周敬華，韓瑞鈺，陳拽生，默義，周策，王樹松

(河北省計劃生育科學技術(shù)研究院，國家衛(wèi)計委計劃生育與優(yōu)生重點實驗室，石家莊 050071)

目前人類生殖能力呈下降趨勢，約有20%的育齡夫婦受到不孕不育的困擾，其中男性因素占到40%～60%[1]。特別是近年來，隨著周圍環(huán)境帶來的各種污染、生活壓力增大、生活方式改變等因素的影響，男性精液質(zhì)量呈下降趨勢[2]。精子形態(tài)分析在男性不育癥的診斷和治療中發(fā)揮著重要的作用[3]。在精液形態(tài)參數(shù)中胞漿小滴(cytoplasmic droplet)和過量殘留胞漿(excess residual cytoplasm)作為精子正常和異常部分對其產(chǎn)生截然不同的影響[4]。

早在2003年Fischer等[5]以有生育力和不育男子精液作為標本進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)精子殘留胞漿與精子DNA變性呈正相關(guān)，不能生育的男性精子殘留胞漿和變性DNA的含量明顯高于能生育男子。但是國內(nèi)對于過量殘留胞漿與男性不育的研究很少，本文的研究目的是比較不同過量殘留胞漿比例組男性精液的檢測指標，探討過量殘留胞漿與男性精液質(zhì)量的相關(guān)性，進一步確定過量殘留胞漿在男性不育中的影響。

資料與方法

一、研究對象

收集2018年1～4月在本院男科門診就診的年齡在22～45歲的男性生育咨詢患者為研究對象，共198例。排除標準：(1)存在外傷及遺傳性疾病家族史；(2)睪丸、附睪和輸精管存在異常；(3)患有乙肝、淋病、梅毒等傳染性疾??；(4)染色體核型異常。取其完整精液標本進行分析，并簽訂知情同意書。

二、主要儀器、試劑

Diff-Quick精子形態(tài)染色試劑購自深圳華康生物醫(yī)學工程有限公司。精子質(zhì)量分析儀(江蘇瑞祺CFT-9201)、相差顯微鏡BX43(奧林巴斯，日本)，DM750光學顯微鏡(萊卡，德國)。

三、研究方法

1.精液常規(guī)分析：禁欲時間為2～7 d，手淫法取精，采用一次性專用塑料取精杯收集射出來的全部精液，立即送實驗室，精液液化后按照WHO《人類精液檢查與處理實驗室手冊》(第5版)的標準進行精液質(zhì)量分析。精液體積：采用稱重法測量精液體積；精子濃度：在200倍相差顯微鏡下，精液標本采用計算機輔助精液分析系統(tǒng)(CASA)計數(shù)；前向運動：精子主動地呈直線或沿一大圓周運動，不管速度如何；非前向運動：所有其他非前向運動的形式，如以小圓周泳動，尾部動力幾乎不能驅(qū)使頭部移動，或者只能觀察到尾部擺動。系統(tǒng)觀察至少6個視野，對至少200個精子進行分級，計數(shù)前向運動和 非前向運動精子的百分率。

2. 精液形態(tài)分析：參照WHO《人類精液檢查處理實驗手冊》(第5版)用Diff-Quik快速染色法進行形態(tài)評估，用油鏡檢查已染色的涂片。按照WHO推薦標準對精子形態(tài)進行評估，判斷標準：精子頭部外形上應該是光滑、輪廓規(guī)則，大體上呈橢圓形；頂體區(qū)可清晰分辨，占頭部的40%～70%；頂體區(qū)沒有大空泡，并且不超過2個小空泡，空泡大小不超過頭部的 20%；頂體后區(qū)不含任何空泡。中段應該細長、規(guī)則，大約與頭部長度相等；中段主軸應與頭部長軸成一條直線。殘留胞漿只有在過量時才被認為是異常的，即胞漿超過了精子頭大小的1/3時被認為過量殘留胞漿。主段應該比中段細，均一，其長約45 μm(約為頭部長度的 10倍)；尾部應沒有顯示鞭毛折斷的銳利折角；主段可以自身卷曲成環(huán)狀。按照上述判斷標準每例患者均隨機計數(shù)200個以上精子，并換算出精子形態(tài)畸形率。如：過量殘留胞漿比例是指計數(shù)至少200條精子，其中含有過量殘留胞漿的精子數(shù)除以計數(shù)的所有精子數(shù)所得的百分比，具體圖示見圖1。

注：箭頭所指處為過量殘留胞漿精子圖1 過量殘留胞漿精子與正常形態(tài)精子(Diff-Quik快速染色法)

3.精液質(zhì)量分析標準：按照WHO《人類精液檢查與處理實驗室手冊》(第5版)作為精子質(zhì)量分析的參考標準：(1)精液體積≥1.5 ml；(2)精液PH≥7.2；(3)精子濃度≥15×106/ml；(4)前向運動精子比例≥32%；(5)總活力(前向運動+非前向運動精子比例)≥40%；(6)正常形態(tài)精子比例≥4%。

4.分組：按照三分位法將過量殘留胞漿精子比例進行分組，胞漿殘留比例≤7%的為第1組，共68例；胞漿殘留比例7.1%～11.0%的為第2組，共66例；胞漿殘留比例>11%的為第3組，共64例。分別比較各組間精液的不同參數(shù)，并分析此198例標本中精子過量殘留胞漿與精液各參數(shù)間的相關(guān)性。

5.檢測指標：分別記錄禁欲天數(shù)、精液體積、精子濃度、精子活力百分比(前向運動精子、非前向運動精子及不動精子)、精子異常形態(tài)百分比(頭部缺陷、頸部缺陷、尾部缺陷、頂體缺陷及過量殘留胞漿比例)。

四、統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

一、不同過量殘留胞漿比率組的患者精液質(zhì)量

統(tǒng)計結(jié)果顯示，與第3組相比，第1組患者的正常形態(tài)率升高、頭部缺陷率及頸部缺陷率下降，具有顯著性差異(P<0.05)；第2組的濃度和正常形態(tài)率升高、頭部缺陷率及頸部缺陷率下降，具有顯著性差異(P<0.05)。隨著精液過量殘留胞漿比例增高，精子前向運動呈現(xiàn)“下降”趨勢，在非前向運動上呈“上升”趨勢，在濃度上呈現(xiàn)“先上升后下降”趨勢(表1)。

表1 不同過量殘留胞漿比例組的精液參數(shù)比較(-±s)

注：與第3組比較，*P<0.05

二、過量殘留胞漿比例與精液參數(shù)的相關(guān)性

相關(guān)性分析顯示：過量殘留胞漿比例與精液濃度、精子正常形態(tài)率呈顯著負相關(guān)(P<0.05)；過量殘留胞漿比例與禁欲天數(shù)、非前向運動百分比、頭部畸形率、頸部畸形率、尾部畸形率呈顯著正相關(guān)(P<0.05)(表2)。

表2 過量殘留胞漿比例與精液參數(shù)的相關(guān)性

三、過量殘留胞漿比例預測弱精子癥及畸形精子癥的ROC曲線分析

以精液分析結(jié)果為金標準，根據(jù)不同的過量殘留胞漿比例計算過量殘留胞漿比例篩查弱精子癥和畸形精子癥的靈敏度和特異度。以敏感度為縱坐標，1-特異度為橫坐標，繪制ROC曲線(圖2、3)。當取過量殘留胞漿比例9.1%為cut-off值時，分析其診斷弱精子癥(精子前向運動<32%)的敏感性為64.9%，特異性為54.4%，ROC曲線下面積為0.614，標準誤為0.045，其95%置信區(qū)間(CI)為(0.526，0.702)，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；當取過量殘留胞漿比例9.1%為cut-off值時，分析其診斷畸形精子癥(精子正常形態(tài)率<4%)的敏感性為56.7%，特異性為60.6%，ROC曲線下面積為0.610，標準誤為0.04，其95%CI為(0.532，0.689)，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表3)。

圖2 過量殘留胞漿比例診斷弱精子癥的ROC曲線

圖3 過量殘留胞漿比例診斷畸形精子癥的ROC曲線

表3 過量殘留胞漿比例預測弱精子癥及畸形精子癥分析

討 論

男性精液檢測在診斷和治療不育癥中起著非常重要的作用，特別是對于精子形態(tài)的評估與男性不育具有密切的相關(guān)性，是評估男性生殖能力的一個重要指標。有研究表明，男性不育人群中由精液異常所致的不育癥比例高達70%～80%[6]。雖然從理論上講，卵母細胞受精只需一條正常精子就可以，但根據(jù)WHO相關(guān)標準要求，當正常精子形態(tài)率小于4%，即精子形態(tài)畸形率大于96%時，就很難自然受孕。對于采用輔助生育技術(shù)(ART)的夫婦來說，男性精子形態(tài)和質(zhì)量也同樣至關(guān)重要。

通常正常的精子發(fā)生后，大部分精子胞漿通過支持細胞的“細胞質(zhì)擠壓”過程來實現(xiàn)壓縮，在睪丸的管腔中，支持細胞將大部分細胞質(zhì)吞噬為“殘余體”，其余部分，大小不會超過精子頭部的1/3，這部分胞漿稱為胞漿小滴。在大多數(shù)非人類哺乳動物當中，這些胞漿小滴從尾部向下遷移并最終在射精時流出，但人類卻不同，正常人類精子中的胞漿小滴在射精后仍然存在。根據(jù)WHO的最新規(guī)定，胞漿小滴是人類精子有生理功能的正常成分，其含有的少量胞漿內(nèi)儲存的多種酶，可以產(chǎn)生適量的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，在精子運動、獲能、超激活運動、頂體反應和精卵融合等過程中發(fā)揮重要作用[7-8]。而當胞漿小滴超過精子頭部的1/3時，稱為過量殘留胞漿，攜帶過量殘留胞漿的精子在精子發(fā)生過程中“細胞質(zhì)擠壓”中斷，導致精子發(fā)生過程受損，因此帶有過量殘留胞漿的精子在發(fā)生過程中是具有“成熟障礙”的。Cooper等[9]所做的研究闡述了胞漿小滴和過量殘留胞漿最大的不同是，過量殘留胞漿幸存于用人類的空氣干燥技術(shù)做的精液涂片，而胞漿小滴沒有；二者在位置上也有區(qū)別，過量殘留胞漿可能跨越整個中段區(qū)域，而胞漿小滴則更集中在精子中間的頸部。

早在1997年，Keating等[10]就研究發(fā)現(xiàn)胞漿殘留的存在與體外受精(IVF)的成功率成顯著負相關(guān)，與精子膜的完整性及精子濃度也成負相關(guān)。俞建軍等[11]同樣證實不育組精子殘留胞漿的比例顯著高于生育組，并推測過量殘留胞漿可能導致不育的原因是影響了精子的運動速度，由于其不脫落進一步影響到頂部質(zhì)膜的暴露繼而影響受精。本文通過比較不同過量殘留胞漿比例組男性精液的檢測指標，結(jié)果顯示過量殘留胞漿比例高的組相比于過量殘留胞漿比例低的組，二者在精液參數(shù)上有不同程度的差異，隨著精液過量殘留胞漿比例增高，精子在前向運動上呈現(xiàn)“下降”趨勢，因此，我們推測：過量殘留胞漿是因為降低了精子的前向運動，從而影響了精子的總活力。相關(guān)性分析顯示過量殘留胞漿比例與精液濃度、精子正常形態(tài)率呈顯著負相關(guān)，過量殘留胞漿比例與禁欲天數(shù)、非前向運動百分比、頭部畸形率、頸部畸形率、尾部畸形率呈顯著正相關(guān)。這與之前的一些研究結(jié)果大體一致。

過量殘留胞漿由于胞漿含量高，因此含有較高水平的G6PDH，導致更多的NADPH產(chǎn)生，NADPH是ROS產(chǎn)生NADPH氧化酶的底物[12]，由于高ROS水平，精子可能呈現(xiàn)氧化應激狀態(tài)，其特征在于對線粒體和核DNA[13]以及對精子質(zhì)膜的過氧化損傷[14]，使精子活力和功能受損，影響獲能和受精[15]。因此我們推測，高比例的過量殘留胞漿會產(chǎn)生高水平的ROS，同時升高的ROS水平與增加的細胞凋亡有關(guān)[16]，當ROS水平超過身體抗氧化系統(tǒng)的能力時，出現(xiàn)氧化應激(Oxidative Stress，OS)[17]，OS對精子發(fā)生中不成熟精子轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒炀拥倪@個最后階段產(chǎn)生影響。精子從生精小管到附睪轉(zhuǎn)移期間可能受到損傷，結(jié)果導致成熟精子中的OS-依賴型損傷[18]。如此一來，便造成了OS影響精子發(fā)生，使精子保留過量殘留胞漿，過量殘留胞漿又產(chǎn)生過多的ROS，ROS升高導致OS發(fā)生的惡性循環(huán)，最終影響了精子的活力和形態(tài)。

本研究還對過量殘留胞漿比例預測弱精子癥和畸形精子癥做了分析，結(jié)果顯示，當取過量殘留胞漿比例9.1%為cut-off值時，其對于診斷弱精子癥和畸形精子癥具有一定的價值。提示在臨床工作中，過量殘留胞漿精子比例高的精液，可能對畸形精子癥或弱精子癥的診斷提供了一定的預測價值，對臨床診斷及治療具有一定的參考意義。為了降低由于過量殘留胞漿產(chǎn)生的過多ROS，可以采用抗氧化劑處理，如使用具有抗氧化作用的維生素A、維生素C、維生素E(生育酚)、谷胱甘肽(GSH)、番茄紅素等[19]。因為過量殘留胞漿和隨后的精子DNA碎片增加，精卵結(jié)合障礙，卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)可以作為改善這一障礙的干預措施[20]。

本研究同時提示我們在分析精液質(zhì)量參數(shù)對于臨床的指導意義時，還要更全面地了解過量殘留胞漿這個特殊結(jié)構(gòu)與男性不育發(fā)生的關(guān)系，嘗試檢測人類男性攜帶過量殘留胞漿的發(fā)病率，有意識地將過量殘留胞漿的檢測結(jié)果和精液其他常規(guī)檢測結(jié)果聯(lián)合起來作為評價精子功能和藥物療效的有效參數(shù)，這樣可能更準確、全面地反映精子質(zhì)量，彌補單項指標對生育能力評估的不足，為尋找治療男性不育提供新的思路。但由于本研究樣本量較少，因此在今后的研究中應該擴大樣本量，進一步在臨床中加以探討和驗證，以期更完整地了解其對于男性不育的影響。