范艷慧,代 鈺,單恬恬,易 陽,3,王宏勛,3,王麗梅,3,*

(1.武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院,湖北武漢 430023; 2.武漢食品化妝品檢驗(yàn)所,湖北武漢 430023; 3.湖北省生鮮食品工程技術(shù)研究中心,湖北武漢 430023)

菱(Trapasp.)又名菱角、水菱角、風(fēng)菱,是一年生浮水或半挺水草本植物。迄今已有3000多年的栽培歷史,在我國長(zhǎng)江流域亞熱帶地區(qū)分布最多[1-2]。成熟菱角按角的有無和種類劃分為不同品種,如無角的南湖菱(TrapaacornisNakano)、二角菱(T.bispinosaRoxb)和四角菱(T.quadrispinosa)。

菱角營養(yǎng)豐富,藥用價(jià)值也非常高,歷代醫(yī)家視菱為“養(yǎng)生之果”、藥膳佳品?！侗静菥V目》載:菱能補(bǔ)脾胃,強(qiáng)股膝,安中補(bǔ)五臟、解丹石毒、補(bǔ)中延年、健力益氣,菱粉粥有益胃腸,可解內(nèi)熱[3-4]。近年對(duì)菱角的化學(xué)成分也進(jìn)行了較廣泛的研究,表明菱角中含有生物堿、黃酮類、多酚類、多糖類等成分[5-10];菱角提取物有抗腫瘤[11-13]、抗氧化[14-17]、抗感染[18-20]、降血糖[21-22],尤其在抗癌方面的研究成果顯著。目前有關(guān)菱角殼的研究報(bào)道并不多，而關(guān)于菱角殼萃取方面的研究更是寥寥無幾。陳百泉等[23]將南湖菱殼提取液分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,乙酸乙酯部位和正丁醇部位采用色譜法分離得到9個(gè)化合物,從乙酸乙酯萃取液中分離得到的單體化合物齊墩果酸、熊果酸具有明顯降糖作用?？滴乃嚨萚24]將南湖菱殼醇提取液分別用乙酸乙酯、石油醚、正丁醇萃取,研究各萃取部位對(duì)急性肝損傷小鼠的治療作用,結(jié)果表明乙酸乙酯部位提取物和正丁醇部位提取物均能顯著降低肝損傷小鼠血清中的GPT、GOD含量及小鼠肝組織中MDA含量,并能顯著提高SOD活力,可以用來制備保肝護(hù)肝藥物。林秋生[25]采用不同極性溶劑萃取后發(fā)現(xiàn),多酚和黃酮類物質(zhì)主要富集到乙酸乙酯相,皂苷類物質(zhì)富集到氯仿和石油醚相,乙酸乙酯相和氯仿相顯示出較強(qiáng)的抑制胃癌SGC7901細(xì)胞生長(zhǎng)的效果。

腫瘤是威脅人類健康的重大疾病,目前普遍認(rèn)為惡性腫瘤化學(xué)治療藥物引起腫瘤退縮的機(jī)制在于促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡和阻止其增殖,而細(xì)胞死亡既可以通過壞死又可通過凋亡的形式進(jìn)行[26]。與壞死不同,凋亡的細(xì)胞維持完整的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能,細(xì)胞解體后形成凋亡小體,不引起周圍組織炎癥反應(yīng)[27],細(xì)胞凋亡成為惡性腫瘤化療的新目標(biāo)。本研究通過比較菱角殼不同萃取物對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用和促腫瘤細(xì)胞凋亡的能力,旨在尋找抗腫瘤活性較強(qiáng)的部位,為深入研究菱角殼的抗腫瘤作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人胃癌細(xì)胞SGC-7901、人肝癌細(xì)胞Hep G2 百奧斯生物公司;無水乙醇、正丁醇、乙酸乙酯 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;DMEM高糖、PBS Hyclone公司;0.25%胰酶溶液 杭州吉諾生物公司;胎牛血清、雙抗 杭州四季青生物工程公司;CCK-8 試劑 南京恩晶生物科技有限公司;細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒 索寶來生物技術(shù)有限公司;菱角殼 武漢飛揚(yáng)生物技術(shù)有限公司;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品 上海源葉生物科技有限公司。

HR1848料理機(jī) 荷蘭皇家飛利浦公司;RE-3000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 上?？茽杻x器設(shè)備有限公司;SB-5200DTN數(shù)控超聲波清洗器 寧波新芝生物科技股份有限公司;YXQ-50SII立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;SCHP-80 CO2培養(yǎng)箱 常州恒德儀器有限制造公司;Sunrise酶標(biāo)儀 美國 thermo;AXTD5A臺(tái)式低速離心機(jī) 鹽城市安信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;SCIENT2-12N冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菱角殼醇提物分級(jí)萃取物的制備 參照侯莉莉[28]的制備工藝稍作修改,將晾干的菱角殼磨碎,按料液比1∶10 g/mL加入70%乙醇,60 ℃恒溫水浴加熱30 min,50 ℃超聲提取45 min,60 ℃再水浴加熱30 min,抽濾收集提取液,旋蒸濃縮,冷凍干燥得到菱角殼醇提物。

將醇提物加50 mL蒸餾水溶解,分別用等體積飽和的正丁醇和乙酸乙酯反復(fù)萃取三次。將正丁醇萃取物和乙酸乙酯萃取物分別在60 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮干燥。

1.2.2 萃取物總黃酮與總多酚含量測(cè)定

1.2.2.1 樣品中總黃酮含量的測(cè)定 采用AlCl3-乙酸鉀比色法[29]。配制濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。取2 mL待測(cè)液與0.2 mL 5%的亞硝酸鈉溶液混合,反應(yīng)6 min之后加入0.2 mL 10%三氯化鋁溶液,充分混勻反應(yīng)5 min之后加入0.6 mL 1 mol/L氫氧化鈉溶液,待反應(yīng)液充分混勻,15 min后于波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定不同濃度梯度蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性回歸方程為:y=11.151x-0.0104(R2=0.9993)。將萃取物配制成一定濃度待測(cè)液按上述步驟測(cè)量吸光度,重復(fù)測(cè)定三次,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總黃酮含量。

1.2.2.2 樣品中多酚含量的測(cè)定 采用Folin酚法[30]。配制濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。取0.5 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液與0.4 mL福林酚試劑與7.5 mL水充分混勻,反應(yīng)5 min之后加入10%碳酸鈉溶液1.6 mL,待反應(yīng)液充分混勻后于室溫下避光反應(yīng)2 h,于765 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到線性回歸方程為:y=1.333x+0.0223(R2=0.9991)。將萃取物配置成一定濃度待測(cè)液按上述步驟測(cè)量吸光度,重復(fù)測(cè)定三次,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總多酚含量。

1.2.3 菱角殼萃取物抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的測(cè)定

第一步，教師對(duì)本節(jié)教學(xué)的重點(diǎn)和難點(diǎn)及學(xué)生在自主學(xué)習(xí)過程中存在的共性問題，通過講授、討論等方法進(jìn)行有針對(duì)性教學(xué)。

1.2.3.1 細(xì)胞復(fù)蘇 將肝癌和胃癌細(xì)胞從-80 ℃冰箱中取出,放在溫度為37 ℃的水浴鍋內(nèi)溫育,使細(xì)胞迅速解凍。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到無菌的細(xì)胞房中。將細(xì)胞置于離心機(jī)中,1500 r/min離心5～10 min。棄掉上清液,收集細(xì)胞沉淀。加入4 mL新鮮的DMEM完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。將重懸后的細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到無菌的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。將細(xì)胞放置在37 ℃、5.0% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.2.3.2 細(xì)胞傳代 當(dāng)細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶的80%～90%時(shí)就要進(jìn)行細(xì)胞傳代。棄掉培養(yǎng)瓶中上層的培養(yǎng)基,加2 mL PBS潤洗細(xì)胞兩次。加入1 mL胰酶消化細(xì)胞1 min,按照1∶1的傳代比例,加入8 mL新鮮的DMEM完全培養(yǎng)基,重懸細(xì)胞。吸取4 mL細(xì)胞懸浮液,轉(zhuǎn)移到新的無菌的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng),待細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行細(xì)胞活力測(cè)定。

1.2.3.3 細(xì)胞活力測(cè)定 收集1.2.3.2對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,將重懸的細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到96孔板中,每個(gè)孔種植100 μL,數(shù)量為1×104個(gè)細(xì)胞。將種植在96孔板里的細(xì)胞放置在細(xì)胞培養(yǎng)箱,37 ℃,5.0%濃度的CO2,培養(yǎng)24 h。加入100 μL不同濃度的萃取物處理細(xì)胞24、48 h。每孔加入10 μL CCK-8,繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育細(xì)胞3 h。將96孔板放置在酶標(biāo)儀中,選擇450 nm的波長(zhǎng)檢測(cè)。增殖抑制率如下,并計(jì)算IC50值。

抑制率(%)=[(Ac-As)/(Ac-Ab)]×100

式中:As:實(shí)驗(yàn)孔(含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、cck-8、待測(cè)物質(zhì))吸光度;Ac:對(duì)照孔(含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、cck-8、沒有待測(cè)物質(zhì))吸光度;Ab:空白孔(不含細(xì)胞和待測(cè)物質(zhì)的培養(yǎng)基、cck-8)吸光度。

1.2.4 菱角殼萃取物促腫瘤細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 取上步對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL,將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔種植2 mL細(xì)胞懸液置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h;每孔分別加入2 mL濃度為25、50、100、200和400 μg/mL的菱角殼萃取物溶液,放在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h;分別收集細(xì)胞,每管樣品中加入500 μL 1×binding buffer,5 μL Annexin V-FITC 染料,5 μL PI染料,室溫避光孵育15 min;在激發(fā)光488 nm,F1通道發(fā)射光488～525 nm,F2通道發(fā)射光550 nm處,雙通道檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)以X±S的形式記錄。數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行配對(duì)樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菱角殼萃取物總黃酮與總多酚含量

由表1可以看出,菱角殼萃取物中黃酮和多酚主要富集在乙酸乙酯相中,乙酸乙酯萃取物黃酮和多酚含量分別為(335.10±0.004)、(723.10±0.022) mg/g。這與林秋生[25]研究報(bào)道的不同極性溶劑萃取后多酚和黃酮類物質(zhì)主要富集到乙酸乙酯相的結(jié)果一致。

2.2 菱角殼萃取物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響

2.2.1 菱角殼萃取物對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖的影響 如表2所示,正丁醇萃取物在低濃度25～50 μg/mL時(shí),SGC-7901細(xì)胞出現(xiàn)促增長(zhǎng)的現(xiàn)象,萃取物在小劑量濃度下未達(dá)到抑制細(xì)胞增殖的作用,反而起到促進(jìn)增殖的作用,隨著濃度的增大正丁醇萃取物呈現(xiàn)出較好的抑制細(xì)胞增殖效果。這與嚴(yán)興耘等[31]研究發(fā)現(xiàn)低濃度的槲皮素明顯促進(jìn)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖,高濃度的槲皮素明顯抑制細(xì)胞增殖這一現(xiàn)象相似。乙酸乙酯萃取物隨著濃度的增加,對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901抑制率增加,處理時(shí)間越長(zhǎng),抑制率越高,呈現(xiàn)一定劑量效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng)。乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物作用胃癌細(xì)胞48 h,最高抑制率均達(dá)到80%以上。

表2 菱角殼萃取物對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖抑制作用Table 2 Effects of water chestnut extract on proliferation of gastric cancer cell line SGC-7901

2.2.2 菱角殼萃取物對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖的 IC50如表3,兩種萃取物作用胃癌細(xì)胞24 h,乙酸乙酯萃取物的IC50值為208.51 μg/mL,正丁醇萃取物的IC50值為177.68 μg/mL;作用時(shí)間為48 h,乙酸乙酯萃取物的IC50值56.83 μg/mL,正丁醇萃取物的IC50值為69.41 μg/mL。其原因可能是胃癌細(xì)胞對(duì)正丁醇萃取物中所含主要成分較敏感,在較短的時(shí)間內(nèi)可以抑制細(xì)胞的增殖,而隨著作用時(shí)間的增加,乙酸乙酯萃取物的抑制效果較好,這可能與乙酸乙酯萃取物中黃銅和多酚的含量較高有關(guān)。

表3 菱角殼萃取物作用不同時(shí)間抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖的IC50(μg/mL)Table 3 IC50 of inhibition of gastric cancer SGC-7901 cell proliferation by water chestnut extract at different times(μg/mL)

2.2.3 菱角殼萃取物對(duì)人肝癌Hep G2細(xì)胞增殖的影響 由表4可以看出,兩種菱角殼萃取物作用肝癌細(xì)胞Hep G2,肝癌細(xì)胞活力受到明顯抑制,呈現(xiàn)一定劑量效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng)。400 μg/mL的

表4 菱角殼萃取物對(duì)肝癌細(xì)胞Hep G2增殖抑制作用Table 4 Inhibition of hepatocellular carcinoma cell Hep G2 proliferation by water chestnut shell extract

乙酸乙酯、正丁醇萃取物處理肝癌細(xì)胞48 h,其抑制率均達(dá)到90%以上。同一濃度相同作用時(shí)間,乙酸乙酯萃取物對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制率要高于正丁醇萃取物對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制率。武蕊娟等[32]從藥用植物馬甲子葉醇提物中通過體外抗Hep G2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯萃取部位具有較好抗腫瘤活性。

2.2.4 菱角殼萃取物對(duì)肝癌Hep G2細(xì)胞增殖的IC50從表5可以看出,不同萃取物對(duì)肝癌細(xì)胞的作用效果不同,且隨著作用時(shí)間的增加,它們的IC50值逐漸減小。乙酸乙酯萃取物作用肝癌Hep G2細(xì)胞48 h后,IC50值為 64.07 μg/mL,R2=0.87;正丁醇萃取物作用肝癌Hep G2細(xì)胞 48 h 后,IC50值為106.70 μg/mL,R2=0.90。Hep G2細(xì)胞對(duì)乙酸乙酯萃取物耐受程度更低,在較低濃度處理時(shí)即可抑制半數(shù)細(xì)胞的增殖。

表5 菱角殼萃取物作用不同時(shí)間抑制肝癌Hep G2細(xì)胞增殖的IC50(μg/mL)Table 5 IC50 of inhibition of Hep G2 cells by water(μg/mL)at different times

2.3 菱角殼萃取物對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響

2.3.1 菱角殼萃取物對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響 如圖1和圖2所示,菱角殼萃取物處理24 h,在25、50 μg/mL濃度時(shí),胃癌細(xì)胞SGC-7901沒有發(fā)生明顯凋亡,隨著萃取物濃度的增加,胃癌細(xì)胞凋亡率呈上升趨勢(shì)。400 μg/mL的乙酸乙酯萃取物誘導(dǎo)24 h,31.01%的胃癌SGC-7901細(xì)胞發(fā)生明顯凋亡,9.24%為早期凋亡,21.77%為晚期凋亡。400 μg/mL的正丁醇萃取物誘導(dǎo)24 h,有21.65%的胃癌SGC-7901細(xì)胞發(fā)生明顯凋亡,7.47%為早期凋亡,14.18%為晚期凋亡。牛鳳蘭等[33]研究發(fā)現(xiàn)菱角殼提取物可以抑制胃癌細(xì)胞的增殖。通過不同萃取物作用胃癌細(xì)胞發(fā)現(xiàn)低濃度的萃取物對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡作用不明顯,高濃度的萃取物可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡,同一濃度相同作用時(shí)間,乙酸乙酯萃取物比正丁醇萃取物更能促進(jìn)胃癌SGC-7901細(xì)胞發(fā)生凋亡。

圖1 正丁醇萃取物促進(jìn)胃癌SGC-7901細(xì)胞的凋亡Fig.1 n-butanol extract promotes apoptosis of gastric cancer SGC-7901 cells

圖2 乙酸乙酯萃取物促進(jìn)胃癌SGC-7901細(xì)胞的凋亡Fig.2 Ethyl acetate extract promotes apoptosis of gastric cancer SGC-7901 cells

2.3.2 菱角殼萃取物對(duì)人肝癌Hep G2細(xì)胞凋亡的影響 如圖3和圖4所示在25～200 μg/mL的濃度范圍內(nèi)兩種萃取物對(duì)肝癌細(xì)胞的凋亡無明顯的促進(jìn)作用。400 μg/mL的正丁醇萃取物誘導(dǎo)24 h,33.34%的肝癌Hep G2細(xì)胞發(fā)生明顯凋亡,其中19.96%為早期凋亡,13.38%為晚期凋亡。400 μg/mL的乙酸乙酯萃取物誘導(dǎo)24 h,45.57%的肝癌Hep G2細(xì)胞發(fā)生明顯凋亡,20.85%為早期凋亡,24.72%為晚期凋亡。低濃度的萃取物對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡作用不明顯,同一濃度相同作用時(shí)間,乙酸乙酯萃取物促肝癌Hep G2細(xì)胞凋亡的效果較好。謝艷茹等[34]研究發(fā)現(xiàn)菱角提取物能誘導(dǎo)肝癌SMMC-7721 細(xì)胞凋亡,但關(guān)于菱角殼萃取物對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的研究尚未見其他報(bào)道。

圖3 正丁醇萃取物促進(jìn)肝癌Hep G2細(xì)胞的凋亡Fig.3 n-butanol extract promotes apoptosis in hepatoma Hep G2 cells

圖4 乙酸乙酯萃取物促進(jìn)肝癌Hep G2細(xì)胞的凋亡Fig.4 Ethyl acetate extract promotes apoptosis in Hep G2 cells

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過萃取得到菱角殼乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物,測(cè)得菱角殼乙酸乙酯萃取物中黃酮和多酚的含量分別為(335.10±0.004)、(723.10±0.022) mg/g。采用CCK-8法檢測(cè)兩種菱角殼萃取物對(duì)SGC-7901、Hep G2細(xì)胞增殖的影響,結(jié)果表明菱角殼乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物均能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖,呈濃度和劑量依賴性。乙酸乙酯萃取物對(duì)胃癌細(xì)胞的抑制效果最好,其IC50值最小。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度的菱角殼萃取物對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響。乙酸乙酯、正丁醇萃取物濃度為400 μg/mL時(shí),肝癌細(xì)胞凋亡率分別為45.57%、33.34%;胃癌細(xì)胞凋亡率分別為31.01%、21.65%。菱角殼乙酸乙酯萃取物促肝癌細(xì)胞凋亡效果較明顯。

綜上所述,菱角殼萃取物可以有效抑制肝癌和胃癌細(xì)胞增殖,乙酸乙酯萃取物促肝癌Hep G2細(xì)胞凋亡效果較好。為菱角殼的深加工及菱角殼萃取物抗癌作用機(jī)理的研究提供了一定的理論基礎(chǔ)。