張開慧

（寶雞職業(yè)技術(shù)學院，陜西 寶雞 721013）

在生命科學中，基因克隆、基因診斷、基因治療、基因功能分析以及DNA的定量分析等基因水平的研究都離不開高質(zhì)量核酸的獲取。在體內(nèi)，核酸和各種蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，提取高效率、高純度核酸很困難，而這一步的操作是后續(xù)工作的基礎(chǔ)，直接決定著后續(xù)工作的成敗與否，因此如何有效地提取和純化核酸一直是生命科學領(lǐng)域工作者關(guān)注的焦點。

目前，核酸的提取方法已經(jīng)朝著專業(yè)化、自動化方向發(fā)展，開發(fā)出了很多試劑盒，并且與儀器相結(jié)合從而實現(xiàn)了核酸的自動化抽提，使得核酸的提取過程大大簡化，能夠滿足基因水平研究的需求。與手工方法相比，自動化方法有以下優(yōu)勢：節(jié)省時間，程序簡化，提取效率高，純化程度高，重復性好，因此能很好地避免假陰性與交叉感染[1-2]。本文介紹了MP系列核酸自動提取儀，它采用先進的磁珠分離技術(shù)，結(jié)合磁珠分離試劑盒，能夠自動從多種樣品如全血、血清、組織、細胞中分離出高純度的核酸，儀器運動控制穩(wěn)定，結(jié)果可靠，提取效率高，純度高并實現(xiàn)了自動化；它有效地降低了工作人員的勞動強度，簡化了提取流程，縮短了提取時間，避免了人工操作中的失誤和試劑污染風險；生物制備過程更安全、更有效，是生命科學研究的有效工具。

1 核酸提取的幾種方法

核酸是復雜的生物大分子，在機體內(nèi)與各種蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，得到高質(zhì)量的核酸是后續(xù)研究的基礎(chǔ)，直接決定后續(xù)工作的成敗。因此在提取過程中要遵循以下原則：提取盡可能充分，保證一級結(jié)構(gòu)的完整性，避免蛋白質(zhì)、脂類物質(zhì)和多糖等生物大分子的污染，并且盡可能縮短和簡化提取流程。常見的核酸提取方法有基于酚氯仿促使蛋白質(zhì)變性的抽提法、高鹽沉淀蛋白質(zhì)的鹽析法、通過玻璃珠吸附核酸的玻璃珠法、高鹽吸附核酸低鹽解離核酸的硅膠柱法和官能團吸附核酸的磁珠分離法。

1.1 酚氯仿抽提法

冷泉港實驗室最早提出了酚氯仿抽提法分離純化核酸，后經(jīng)科研工作者的不懈努力，不斷改良使用。該方法是目前使用最廣泛、最經(jīng)典的核酸分離純化技術(shù)。其原理主要基于以下事實[3]：酚氯仿可使蛋白質(zhì)變性，DNA易溶于水，不溶于有機溶劑，從而沉淀蛋白，然后除去。先將材料裂解，之后與酚氯仿充分混勻，一段時間后蛋白質(zhì)變性，通過離心后由上而下形成三層，上層為含核酸的水相層，中間為主要含蛋白質(zhì)的乳化層和下層的酚氯仿有機層，吸取上層水相就能將蛋白質(zhì)和核酸有效地分開，這一技術(shù)的最大優(yōu)點就是經(jīng)濟、靈活,提取的核酸純度高，但是提取過程較復雜，操作不當會影響核酸的完整性，使用的是有毒有機溶劑。

1.2 鹽析法

該技術(shù)的原理是[3]：組織、細胞在裂解液中裂解后，加入高鹽（NaCl、NH4Cl、KAC）促使蛋白質(zhì)變性形成不溶性物質(zhì)而除去，從而將雜質(zhì)和核酸得以分離。鹽析法的最大優(yōu)點是經(jīng)濟、實惠、安全，但雜質(zhì)除去不徹底，目前市場上已經(jīng)開發(fā)出試劑盒。

1.3 玻璃珠法

玻璃珠法的原理是主要利用玻璃珠在高離液鹽（鹽酸胍、NaI、異硫氰酸胍）條件下與核酸發(fā)生吸附反應，在低離液鹽濃度下核酸會被洗脫下來，從而達到核酸和蛋白質(zhì)、糖、脂質(zhì)等雜質(zhì)分離，但是由于玻璃珠的殘留以及干燥問題的影響，目前大部分公司都已經(jīng)不采用此種方法。

1.4 硅膠柱法（濾膜法）

硅膠柱法是核酸提取的里程碑。它利用的是一種特殊的玻璃纖維膜，該膜在高鹽條件下能與核酸發(fā)生吸附反應，在低鹽條件下與核酸發(fā)生解離反應，而蛋白質(zhì)等雜質(zhì)不被吸附。該方法利用濾膜將抽提改變?yōu)檫^濾操作，大大減少了常規(guī)方法的離心和干燥時間，并且省去了醇類沉淀核酸的過程。

1.5 磁珠法

該方法的原理是利用表面標記了一種官能團的納米級磁珠微珠，官能團能與核酸吸附，蛋白質(zhì)等雜質(zhì)不會與磁珠吸附，磁珠可以在磁場下聚集和分散，從而實現(xiàn)將核酸與雜質(zhì)分離的目的[4-8]。純化原理與磁珠微珠的性質(zhì)有關(guān)，不同性質(zhì)的磁珠微珠原理也不同。該方法最大的優(yōu)勢是實現(xiàn)了自動化而且重復性好，徹底擺脫了傳統(tǒng)方法的離心等手工流程，MP-120即是采用這種分離方法。

2 新一代磁珠法核酸自動提取儀

本文介紹的磁珠法核酸自動提取儀具有提取效率高，選擇效率高，操作簡便靈活，自動化程度高等優(yōu)點。它可廣泛應用于生命科學研究的各個方面，如基因分型及檢測、法醫(yī)鑒定、芯片技術(shù)、血液篩查、體外臨床診斷、環(huán)境與食品分析等領(lǐng)域。

2.1 提取核酸的流程

整個核酸提取過程是通過磁棒和磁套的運動來完成的，在磁場中實現(xiàn)磁珠的收集、釋放和轉(zhuǎn)移實現(xiàn)了自動化，大大縮減了提取時間（流程如圖1）。

圖1 核酸自動提取儀提取流程示意圖

裂解：在裂解緩沖液中破壞細胞并將核酸釋放；吸附：核酸被吸附到磁珠上；清洗：通過用洗滌緩沖液徹底清洗磁珠表面三次可以除去附著在表面上的雜質(zhì)；洗脫：磁珠轉(zhuǎn)移，用洗脫緩沖液使核酸脫落；回收：去除磁珠，回收核酸溶液。

2.2 主要性能特點

2.2.1 儀器性能（見表1）

2.2.2 儀器特點 快速：在同一微孔板上一次可同時完成24個樣品的提取，大約需要15～45 min，整個提取過程快速、高通量，操作簡單，無需手動進行多次萃取、上柱、離心和移液。靈活：智能化設(shè)計，內(nèi)置標準規(guī)程，用戶也可自行編寫；操作靈活，滿足不同用戶不同試劑盒要求。安全：取消手工操作，大大降低了使用者暴露于有害試劑或生物樣品的危險?？煽浚禾崛〉暮怂豳|(zhì)量可靠，去除各類可能抑制物，保證后續(xù)實驗順利進行。

表1 處理樣品的指標參數(shù)

2.3 軟件系統(tǒng)

軟件系統(tǒng)操作程序方便靈活，用戶既可以直接運行推薦的標準規(guī)程，也可以依據(jù)自己的目的對規(guī)程進行設(shè)定修改，甚至自定義每個運動細節(jié)，如設(shè)定目標位置、速度以及震動幅度等。該提取儀的軟件配有八個常用標準動作：吸附、結(jié)合、攪拌、洗滌、洗脫、內(nèi)部干燥、外部干燥、釋放磁粒，用戶可根據(jù)具體實驗目的結(jié)合標準動作進行相應地組合，使實驗操作條件達到最佳效果。規(guī)程簡化，數(shù)十秒就能下載多個規(guī)程。

3 檢測試驗及結(jié)果

3.1 全血基因組DNA提取測試

3.1.1 方法 使用核酸提取儀進行自動提取抗凝全血和冷凍全血的基因組核酸。6份抗凝全血樣品及2份經(jīng)冷凍全血樣品各40 μl分別加于不同的無菌離心管中， 之后每支離心管各加入40μl Lysis Buffer，置56℃ 10 min后，分別移置到96孔板A排位置，再各加入90 μl Binding Buffer，10 μl磁珠,每個樣品均為180μl就可以提取出粗核酸；之后儀器會自動清洗核酸，加入試劑與加樣量如表2所示，經(jīng)過三次Washing Buffer清洗，加入Elution Buffer。按試劑盒說明的提取方法編寫提取規(guī)程，后下載到儀器，進行核酸自動提取。

表2 Washing Buffer和Elution Buffer的加樣順序與加樣量

3.1.2 結(jié)果與分析

（1）瓊脂糖凝膠電泳

用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的核酸，結(jié)果如圖2所示，表明本實驗從抗凝全血中獲得高質(zhì)量的基因組核酸，同時對經(jīng)冷凍的全血提取效果也較好，提取的基因組DNA片段大小可達30～40 kb，這樣的片段大小可滿足許多分子生物學實驗要求，比如RAPD分析、親子鑒定等。

（2）OD260/OD280、濃度與提取效率

用分光光度計測得OD260=0.117 5，OD280=0.066 7；OD260/OD280 值為1.76,接近1.8，說明所提取的DNA純度較高；

濃度計算：OD260×50μg/ml = 0.117 5×50=5.87 μg/ml；

提取效率：從40 μl全血中提取基因組DNA 的量為 5.87×0.15=0.88 μg 。

結(jié)果表明，從40 μl全血中獲得的基因組DNA純度和量可以滿足瓊脂糖凝膠電泳分析、克隆、PCR、限制性內(nèi)切酶消化等要求。

圖2 1-6：抗凝全血樣品；7-8：冷凍全血樣品；M：λDNA/HindIII+EcoRI 分子量標準

4 結(jié)論

經(jīng)多次實驗表明本研究的核酸自動提取儀和相應的試劑盒相結(jié)合，可以自動從血液、細胞、組織中分離純化高純度的核酸，且產(chǎn)物純度高、一致性好，實驗結(jié)果穩(wěn)定，提取時間短，提取效率高，自動化程度高，還具有無交叉污染、操作程序可控等優(yōu)勢。此外，高效的設(shè)計和人性化的操作理念，使核酸提取工作更輕松、簡便，從而能夠節(jié)省大量的時間和精力。