
收集細(xì)胞提取RNA,使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,進(jìn)行定量PCR。應(yīng)用Primer5.0設(shè)計(jì)引物,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。RIP3 正向引物 5′-TGTACAAGTCTAGAGCTAGCAT GTCGTGCGTCAAGTTA-3′,反向引物5′-CGCGGCC GCGGATCCTTATTTCCCGCTATGATT-3′;MLKL:正向引物5′-GGATTGCCCTGAGTTGTTGC-3′,反向引物 5′-AACCGCAGACAGTCTCTCCA-3′;GADPH 正向引物5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′,反向引物 5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。PCR 反應(yīng)體系20 μl,分別為綠色熒光染料 SYBR 10 μl,正反向引物各 0.04 μl,參比染料 ROX 0.4 μl,cDNA 2 μl,ddH2O 7.52 μl,反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s,95 ℃變性5 s,60 ℃退火延伸30 s,共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后,確認(rèn)各個(gè)基因的閾值循環(huán)數(shù)(Ct),利用GAPDH 校正?!鳌鰿t =(實(shí)驗(yàn)組 Ct目的基因-Ct管家基因)-(陰性對照組Ct目的基因- Ct管家基因),計(jì)算RIP3、MLKL基因的相對表達(dá)水平(2-△△Ct)。
收集陰性對照組、IFN-γ組、TRAIL組、細(xì)胞因子聯(lián)合組細(xì)胞,向HaCaT 細(xì)胞中加入裂解液,冰上裂解5 min 后,將細(xì)胞刮下做超聲處理,4 ℃12 000×g離心15 min,吸取上清液分裝并保存。用BCA法測定蛋白濃度,以20 μg 蛋白樣品上樣,進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳,聚偏氟乙烯(PVDF)轉(zhuǎn)膜,5%牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉1 h,加入兔抗人RIP1、pRIP1、RIP3、pRIP3、MLKL、pMLKL 蛋白抗體,4 ℃孵育過夜后,加辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG室溫孵育1 h,ECL發(fā)光法檢測反應(yīng)條帶。以GAPDH 為內(nèi)參,用ImageJ 軟件分析條帶灰度。
另取zVAD 聯(lián)合組、陰性對照組、細(xì)胞因子聯(lián)合組細(xì)胞重復(fù)上述步驟,檢測各組上述各蛋白表達(dá)水平。
HaCaT細(xì)胞爬片,預(yù)培養(yǎng)24 h后,去上清液,分為陰性對照組、IFN-γ組、TRAIL組和細(xì)胞因子聯(lián)合組,處理同以上實(shí)驗(yàn)分組,作用48 h 后,4%多聚甲醛固定15 min,0.2%Triton X-100破膜15 min,5%牛血清白蛋白封閉30 min,加兔抗人pRIP3(1∶500)、兔抗人 pMLKL(1∶500)一抗,4 ℃孵育過夜;加Alexa Fluor 488 標(biāo)記的山羊抗兔 IgG(1∶200)、Alexa Fluor 555標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶200)避光室溫下孵育1 h,4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-imidino-2-henylndoleDAPI)染核5 min,每步驟間均PBS漂洗3次,50%甘油封片,熒光顯微鏡下觀察。
用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA,使其終濃度為10 μmol/L。將HaCaT細(xì)胞接種在24孔板中預(yù)培養(yǎng)24 h 后,去上清液,加入適當(dāng)體積稀釋好的DCFH-DA,37 ℃孵育20 min。用無血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3 次,將細(xì)胞分為陰性對照組、IFN-γ 組、TRAIL組和細(xì)胞因子聯(lián)合組,處理方法同以上實(shí)驗(yàn)分組,刺激1.5 h,收集細(xì)胞用流式細(xì)胞儀檢測活性氧水平。
用SPSS 22 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次,數(shù)據(jù)均以±s表示,不同組間觀察指標(biāo)的比較采用單因素方差分析,兩兩多重比較采用LSD-t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
光鏡下觀察發(fā)現(xiàn),陰性對照組HaCaT細(xì)胞形態(tài)無變化,細(xì)胞生長密集,呈上皮樣貼壁生長。不同細(xì)胞因子作用48 h 后,細(xì)胞形態(tài)均發(fā)生變化。IFN-γ組、TRAIL 組細(xì)胞數(shù)減少;細(xì)胞因子聯(lián)合組、zVAD聯(lián)合組細(xì)胞數(shù)減少,出現(xiàn)壞死樣形態(tài)特征,如細(xì)胞膜破裂、細(xì)胞器腫脹、核皺縮等。
作用48 h后,陰性對照組HaCaT細(xì)胞存活率為100%,但 IFN-γ 組、TRAIL 組、細(xì)胞因子聯(lián)合組、zVAD 聯(lián)合組分別為 73.16% ± 5.71%、81.46% ±4.68%、72.18%±2.93%、69.67%±3.24%,單因素方差分析顯示,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,F(xiàn)= 24.34,P<0.001。兩兩多重比較顯示,IFN-γ 組、細(xì)胞因子聯(lián)合組、zVAD 聯(lián)合組HaCaT 細(xì)胞存活率顯著低于陰性對照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為26.83、27.82、30.32,均P< 0.05),細(xì)胞因子聯(lián)合組與zVAD聯(lián)合組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,t=2.51,P>0.05。
IFN-γ組、TRAIL組、細(xì)胞因子聯(lián)合組、zVAD聯(lián)合組HaCaT 細(xì)胞壞死率分別為6.42% ± 1.36%、6.35% ± 1.91%、9.86% ± 1.31%、10.33% ± 2.16% ,陰性對照組為5.26%±0.91%,5組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,F(xiàn)=6.17,P< 0.01(圖1)。細(xì)胞因子聯(lián)合組、zVAD 聯(lián)合組均顯著高于陰性對照組,t值分別為4.61、5.07,均P< 0.05,細(xì)胞因子聯(lián)合組與zVAD 聯(lián)合組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.47,P> 0.05)。
圖2 IFN-γ、TRAIL、zVAD 單獨(dú)或聯(lián)合作用 48 h 后 HaCaT 細(xì)胞RIP3、MLKL mRNA 表達(dá)情況 n=3。a:與陰性對照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05)。IFN-γ:干擾素γ;TRAIL:腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體;zVAD:胱天蛋白酶抑制劑;RIP3:受體相互作用蛋白3;MLKL:混合系激酶區(qū)域樣蛋白
圖3 干擾素γ、TRAIL 單獨(dú)或聯(lián)合作用48 h 后HaCaT 細(xì)胞RIP1、pRIP1、RIP3、pRIP3、MLKL、pMLKL 蛋白表達(dá)情況 TRAIL:腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體;RIP:受體相互作用蛋白;MLKL:混合系激酶區(qū)域樣蛋白
作用 HaCaT 細(xì)胞 48 h 后,IFN-γ 組、TRAIL 組、細(xì)胞因子聯(lián)合組、zVAD 聯(lián)合組及陰性對照組間RIP3、MLKL mRNA水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值分別為9.16、28.49,均P< 0.05,圖2)。兩兩多重比較顯示,細(xì)胞因子聯(lián)合組、zVAD 聯(lián)合組RIP3 mRNA 水平明顯高于陰性對照組(t值分別為0.99、1.84),MLKL mRNA亦高于陰性對照組(t值分別為1.51、2.17),均P< 0.05,細(xì)胞因子聯(lián)合組與zVAD聯(lián)合組間RIP3、MLKL mRNA水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為0.84、0.65,均P> 0.05)。
作用 48 h 后,IFN-γ 組、TRAIL 組 RIP1、RIP3、MLKL 蛋白表達(dá)水平與陰性對照組相比無明顯變化,但細(xì)胞因子聯(lián)合組RIP1、RIP3、MLKL、pRIP1、pRIP3、pMLKL 蛋白表達(dá)水平高于陰性對照組(圖3,表1,均P< 0.05)。zVAD 聯(lián)合組與細(xì)胞因子聯(lián)合組相比,caspase 8 表達(dá)降低,RIP1、RIP3、MLKL、pRIP1、pRIP3、pMLKL 蛋白表達(dá)水平升高(圖4,表2,均P< 0.05)。
圖4 干擾素γ與TRAIL聯(lián)合及共同與zVAD聯(lián)合對HaCaT細(xì)胞pRIP1、RIP1、胱天蛋白酶8、pRIP3、RIP3、pMLKL、MLKL 蛋白表達(dá)的影響 TRAIL:TNF 相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體;zVAD:胱天蛋白酶抑制劑;RIP:受體相互作用蛋白;MLKL:混合系激酶區(qū)域樣蛋白
表1 干擾素γ、TRAIL單獨(dú)或聯(lián)合作用對HaCaT細(xì)胞RIP1、RIP3、MLKL蛋白及其磷酸化蛋白表達(dá)的影響(±s)
表1 干擾素γ、TRAIL單獨(dú)或聯(lián)合作用對HaCaT細(xì)胞RIP1、RIP3、MLKL蛋白及其磷酸化蛋白表達(dá)的影響(±s)
注:n=3。與陰性對照組(不用干擾素γ、TRAIL或zVAD處理)比較,a P < 0.01,b P < 0.05。TRAIL:TNF相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體;RIP:受體相互作用蛋白;MLKL:混合系激酶區(qū)域樣蛋白
組別陰性對照組干擾素γ組TRAIL組細(xì)胞因子聯(lián)合組F值P值pRIP1 1 1.387±0.040 1.878±0.033a 2.144±0.494a 8.819 0.006 RIP1 1 1.929±0.263 1.996±0.298 2.790±0.560a 21.158<0.001 pRIP3 1 2.017±0.291b 1.659±0.032 4.344±0.802a 34.867<0.001 RIP3 1.025±0.043 1.318±0.224 1.510±0.341b 4.272 0.045 pMLKL 1 2.032±0.075 3.683±0.974a 4.494±0.489a 9.432 0.005 MLKL 1 1.247±0.073 1.319±0.228 1.452±0.139a 5.605 0.023
1.pRIP3 在細(xì)胞中的表達(dá)及分布:HaCaT 細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞因子聯(lián)合作用48 h 后細(xì)胞質(zhì)可見強(qiáng)綠色點(diǎn)狀或團(tuán)塊狀綠色熒光斑點(diǎn),IFN-γ組、TRAIL組作用48 h后細(xì)胞質(zhì)可見淺綠色熒光斑點(diǎn),陰性對照組細(xì)胞未見明顯的綠色熒光斑點(diǎn),見圖5。
2.pMLKL 在細(xì)胞中的表達(dá)及分布:經(jīng)細(xì)胞因子聯(lián)合作用48 h后,HaCaT細(xì)胞膜可見明顯紅色熒光斑點(diǎn),IFN-γ組、TRAIL組細(xì)胞膜僅見淺紅色熒光斑點(diǎn),陰性對照組細(xì)胞未見明顯熒光斑點(diǎn),見圖6。
作用 48 h 后,IFN-γ 組、TRAIL 組、細(xì)胞因子聯(lián)合組活性氧平均熒光強(qiáng)度分別為494.33 ± 63.59、434.67 ± 16.57、901.33 ± 64.49,陰 性 對 照 組 為199.01±4.04,4組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,F(xiàn)=26.81,P<0.001。細(xì)胞因子聯(lián)合組與陰性對照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,t=702.00,P< 0.05。
本研究顯示,IFN-γ 和 TRAIL 共同作用可導(dǎo)致細(xì)胞存活率明顯下降、壞死率升高,說明IFN-γ 和TRAIL 可誘導(dǎo)細(xì)胞壞死。zVAD 為caspase 抑制劑,當(dāng)其預(yù)處理HaCaT細(xì)胞 1 h 后 ,聯(lián)合 IFN-γ 和TRAIL(zVAD 聯(lián)合組)可致細(xì)胞存活率進(jìn)一步下降、壞死率進(jìn)一步升高,但細(xì)胞存活率、壞死率在細(xì)胞因子聯(lián)合組與zVAD 聯(lián)合組之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示IFN-γ和TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡類型與zVAD 聯(lián)合組誘導(dǎo)的類似。光鏡下觀察發(fā)現(xiàn),細(xì)胞因子聯(lián)合組和zVAD 聯(lián)合組均出現(xiàn)壞死樣形態(tài)特征。提示 IFN-γ 和 TRAIL 聯(lián)合對 HaCaT 細(xì)胞程序性壞死具有一定影響。
表2 干擾素γ與TRAIL聯(lián)合及共同與zVAD聯(lián)合對HaCaT細(xì)胞pRIP1、RIP1、caspase 8、pRIP3、RIP3、pMLKL、MLKL蛋白表達(dá)的影響(±s)
表2 干擾素γ與TRAIL聯(lián)合及共同與zVAD聯(lián)合對HaCaT細(xì)胞pRIP1、RIP1、caspase 8、pRIP3、RIP3、pMLKL、MLKL蛋白表達(dá)的影響(±s)
注:n=3。與細(xì)胞因子聯(lián)合組(干擾素γ+TRAIL)比較,a P <0.01,b P <0.05。TRAIL:TNF相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體;zVAD:胱天蛋白酶抑制劑;RIP:受體相互作用蛋白;MLKL:混合系激酶區(qū)域樣蛋白
組別陰性對照組細(xì)胞因子聯(lián)合組zVAD聯(lián)合組F值P值pRIP1 1a 1.723±0.048 1.874±0.121b 116.175<0.001 RIP1 1 0.991±0.109 1.241±0.067a 10.998 0.010胱天蛋白酶8 1a 2.056±0.190 1.007±0.057a 84.271<0.001 pRIP3 1b 2.792±0.456 7.226±1.175a 58.25<0.001 RIP3 1 1.144±0.145 1.842±0.341a 13.305 0.006 pMLKL 1a 1.644±0.041 2.111±0.143a 127.111<0.001 MLKL 1 0.970±0.135 1.335±0.098a 13.319 0.006
圖5 pRIP3 免疫熒光檢測(×400) 綠色熒光斑點(diǎn)表示pRIP3蛋白,陰性對照組未見明顯綠色熒光斑點(diǎn),干擾素γ組、TRAIL組細(xì)胞質(zhì)可見淺綠色熒光斑點(diǎn),細(xì)胞因子聯(lián)合組細(xì)胞質(zhì)可見強(qiáng)綠色熒光斑點(diǎn)。pRIP3:磷酸化受體相互作用蛋白3 圖6 pMLKL 免疫熒光檢測(×400) 紅色熒光斑點(diǎn)表示pMLKL蛋白。陰性對照組細(xì)胞無明顯熒光斑點(diǎn),干擾素γ組、TRAIL組細(xì)胞膜可見淺紅色熒光斑點(diǎn),細(xì)胞因子聯(lián)合組細(xì)胞膜可見明顯紅色熒光斑點(diǎn)。pMLKL:磷酸化混合系激酶區(qū)域樣蛋白
在程序性壞死中,RIP1 可能通過自身磷酸化實(shí)現(xiàn)對 N 端激酶的調(diào)控[11-12],激活 RIP3,構(gòu)成“RIP1-RIP3 壞死體”,同時(shí)在刺激因子作用下,RIP3 也發(fā)生自磷酸化,激活下游MLKL 使其磷酸化[3],pMLKL 通過自身寡聚化后逐漸轉(zhuǎn)移至膜上[13-14],可能通過對細(xì)胞膜的滲透、破壞,導(dǎo)致細(xì)胞死亡。本研究顯示,在陰性對照組、IFN-γ 組、TRAIL組之間 ,RIP3、MLKL基因表達(dá)及 RIP1、RIP3、MLKL 蛋白表達(dá)無明顯差異,細(xì)胞因子聯(lián)合組RIP3、MLKL 基因表達(dá)和RIP1、RIP3、MLKL 蛋白及其磷酸化蛋白表達(dá)均較陰性對照組明顯升高,證實(shí) IFN-γ 和 TRAIL 聯(lián)合作用下 RIP1/RIP3/MLKL 信號通路被激活。zVAD 聯(lián)合組中,經(jīng)過zVAD 預(yù)處理,caspase 8 表達(dá)降低,RIP1、RIP3、MLKL 及其磷酸化蛋白表達(dá)較細(xì)胞因子聯(lián)合組進(jìn)一步上升,其程序性壞死程度進(jìn)一步加深??紤]到IFN-γ和TRAIL也可以參與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等[6],推測當(dāng)caspase 8 被抑制時(shí),IFN-γ 和 TRAIL 更易誘導(dǎo)程序性壞死發(fā)生。通過熒光顯微鏡可見,pMLKL 主要分布在細(xì)胞膜上,說明pMLKL 可能是HaCaT 細(xì)胞程序性壞死的執(zhí)行者,通過對細(xì)胞膜完整性的破壞導(dǎo)致細(xì)胞死亡。既往研究發(fā)現(xiàn),在人組織淋巴瘤細(xì)胞U937 和Fas 相關(guān)死亡域蛋白缺陷型人白血病T細(xì)胞系Jurkat 中,活性氧在MLKL 活化的上游和下游都起作用,一方面,活性氧促進(jìn)“RIP1-RIP3 壞死體”穩(wěn)定,并在程序性壞死過程中啟動(dòng)正反饋擴(kuò)增循環(huán)[15],此外,活性氧可以特異性氧化 RIP1 上 3 個(gè)關(guān)鍵半胱氨酸[4],從而促進(jìn)S161自磷酸化和壞死體形成;另一方面,過度產(chǎn)生的活性氧可以損傷脂類、蛋白、DNA 等,影響 Ca2+濃度,引起細(xì)胞壞死[4,16]。本研究顯示,IFN-γ 和TRAIL 聯(lián)合作用可導(dǎo)致大量活性氧產(chǎn)生,說明在HaCaT 細(xì)胞程序性壞死中,活性氧也可能起重要作用,但這些仍需進(jìn)一步研究。
本研究中,IFN-γ 單獨(dú)作用后細(xì)胞存活率明顯下降,但壞死率無明顯變化,其原因可能是IFN-γ單獨(dú)作用可誘導(dǎo)HaCaT 細(xì)胞發(fā)生凋亡[7],而與TRAIL聯(lián)合作用時(shí)促程序性壞死作用明顯,考慮可能是IFN-γ 和TRAIL 細(xì)胞因子間相互作用所致。研究發(fā)現(xiàn),藥物特異性CD8+T 細(xì)胞可產(chǎn)生IFN-γ,募集單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞,進(jìn)一步促進(jìn)其他促炎細(xì)胞因子如 TRAIL 等表達(dá)[10,17]。此外,IFN-γ 可通過上調(diào) KC 死亡受體 4、5 的表達(dá),使 KC結(jié)合更多的TRAIL[11],該機(jī)制可能也參與程序性壞死過程。還有研究發(fā)現(xiàn),IFN-γ 可以打破細(xì)胞對TRAIL的耐受,增強(qiáng)細(xì)胞對TRAIL的敏感性[18]。
我們通過形態(tài)學(xué)分析以及細(xì)胞存活率、壞死率和程序性壞死相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的檢測,證實(shí)IFN-γ 和 TRAIL 聯(lián)合可誘導(dǎo) HaCaT 細(xì)胞發(fā)生程序性壞死,同時(shí)伴隨著活性氧產(chǎn)生,這些將有助于進(jìn)一步理解SJS/TEN 中發(fā)生的KC 程序性壞死機(jī)制,以IFN-γ、TRAIL作為靶點(diǎn)的治療也許可減少KC大量壞死,緩解病情。鑒于SJS/TEN發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性,SJS/TEN中KC發(fā)生的程序性壞死是否有TNF-α等其他細(xì)胞因子參與以及RIP1/RIP3/MLKL通路與活性氧的具體作用等還需要深入研究。
利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突