胡金強(qiáng),黃潤(rùn)娜,王 一,趙衛(wèi)東,高 輝,姜春鵬,耿 堯,景建洲,董彩文,王章存

(1.鄭州輕工業(yè)學(xué)院,食品與生物工程學(xué)院,河南鄭州 450000; 2.河南省食品安全國際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室,河南鄭州 450000; 3.食品生產(chǎn)與安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心,河南鄭州 450000; 4.河南省冷鏈?zhǔn)称焚|(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南鄭州 450000)

近年來,國內(nèi)外食品安全事件層出不窮,食源性致病菌在全世界廣泛分布并每年造成成千上萬例人類疾病。據(jù)WHO公布的信息,全球每年發(fā)生食源性疾病達(dá)數(shù)10億起。美國疾病控制與預(yù)防中心估計(jì),每年約有4800萬例食源性疾病患者,其中12.8萬人入院治療,3000人死亡[1]。據(jù)報(bào)道,2018年4月,美國農(nóng)業(yè)部(USDA)宣布召回得克薩斯州標(biāo)準(zhǔn)肉制品公司生產(chǎn)的約5.3萬磅可能受沙門氏菌污染的生牛肉產(chǎn)品[2];同月,美國食品與藥物管理局(FDA)宣布,美國北卡羅來納州海德縣一家養(yǎng)雞場(chǎng)自愿召回2.07億枚懷疑被沙門氏菌污染的雞蛋[3]。在我國,威脅食品安全的最大問題同樣是致病微生物引起的食品污染。據(jù)國家衛(wèi)計(jì)委通報(bào),2015年度,我國微生物性食物中毒人數(shù)高達(dá)3181人,占全年食物中毒總?cè)藬?shù)的53.7%,為食物中毒人數(shù)之最[4]。以上數(shù)據(jù)表明,食源性致病菌污染已成為食品安全的首要隱患,是世界頭號(hào)食品安全問題,迫切需要建立快速、靈敏、特異、高效的檢測(cè)技術(shù)對(duì)食源性致病菌進(jìn)行預(yù)防、控制以及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。

目前針對(duì)食品中致病菌檢測(cè),主要采用傳統(tǒng)(改進(jìn))培養(yǎng)鑒定技術(shù)[5]、PCR及其衍生技術(shù)[6-8]以及免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)[9]等手段。然而,傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)周期長(zhǎng)、靈敏度不高、樣品處理繁瑣;PCR及其衍生技術(shù)使用的儀器昂貴、檢測(cè)易出現(xiàn)假陽性結(jié)果;免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)存在抗體制備周期長(zhǎng)、成本高等缺陷,已不能滿足食品安全對(duì)食源性致病菌進(jìn)行快速、靈敏、特異檢測(cè)的需求[10]。

核酸適配體是一段能特異性識(shí)別并結(jié)合靶分子的15～40個(gè)堿基寡核苷酸片段[11]。核酸適配體的概念在1990年由Ellington和Szostak[12]最早提出并命名,同年,Tuerk與Gold[13]首次提出這種新的體外篩選與擴(kuò)增核酸的方法-指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(System aticevolution ofligandsby exponential enrichment,SELEX),并且利用該技術(shù)篩選出可與T4 DNA聚合酶特異性結(jié)合的隨機(jī)寡核苷酸。迄今為止,已有200多種靶物質(zhì)的核酸適配體得到篩選[14]。核酸適配體可有效識(shí)別如生物大分子[15]、細(xì)菌[16]、細(xì)胞[17]、小分子[18]、病毒[19]等各種目標(biāo)物,具有篩選周期短、高親和性、高特異性以及適用范圍廣泛等技術(shù)優(yōu)勢(shì),已在重金屬與抗生素檢測(cè)[20]、藥物篩選[21]、物質(zhì)分離與純化以及疾病診斷與治療[22-23]以及食源性致病菌檢測(cè)[24]等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。本文主要從核酸適配體的篩選技術(shù)分類以及在食源性致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用等方面進(jìn)行簡(jiǎn)要概述。

1 適配體的篩選技術(shù)分類

目前,根據(jù)篩選過程中是否涉及序列擴(kuò)增富集,適配體篩選技術(shù)主要可分為SELEX和Non-SELEX兩大類。

1.1 SELEX篩選適配體

當(dāng)前,多數(shù)適配體采用SELEX技術(shù)進(jìn)行篩選。SELEX主要包括毛細(xì)管電泳-SELEX(Capillary electrophoresis SELEX)、親和層析-SELEX、全細(xì)胞-SELEX、磁珠-SELEX、微流控-SELEX等方法。核酸適配體篩選過程主要包括4個(gè)步驟:a.建立文庫:人工合成一個(gè)含核酸序列數(shù)大約為1013～1015的單鏈隨機(jī)寡核苷酸文庫;b.孵育:將靶標(biāo)與建立的文庫在一定條件下孵育,形成適配體-靶標(biāo)復(fù)合物;c.分離:孵育后,通過離心、濾膜過濾等分離方法使與靶標(biāo)結(jié)合力強(qiáng)與未結(jié)合(結(jié)合力弱)的核酸序列進(jìn)行分離;d.擴(kuò)增:分離后的DNA或RNA序列經(jīng)PCR(RT-PCR)進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)分離與純化,制備次級(jí)文庫,進(jìn)行下一輪篩選。經(jīng)數(shù)輪篩選后可得到高親和力與高特異性的適配體[25]。針對(duì)食源性致病菌適配體的SELEX篩選主要采用全細(xì)胞-SELEX、磁珠-SELEX、親和層析-SELEX等技術(shù)方法。

全細(xì)胞-SELEX是以全細(xì)胞作為靶物質(zhì),在一定程度上拓寬了SELEX篩選靶標(biāo)范圍,而且避免了靶標(biāo)的純化過程。磁珠-SELEX具有球形展示面,便于靶標(biāo)展示以及具有便捷的磁性分離特性。親和層析-SELEX篩選技術(shù)不僅具有成本低、重復(fù)性等特點(diǎn),而且可用來研究靶分子的結(jié)合位點(diǎn)。

1.2 Non-SELEX篩選適配體

Non-SELEX由Berezovski等[26]首次提出并應(yīng)用于h-RAS蛋白適配體篩選,與SELEX不同的是,Non-SELEX是以縮短篩選周期為目的的高效篩選方法,不需要進(jìn)行PCR等核酸序列擴(kuò)增步驟,經(jīng)過2～3次分離、分析篩選步驟后直接可得到適配體序列。Kim等[34]利用平衡混合物的非平衡毛細(xì)管電泳篩選方法經(jīng)3輪Non-SELEX篩選便得到了能特異性結(jié)合大腸桿菌O55∶B5脂多糖的適配體。常規(guī)SELEX篩選技術(shù)通常需要經(jīng)過8～15輪篩選,篩選周期為1～3個(gè)月,與之相比,Non-SELEX篩選技術(shù)可在幾天甚至幾小時(shí)內(nèi)完成適配體篩選全過程,極大地縮短了篩選周期。然而,Non-SELEX篩選技術(shù)需要利用毛細(xì)電泳儀進(jìn)行篩選,有一定局限性,多用于大分子物質(zhì)的適配體篩選。

截止目前,通過SELEX與Non-SELEX已篩選適用于大腸桿菌[27-34]、沙門氏菌[35-44]、金黃色葡萄球菌[45-52]、副溶血弧菌[41,53-54]、單核增生李斯特菌[55-56]、蠟樣芽孢桿菌[57]、志賀氏菌[58-59]以及銅綠假單胞菌[60]等諸多食源性致病菌適配體(表1)。此類適配體可直接用于構(gòu)建基于適配體的快速、靈敏、特異的食源性致病菌檢測(cè)技術(shù)。

表1 食源性致病菌檢測(cè)相關(guān)適配體Table 1 Aptamers for the detection of foodborne pathogens

續(xù)表

2 適配體在食源性致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用

2.1 納米金適配體技術(shù)

納米金為直徑在1～100 nm之間的納米材料。納米金由于簡(jiǎn)便的制備方法、良好的生物相容性、優(yōu)異的催化活性、獨(dú)特的物理與光學(xué)性質(zhì)等優(yōu)點(diǎn),已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)[61]。適配體與納米金技術(shù)結(jié)合可構(gòu)建高靈敏度、高特異性快速檢測(cè)技術(shù),適配體與納米金在溶液中結(jié)合,當(dāng)靶目標(biāo)存在時(shí),適配體作為識(shí)別與捕獲因子特異性地結(jié)合目標(biāo)菌,引起納米金狀態(tài)發(fā)生改變。基于狀態(tài)變化,可對(duì)靶目標(biāo)進(jìn)行定性與定量分析。目前,納米金適配體技術(shù)已應(yīng)用于銅綠假單胞菌[60]和鼠傷寒沙門氏菌等食源性致病菌[37]的檢測(cè)。將銅綠假單胞菌的適配體與超順磁性氧化鐵納米粒子共價(jià)結(jié)合建立方法,在加入目標(biāo)菌后通過測(cè)量自旋-自旋弛豫時(shí)間(T2)的增加可以對(duì)靶物質(zhì)進(jìn)行定量測(cè)定,已應(yīng)用于雞肉與飲用水樣品中銅綠假單胞菌檢測(cè),該方法可以在40 min內(nèi)完成檢測(cè),檢測(cè)限為50 CFU/mL[60],該方法具有靈敏度高,操作簡(jiǎn)捷,反應(yīng)迅速和良好選擇性等優(yōu)點(diǎn),可實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜食品基質(zhì)中的銅綠假單胞菌進(jìn)行快速檢測(cè),然而缺點(diǎn)是儀器昂貴,不適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。此外,可將適配體作為識(shí)別與捕獲元素,結(jié)合納米金標(biāo)銀增強(qiáng)信號(hào)放大技術(shù),可實(shí)現(xiàn)對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的可視化檢測(cè)。在最佳條件下,菌液濃度為101～106CFU/mL(R2=0.9913)時(shí),鼠傷寒沙門氏菌濃度與信號(hào)強(qiáng)度呈線性相關(guān),檢測(cè)限為7 CFU/mL[37],該方法檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)檢測(cè)法一致,可對(duì)實(shí)際食品樣品中的鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)行靈敏、快速、直觀的檢測(cè)。適配體結(jié)合靶分子的高親和力和特異性,確保了該檢測(cè)技術(shù)的高靈敏度與高特異性,可滿足食源性致病菌的快速檢測(cè)要求,未來可向多重檢測(cè)方向發(fā)展。

2.2 熒光適配體技術(shù)

熒光檢測(cè)具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)、定量精準(zhǔn)等優(yōu)點(diǎn),與核酸適配體技術(shù)結(jié)合更能發(fā)揮技術(shù)優(yōu)勢(shì)[62]。適配體與熒光標(biāo)記技術(shù)結(jié)合,是基于適配體與靶物質(zhì)作用后發(fā)生熒光強(qiáng)度改變以檢測(cè)食源性致病菌,利用熒光基團(tuán)或淬滅基團(tuán)修飾適配體,加入目標(biāo)菌后適配體構(gòu)象發(fā)生改變引起熒光信號(hào)差異。近年來,熒光適配體技術(shù)已用于沙門氏菌O8[43]、單核細(xì)胞增生李斯特菌[56]、金黃色葡萄球菌[63]和宋內(nèi)氏志賀氏菌[59]等食源性致病菌的快速、靈敏、特異性檢測(cè)。建立單核細(xì)胞增生李斯特菌熒光適配體技術(shù),首先,應(yīng)用全細(xì)胞-SELEX技術(shù)篩選出與靶細(xì)菌結(jié)合效果最好的熒光修飾適配體A15,然后將生物素化的適配體A15固定在微孔板上形成夾心型結(jié)構(gòu)捕獲靶標(biāo),適配體與細(xì)菌親和形成的復(fù)合物與羧基熒光素(FAM)標(biāo)記的適配體A15結(jié)合,并用SpectraMax M5分光光度計(jì)測(cè)定熒光強(qiáng)度,檢測(cè)限為75 CFU/mL[56],該方法具有良好的檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特菌生長(zhǎng)的能力,研究還證實(shí),適配體的靶分子非常廣泛并且可以用不同表位捕獲靶標(biāo)。Maeng等[63]根據(jù)RNA適配體熒光強(qiáng)度的變化,開發(fā)了檢測(cè)金黃色葡萄球菌等致病菌的檢測(cè)系統(tǒng),將篩選出的RNA適配體通過硫醇基團(tuán)固定在銀膜上,RNA適配體捕獲的細(xì)菌可通過添加適配體-dT-FAM后發(fā)射熒光量的增加而被檢測(cè)到。該方法操作簡(jiǎn)捷、快速、特異性強(qiáng)。宋內(nèi)氏志賀氏菌的熒光適配體檢測(cè)技術(shù)建立,通過使用全細(xì)胞-SELEX技術(shù)篩選得到最優(yōu)適配體SS-3與SS-4,然后在5′端分別以5′-胺修飾的SS-4與Cy5標(biāo)記的SS-3合成捕獲探針與檢測(cè)探針來檢測(cè)與鑒別宋內(nèi)氏志賀氏菌,檢測(cè)限為103cells/mL[59],研究表明,建立的熒光適配體傳感器平臺(tái)可特異性檢測(cè)多種食物中的宋內(nèi)氏志賀氏菌。

綜上所述,熒光適配體技術(shù)已在多種致病菌檢測(cè)中得到應(yīng)用,此外,對(duì)該技術(shù)的研究一方面有利于質(zhì)量控制和食品安全,對(duì)開發(fā)其它致病菌的快速、靈敏檢測(cè)方法具有重要意義;另一方面,這種方法未來可向多種病原菌同時(shí)檢測(cè)的便攜式檢測(cè)方向發(fā)展,具有良好的應(yīng)用前景。

2.3 電化學(xué)適配體技術(shù)

電化學(xué)檢測(cè)方法具有操作簡(jiǎn)便、成本低廉、靈敏度高、儀器簡(jiǎn)單,適用于便攜式設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)[40]。適配體與電化學(xué)技術(shù)結(jié)合,是將適配體與電化學(xué)活性傳感元件固定在電極上,加入靶物質(zhì)后,適配體與靶物質(zhì)結(jié)合導(dǎo)致電極表面修飾物結(jié)構(gòu)改變,通過檢測(cè)電化學(xué)信號(hào)或電流變化進(jìn)行定性與定量檢測(cè)。當(dāng)前,電化學(xué)適配體技術(shù)已用于檢測(cè)大腸桿菌O111[33]、大腸桿菌O55∶B5[34]、葡萄球菌腸毒素B[49]和金黃色葡萄球菌[64]等食源性致病菌及其毒素。建立檢測(cè)大腸桿菌O111的電化學(xué)適配體生物傳感器技術(shù),需先將捕獲探針通過Au-硫醇錨定在電極表面上,適配體因與捕獲探針雜交被固定在金電極表面,當(dāng)目標(biāo)菌存在時(shí),適配體會(huì)識(shí)別、結(jié)合目標(biāo)菌并脫離捕獲探針,捕獲探針與生物素化檢測(cè)探針結(jié)合后留在電極表面,加入識(shí)別元件鏈霉抗堿性磷酸酶后產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào),該技術(shù)可在3.5 h內(nèi)可實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)致病菌的精確定量,對(duì)牛奶樣品中目標(biāo)菌的檢測(cè)限為305 CFU/mL[33],是一種特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高、靈敏、快速的檢測(cè)技術(shù)。利用電化學(xué)法拉第阻抗理論開發(fā)了檢測(cè)牛奶中葡萄球菌腸毒素B(staphylococcal enterotoxin B,SEB)的無標(biāo)記、簡(jiǎn)便的電化學(xué)適配體生物傳感器技術(shù),當(dāng)樣品中存在SEB時(shí),由于適配體對(duì)SEB有高特異性與親和性,使SEB組裝在金電極表面上,阻止[Fe(CN)6]3-/4-進(jìn)入電極表面進(jìn)行有效電子轉(zhuǎn)移,得到[Fe(CN)6]3-/4-的大法拉第阻抗反應(yīng);當(dāng)在樣品中不存在SEB時(shí),只有適配體與巰基己醇(MCH)組裝在電極表面上,導(dǎo)致有效的電子轉(zhuǎn)移,產(chǎn)生小法拉第阻抗反應(yīng)。結(jié)果顯示,在0.5～500 ng/mL范圍內(nèi),Ret與SEB的濃度對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系,檢出限為0.17 ng/mL(S/N=3)[49],該檢測(cè)技術(shù)與ELISA商品化試劑盒檢測(cè)結(jié)果一致,具有良好的適用性與可靠性。Abbaspour等[64]設(shè)計(jì)了一種基于雙適配體的電化學(xué)夾心傳感器測(cè)定法檢測(cè)金黃色葡萄球菌,固定在磁珠表面上的初級(jí)適配體捕獲金黃色葡萄球菌,與銀納米顆粒綴合的次級(jí)適配體提供限定的電化學(xué)特性,顯著提高了檢測(cè)的靈敏度,應(yīng)用釋放的Ag+離子進(jìn)行差示脈沖陽極溶出伏安(DPV)信號(hào)的測(cè)量,以對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行定性與定量檢測(cè)。該方法靈敏度高,對(duì)適配體常規(guī)檢測(cè)方法無法檢測(cè)的微量細(xì)菌的檢測(cè)提供了新方法。

電化學(xué)適配體技術(shù)既可進(jìn)行有標(biāo)記的檢測(cè)也可進(jìn)行無標(biāo)記的簡(jiǎn)單檢測(cè)。相比于其他技術(shù),電化學(xué)適配體傳感器技術(shù)更易于實(shí)現(xiàn)小型化檢測(cè),具有檢測(cè)成本低、靈敏度高、響應(yīng)快、設(shè)計(jì)方便且適用性強(qiáng)、檢測(cè)限低等特點(diǎn),已成為食品中病原微生物檢測(cè)的有力工具。

2.4 流式細(xì)胞適配體技術(shù)

流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometry,FCM),是應(yīng)用流式細(xì)胞儀對(duì)單個(gè)細(xì)胞或微粒進(jìn)行多參數(shù)定量分析與分選的檢測(cè)技術(shù),具有快速、靈敏、精確以及便于操作等突出優(yōu)點(diǎn)[65]。適配體與流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合,是對(duì)適配體進(jìn)行熒光標(biāo)記后，應(yīng)用流式細(xì)胞儀通過熒光分析對(duì)靶物質(zhì)進(jìn)行定性與定量檢測(cè)。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù),以熒光標(biāo)記的核酸適配體為識(shí)別分子,構(gòu)建的檢測(cè)與鑒別金黃色葡萄球菌的新技術(shù)特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)捷,40 min即可從濃度為108～109CFU/mL混合菌液中準(zhǔn)確鑒別金黃色葡萄球菌[47]。Duan等[53]采用流式細(xì)胞儀對(duì)FAM標(biāo)記的副溶血弧菌適配體進(jìn)行特異性與親和力分析,篩選出最佳適配體,并在之后建立同時(shí)檢測(cè)副溶血性弧菌與鼠傷寒沙門氏菌的流式細(xì)胞適配體技術(shù),該技術(shù)應(yīng)用量子點(diǎn)分別標(biāo)記副溶血性弧菌與鼠傷寒沙門氏菌適配體,量子點(diǎn)-適配體復(fù)合物與副溶血弧菌結(jié)合后顯示出綠色熒光,與鼠傷寒沙門氏菌結(jié)合后顯示為橙色熒光,采用流式細(xì)胞術(shù)通過熒光分析進(jìn)行定性與定量檢測(cè),兩種細(xì)菌的檢測(cè)限均為5×103CFU/mL，可在蝦樣品中對(duì)目標(biāo)菌進(jìn)行特異性定量檢測(cè)[41]。該方法具有檢測(cè)速度快、特異性強(qiáng)、分析全面等技術(shù)優(yōu)點(diǎn)。

食品樣本往往存在多種微生物污染,實(shí)現(xiàn)食源性致病菌的高通量鑒別是未來檢測(cè)發(fā)展趨勢(shì)。流式細(xì)胞術(shù)可通過多種適配體同時(shí)使用,實(shí)現(xiàn)食源性致病菌的多重檢測(cè)。然而該方法涉及的流式細(xì)胞儀價(jià)格昂貴、熒光染料成本較高、樣品前處理繁瑣,目前僅適用于實(shí)驗(yàn)室的基礎(chǔ)研究,工業(yè)化應(yīng)用不多。

2.5 表面增強(qiáng)拉曼散射適配體技術(shù)

表面增強(qiáng)拉曼散射(surface-enhanced Raman scattering,SERS)技術(shù)以其極高的靈敏度、熒光背景低、對(duì)檢測(cè)樣品無損等優(yōu)勢(shì),廣泛應(yīng)用于化學(xué)工業(yè)分析、生物分析以及醫(yī)學(xué)檢測(cè)等諸多領(lǐng)域[66]。利用適配體與表面增強(qiáng)拉曼技術(shù)結(jié)合可構(gòu)建便捷、靈敏、特異的傳感器。建立檢測(cè)副溶血弧菌的表面增強(qiáng)拉曼適配體傳感器,需合成SiO2@Au核殼納米粒子(NPs)并制備有效的SERS基底,在靶標(biāo)存在時(shí),固定在SiO2@Au核殼NPs表面的適配體1(apt 1)與花青染料3(Cy3)修飾的適配體2(apt 2),形成了SiO2@Au-apt 1-target-apt 2-Cy3三明治樣復(fù)合物。在最佳條件下,SERS信號(hào)與菌液濃度10～106CFU/mL線性相關(guān),檢測(cè)限為10 CFU/mL[54],該方法靈敏度高,選擇性強(qiáng),可實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌的直接檢測(cè),無需提取病原基因組,對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)與標(biāo)準(zhǔn)平板法檢測(cè)結(jié)果一致,符合率高。Ravindranath等[67]將抗鼠傷寒沙門氏菌、抗金黃色葡萄球菌以及抗大腸桿菌O157∶H7抗體分別用金(Au)、銀(Ag)和銀金核殼納米粒子進(jìn)行功能化標(biāo)記,應(yīng)用拉曼與紫外-可見吸收光譜同時(shí)檢測(cè)三種不同的病原體。該平臺(tái)可特異性捕獲靶細(xì)菌以及從細(xì)菌混合物中檢測(cè)特定病原體,該方法可在30 min內(nèi)檢測(cè)雞尾酒中多種病原體的存在,檢測(cè)限為102～103CFU/mL。建立的新技術(shù)可實(shí)現(xiàn)致病菌的高通量檢測(cè),并具有可擴(kuò)展到多種應(yīng)用潛力,為其他適配體新技術(shù)的開發(fā)提供理論指導(dǎo)。Li等[38]提出了一種基于表面增強(qiáng)拉曼散射快速靈敏檢測(cè)鼠傷寒沙門氏菌的適配體傳感器,互補(bǔ)DNA(cDNA)和靶標(biāo)與適配體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合,導(dǎo)致適配體構(gòu)象發(fā)生改變,分散的金納米棒(GNRs)和SERS“熱點(diǎn)”形成的等離子體耦合導(dǎo)致拉曼光譜極大增強(qiáng),以對(duì)氨基苯硫酚(PATP)作為拉曼活性信號(hào)分子,在菌液濃度為56～56×107CFU/mL范圍內(nèi),檢測(cè)信號(hào)與菌液含量呈線性相關(guān),檢測(cè)限為9 CFU/mL。該方法已用于牛奶樣品中鼠傷寒沙門氏菌的檢測(cè)。表面增強(qiáng)拉曼散射適配體技術(shù)具有較寬的線性范圍以及極低的檢出限,是檢測(cè)食源性致病菌檢測(cè)中極具發(fā)展前景的技術(shù)手段。隨著納米技術(shù)的進(jìn)步,更多靈敏的、可重復(fù)性的SERS基底將被制備,未來可實(shí)現(xiàn)商業(yè)化。此外,便攜式拉曼光譜儀的設(shè)計(jì)與使用有利于實(shí)現(xiàn)食源性致病菌的現(xiàn)場(chǎng)快速分析。

綜上,基于適配體的檢測(cè)技術(shù)在食源性致病菌檢測(cè)得到廣泛應(yīng)用,這些技術(shù)具有高特異性與較高的靈敏度,可對(duì)食品中的致病菌進(jìn)行快速、高效的檢測(cè)。然而,該技術(shù)方法也具有一定的缺陷性,例如,使用儀器昂貴、樣品前處理復(fù)雜等。因此,研究者可根據(jù)研究需求以及實(shí)驗(yàn)條件選擇合適的適配體檢測(cè)技術(shù)(見表2)。

表2 適配體技術(shù)對(duì)比Table 2 Comparison between aptamer technologies

3 結(jié)語與展望

核酸適配體具有特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、靈敏度高、親和力強(qiáng)、易于修飾等特點(diǎn),能夠識(shí)別多種目標(biāo)物,與納米金、熒光、電化學(xué)、流式、表面增強(qiáng)拉曼等技術(shù)相結(jié)合,可進(jìn)一步提高檢測(cè)的靈敏度,降低檢測(cè)成本,縮短檢測(cè)時(shí)間,因此在食源性致病菌檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用。然而,適配體技術(shù)在食源性致病菌檢測(cè)相關(guān)技術(shù)依然存在適配體篩選效率低,高通量與多重同時(shí)檢測(cè)關(guān)鍵技術(shù)欠缺,相關(guān)儀器設(shè)備體型龐大、價(jià)格昂貴等瓶頸,難以滿足現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)需求。

核酸適配體技術(shù)可從如下幾個(gè)方面進(jìn)行深入研究。應(yīng)用石墨烯SELEX、細(xì)胞芯片SELEX以及高保真SELEX等新型SELEX篩選技術(shù)進(jìn)一步提高適配體篩選效率與質(zhì)量;將適配體與核酸新型重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)等相結(jié)合,大幅降低病原菌檢測(cè)限以及檢測(cè)速度;研究適配體與微流控芯片相結(jié)合技術(shù),實(shí)現(xiàn)食源性致病菌的高通量、自動(dòng)化檢測(cè);探索適配體與側(cè)流層析技術(shù)結(jié)合方法,對(duì)病原微生物實(shí)現(xiàn)可視化檢測(cè);將適配體與ELISA技術(shù)等結(jié)合,并實(shí)現(xiàn)對(duì)大規(guī)模食品中的病原菌進(jìn)行快速分析,降低檢測(cè)成本;將適配體與熒光技術(shù)結(jié)合并借助智能手機(jī)實(shí)現(xiàn)便攜式一體化檢測(cè)。綜上所述,核酸適配體在食源性致病菌監(jiān)測(cè)、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估以及控制等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。