張慧 李文卿 方宇

摘 ?要：利用Illumina平臺Miseq高通量測序技術(shù)對煙草根際土壤細(xì)菌進(jìn)行高通量測序，結(jié)合相關(guān)生物信息學(xué)分析，探討了常規(guī)施肥、腐殖酸型有機(jī)無機(jī)復(fù)混肥、腐殖酸型生物有機(jī)肥和-N 20%腐殖酸型生物有機(jī)肥4種處理在煙草團(tuán)棵期和采收期根際土壤細(xì)菌群落組成、多樣性和結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果顯示，煙草根際土壤中細(xì)菌優(yōu)勢門（相對豐度>10%）為變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、酸桿菌門（Acidobacteria）;團(tuán)棵期和采收期各處理的ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)較CK均有所增加，說明施肥可以提高土壤細(xì)菌群落豐富性，其中采摘期施用腐殖酸型有機(jī)無機(jī)復(fù)混肥和腐殖酸型生物有機(jī)肥處理的ACE指數(shù)顯著高于CK;分層聚類圖在屬的水平上顯示，不同施肥處理的連作植煙土壤細(xì)菌群落存在較大差異，但這種差異不體現(xiàn)在結(jié)構(gòu)多樣性上。Heatmap圖分析結(jié)果表明，土壤pH、有機(jī)質(zhì)、養(yǎng)分等對煙草土壤細(xì)菌群落組成和多樣性存在影響。施用常規(guī)肥和-N 20%腐殖酸型生物有機(jī)肥對煙草土壤細(xì)菌優(yōu)勢類群的相對豐度及群落結(jié)構(gòu)的影響大于施用腐殖酸型有機(jī)無機(jī)復(fù)混肥和腐殖酸型生物有機(jī)肥，但施用腐殖酸型有機(jī)無機(jī)復(fù)混肥和腐殖酸型生物有機(jī)肥可以提高土壤細(xì)菌的多樣性。

關(guān)鍵詞：烤煙;腐殖酸型生物有機(jī)肥;高通量測序;土壤細(xì)菌群落

中圖分類號 S147.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 1007-7731（2019）10-0029-07

Abstract： This paper aimed to study the tobacco soil bacteria of different fertilizer application， the influence of structure and diversity， the deepening understanding of tobacco soil microbial groups and the community structure changes.The technology of high-throughput sequencing on Illumina MiSeq platform was adopted to investigate the effects of different fertilization on bacterial communities in tobacco rhizospheric soil. The 16S rDNA genes of

topsoil bacteria in tobacco rhizospheric soils were sequenced by high-throughput sequencing on Illumina MiSeq1 ?platform and related biological analysis conducted to investigate the changes in soil bacterial composition，diversity and structure under 4 different fertilization at resetting growth stage and picking period.Proteobacteria， Chloroflexi， Acidobacteria were the dominant phyla （with relative abundance>10%） in tobacco rhizospheric soils. The richness indexes （Chaol and ACE indexes） were higher for each treatment than for CK at resetting growth stage and picking period， showed that fertilization can improve soil bacterial community richness; The richness indexes （ACE indexes） were significantly higher for T2 and T3 than for CK in picking period， showed that application of humic acid type organic inorganic fertilizer and humic acid type biological organic fertilizer can improve soil bacterial community richness. Hierarchical cluster analysis showed that different fertilizer treatments differ from that of continuous cropping plant tobacco soil bacterial community， but the difference is not reflected on the structural diversity. Heatmap figure analysis results show that the soil pH， organic matter and nutrient have correlation with tobacco soil bacterial community composition and diversity.The conventional fertilization and -N 20% humic acid biological organic fertilizer on tobacco soil bacteria dominant relative abundance and community structure is greater than the effect of applying humic acid type organic inorganic fertilizer and humic acid type biological organic fertilizer， but the application of humic acid type organic inorganic fertilizer and humic acid type biological organic fertilizer can improve the diversity of soil bacteria.

Key words： Flue-cured tobacco; Humic acid biological organic fertilizer; High-throughput sequencing; Bacterial community

煙草（Nicotiana tabacum）屬于茄科（Solanaceae）旱地作物。作為土壤肥力狀況的重要指標(biāo)的土壤微生物，對其群落結(jié)構(gòu)和功能的研究一直是熱點(diǎn)。煙草土壤微生物尤其是土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化對煙草的品質(zhì)有著重要的影響[1]。目前對煙草周圍環(huán)境微生物的研究主要集中在內(nèi)生菌，探索其抗菌及促生作用[2-5]，對土壤微生物尤其是細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的研究還為數(shù)不多。

傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)所獲得的可培養(yǎng)微生物只占土壤微生物總數(shù)的1%左右[6]，隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，DGGE等傳統(tǒng)分子生物學(xué)方法的局限性日益凸顯。近年來，第2代高通量測序技術(shù)為土壤微生物等領(lǐng)域提供了支持，得到了廣泛應(yīng)用[7]。

施用化肥及有機(jī)肥會對農(nóng)田土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性產(chǎn)生一定的影響。由于肥料施用方式（施用量、長期施用或短期施用）、土壤類型和利用方式等因素的影響， 使得施肥對土壤微生物多樣性的影響非常復(fù)雜， 這一問題的相關(guān)報(bào)道結(jié)論不同，相關(guān)研究還有待進(jìn)一步深入探討。筆者應(yīng)用Illumina平臺的Miseq高通量測序煙草土壤細(xì)菌16s rDNA，研究了不同肥料的施用對煙草土壤細(xì)菌組成、結(jié)構(gòu)及多樣性的影響，可以加深對煙草土壤微生物類群和群落結(jié)構(gòu)變化的認(rèn)識，為改良煙草肥料提供基礎(chǔ)理論支持，并為提高煙草產(chǎn)量及品質(zhì)提供研究思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)概況 試驗(yàn)在福建省三明市泰寧縣朱口鎮(zhèn)音山村（117°13′35′′E，26°56′51′′N），平均海拔300m，年平均氣溫為18.5℃，年日照時數(shù)1506h，全年無霜期為216～225d，年平均降雨量為1786mm。試驗(yàn)地為水稻輪作的煙田，供試土壤類型為砂壤土，種植烤煙前耕層土壤（0～20cm）基本化學(xué)性質(zhì)：pH5.9，有機(jī)質(zhì)35g/kg，堿解氮174mg/kg，有效磷39.8mg/kg，速效鉀227mg/kg。供試烤煙品種為翠碧1號，由福建省煙草公司提供?？緹煷筇镏晷芯?.2m×0.5m，密度16675株/hm2，移栽時間2015年1月29日，6月上旬開始分批分部位采收。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 設(shè)5個處理，即常規(guī)施肥（T1，956kg/hm2）、腐殖酸型有機(jī)無機(jī)復(fù)混肥（T2，1006kg/hm2）、腐殖酸型生物有機(jī)肥（T3，1210kg/hm2），以及-N20%腐殖酸型生物有機(jī)肥（T4，805kg/hm2），CK為不施肥。每個處理3次重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組排列。T1中的肥料是煙草公司提供的煙草專用復(fù)合肥，成分比例為N：P2O5：K2O=10：7：21;T2腐殖酸型有機(jī)無機(jī)復(fù)混肥由貴州省貴福生態(tài)肥業(yè)有限公司提供，成分比例為N︰P2O5︰K2O=9.5︰6.3︰21.3;T3腐殖酸型生物有機(jī)肥來自貴州省貴福生態(tài)肥業(yè)有限公司，其有效菌種為枯芽孢桿菌（Bacillus subtilis），有效活菌數(shù)≥0.47億/g，N︰P2O5︰K2O=7.9︰6.1︰22。各處理所用肥料結(jié)合整地，于2015年1月18日移栽時作為基肥施入，基肥追肥比為3︰1，小區(qū)面積334m2，其余操作同常規(guī)優(yōu)質(zhì)烤煙栽培技術(shù)規(guī)范。

1.3 樣品采集 分別于團(tuán)棵期和采收期取樣，每個小區(qū)“S”形多點(diǎn)取樣，在近煙株根部10cm處打土鉆（直徑3cm，深度15cm）作為1個耕層土壤樣品，充分混勻，重復(fù)3次，每份土樣分為2份，1份100g放入無菌袋中并迅速放入干冰盒中，帶回實(shí)驗(yàn)室放入-80℃超低溫冰箱中保存，另1份約200g用來分析土壤化學(xué)性質(zhì)。共得到5個處理不同時期土壤樣品30份，供高通量測序研究。

1.4 測定方法 土壤理化性質(zhì)測定采用常規(guī)分析的方法[8]。使用MOBIO公司的試劑盒提取土壤DNA（PowerSoil? DNA Isolation Kit），按說明書操作，獲得純化的DNA后對細(xì)菌的16s rRNA基因V3～V4區(qū)進(jìn)行高通量測序，委托上海美吉生物公司應(yīng)用Illumina平臺的MiSeq進(jìn)行。

1.5 數(shù)據(jù)分析方法 Miseq測序得到的是雙端序列數(shù)據(jù)，首先根據(jù)PE reads之間的overlap關(guān)系，將成對的reads拼接（merge）13成一條序列，同時對reads的質(zhì)量和merge的效果進(jìn)行質(zhì)控過濾，根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物序列區(qū)分樣品得到有效序列，并校正序列方向。過濾read尾部質(zhì)量值20以下的堿基，設(shè)置50bp的窗口，如果窗口內(nèi)的平均質(zhì)量值低于20，從窗口開始截去后端堿基，過濾質(zhì)控后50bp以下的read;根據(jù)PE reads之間的overlap關(guān)系，將成對reads拼接（merge）成1條序列，最小overlap長度為10bp;拼接序列的overlap區(qū)允許的最大錯配比率為0.2，篩選不符合序列;根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物區(qū)分樣品，并調(diào)整序列方向，barcode允許的錯配數(shù)為0，最大引物錯配數(shù)為2。

對優(yōu)化序列提取非重復(fù)序列，去除沒有重復(fù)的單序列。按照97%相似性對非重復(fù)序列（不含單序列）進(jìn)行OTU聚類，在聚類過程中去除嵌合體，得到OTU的代表序列。將所有優(yōu)化序列map至OTU代表序列，選出與OTU代表序列相似性在97%以上的序列，生成OTU表格。為了得到每個OTU對應(yīng)的物種分類信息，采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，并分別在各個分類水平統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。

1.6 土壤樣品測序、取樣深度驗(yàn)證 由表1可知，通過對細(xì)菌16s rDNA的V3～V4區(qū)進(jìn)行測序過濾，9個樣品獲得有效序列數(shù)在48889～57879，OTUs數(shù)在4392～5277，在97%相似水平下聚類為用于物種分類的OTU，統(tǒng)計(jì)得到各個樣品在不同OTU中的豐度信息。標(biāo)準(zhǔn)化后的序列數(shù)大于10000條，說明測序效果很好，滿足后續(xù)基因多樣性及豐度等功能分析。

表1 各樣品reads數(shù)及OTUs數(shù)

[處理 原始序列數(shù) 原始OTUs數(shù) 標(biāo)準(zhǔn)化后的序列數(shù) 標(biāo)準(zhǔn)化后的OTUs數(shù) CK 54492 5277 42212 4112 RT1 48889 4510 42212 4341 RT2 57879 4803 42212 4225 RT3 50243 4563 42212 4306 RT4 52286 4392 42212 4183 PT1 48935 4514 42212 4325 PT2 56752 4581 42212 4400 PT3 54492 4515 42212 4343 PT4 52872 4456 42212 4128 ]

注：CK：移摘前土壤;T1：常規(guī)施肥;T2：腐殖酸型有機(jī)無機(jī)復(fù)混肥;T3：腐殖酸型生物有機(jī)肥;T4：-N20%腐殖酸型生物有機(jī)肥。R：團(tuán)棵期;P：采收期。下同。

稀釋曲線[9]是從樣本中隨機(jī)抽取一定數(shù)量的個體，統(tǒng)計(jì)這些個體所代表的物種數(shù)目，并以個體數(shù)與物種數(shù)來構(gòu)建曲線。它可以用來比較測序數(shù)據(jù)量不同的樣本中物種的豐富度，也可以用來說明樣本的測序數(shù)據(jù)量是否合理。采用對序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣的方法，以抽到的序列數(shù)與它們所能代表OTU的數(shù)目構(gòu)建rarefaction curve，當(dāng)曲線趨向平坦時，說明測序數(shù)據(jù)量合理，更多的數(shù)據(jù)量只會產(chǎn)生少量新的OTU，反之則表明繼續(xù)測序還可能產(chǎn)生較多新的OTU。因此，通過作稀釋性曲線，可得出樣本的測序深度情況。試驗(yàn)所有樣品在相似度0.97條件下的稀釋曲線如圖1所示，曲線趨向平坦，測序量均達(dá)到10000條以上，可以滿足分析要求。

2 結(jié)果與分析

2.1 各土壤樣品細(xì)菌群落的豐富度和多樣性 Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)反映細(xì)菌群落豐富度，其值越高表明群落物種的豐富度越高[10-11];Shannon指數(shù)反映樣品的多樣性程度，其值越高表明群落物種的多樣性程度越高;Simpson指數(shù)反映了物種的優(yōu)勢度[10-12]。由表2可以看出，物種覆蓋率為0.969～0.971，團(tuán)棵期和采收期各處理的ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)較CK均有所增加，說明施肥可以提高土壤細(xì)菌群落豐富性，其中采摘期處理2和處理3的ACE指數(shù)顯著高于CK，說明施用腐殖酸型有機(jī)無機(jī)復(fù)混肥和腐殖酸型生物有機(jī)肥有助于提高土壤細(xì)菌群落豐富度。Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)變化范圍都很小。試驗(yàn)結(jié)果表明施肥處理對土壤細(xì)菌群落豐富度存在一定影響，且在煙草不同生育期表現(xiàn)存在差異。

2.2 不同施肥處理土壤細(xì)菌類群 為了直觀展示多樣品間OTUs情況，用在屬的水平相對豐度排名前50的細(xì)菌屬進(jìn)行雙向二維聚類（圖2），通過顏色的梯度及相似程度來反映數(shù)據(jù)的相似性和差異性，可以清楚獲知樣本間發(fā)生的變化。由圖2可以看出，9個土壤樣品分成2大類，RT3單獨(dú)為一類，CK和其他處理為一類，其中同一時期的處理土壤樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)較相似，團(tuán)棵期3個處理相似度較高，采收期處理兩兩聚類，相似度高。說明不同時期處理所含OTUs含量和種類差異較大。

對所有土壤樣品測得的OTUs所對應(yīng)的生物分類學(xué)信息進(jìn)行統(tǒng)計(jì)表明，主要包括硝化螺旋菌門、綠彎菌門、酸桿菌門、芽單孢菌門、變形菌門，這5個門在各樣品中所占比例均達(dá)4%以上，是植煙土壤中的優(yōu)勢菌門，圖2中reads數(shù)前80的OTUs除以上5個菌門外，還分布于放線菌門。

在門的分類水平上，細(xì)菌分布在14個已知細(xì)菌門。如圖3和圖4所示，有變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、芽單孢菌門（Gemmatimonadetes）、綠菌門（Chlorobi）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、厚壁菌門（Firmicutes）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）、浮霉菌門（Planctomycetes）、Latescibacteria、Parcubacteria和Saccharibacteria14個細(xì)菌門，相對豐度之和在各個處理土壤樣品中均占到土壤細(xì)菌總量的95%以上。煙草CK和各處理在團(tuán)棵期和采收期的優(yōu)勢細(xì)菌門均為變形菌門、綠彎菌門和酸桿菌門。在團(tuán)棵期，T1處理的變形菌門相對豐度減少3.6%，綠彎菌門和酸桿菌門分別增加6%和2.8%，T4處理的綠彎菌門相對豐度增加4%，T2和T3處理變形菌門的相對豐度分別增加2.3%和2.8%，綠彎菌門和酸桿菌門略有減少;采收期，T1處理的變形菌門相對豐度增加2.9%，綠彎菌門和酸桿菌門分別減少0.7%和2.1%，T4處理的變形菌門相對豐度增加3%，酸桿菌門減少1.6%，T2和T3處理變形菌門的相對豐度分別增加4.2%和2.6%，綠彎菌門和酸桿菌門略有減少，在生育期變化趨勢較一致。

通過Venn圖（圖5）分析了不同生育期土壤細(xì)菌共有的屬的數(shù)量及特有的屬，共有7210個屬，均有分布的屬有5290個：團(tuán)棵期屬的種類最多，為6935個;CK處理中屬的種類最少，為5486個。CK中獨(dú)有的屬有21個，團(tuán)棵期和成熟期分別有147個和229個?？梢?，使用肥料后隨著生育期的推進(jìn)可增加特有物種。

2.3 不同施肥處理的主成分 主坐標(biāo)軸PC1可解釋全部土壤樣品細(xì)菌群落豐度和多樣性方差的22.22%，主坐標(biāo)軸PC2可解釋全部土壤樣品細(xì)菌群落的13.17%，兩者累計(jì)可解釋全部樣品的35.39%（圖6）[12]。樣品多樣性組成越相似，在PCA圖中代表樣品點(diǎn)間距離越近，CK和團(tuán)棵期的各處理分散度較低，說明土壤樣品性質(zhì)相似，成熟期各處理較分散，說明土壤樣品性質(zhì)存在一定差異[13]。

2.4 不同施肥處理土壤細(xì)菌類群與土壤環(huán)境因子相關(guān)性 酸桿菌科的相對豐度與土壤pH呈正相關(guān)，經(jīng)圖3和圖4分析常規(guī)施肥處理的酸桿菌門相對豐度增加2.8%，采收期減少2.1%，通過Heatmap圖分析可知，酸桿菌科的相對豐度與施肥造成土壤pH的變化相關(guān)（圖7）。叢毛單孢菌科、黃色桿菌科和芽單孢菌科同屬于變形菌門，分別與TP、TN、AK正相關(guān)，說明土壤中NP含量、K的利用程度與優(yōu)勢菌門變形菌門的相對豐度變化相關(guān)。亞硝化單孢菌科與土壤pH呈負(fù)相關(guān);浮霉菌科與TP負(fù)相關(guān)，黃單孢桿菌科與SOM呈正相關(guān)，與TN負(fù)相關(guān);鞘酯菌科與TP、AP、AK均呈正相關(guān)。

3 結(jié)論與討論

長期有機(jī)無機(jī)肥配施能夠培肥地力[14]，而施用微生物菌肥可以將土壤微生態(tài)環(huán)境由紊亂復(fù)原到健康水平，從而起到防治土傳病害的作用[15]。土壤微生物多樣性相對比較穩(wěn)定，長期合理施肥可以對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性產(chǎn)生一定的影響[16]，但短期施肥對土壤微生物的影響不顯著[17]。本研究結(jié)果表明，不同施肥處理和不同生育期土壤細(xì)菌群落在結(jié)構(gòu)上的差異不明顯，而細(xì)菌群落的相對豐度存在差異，說明施肥造成了某些細(xì)菌類群的富集或衰減，而沒有改變細(xì)菌群落種類，施肥等條件只影響了某些細(xì)菌種群的豐度。

植物根際細(xì)菌作為一類重要的微生物，與植物的生長發(fā)育有著密切的關(guān)系[19-21]。煙草種植土壤中細(xì)菌類群豐富，優(yōu)勢細(xì)菌門有變形菌門、綠彎菌門、酸桿菌門，其中變形菌門的相對豐度最大，為29.2%～35.8%。施用不同肥料改變了煙草種植土壤的理化性質(zhì)，因此對土壤中細(xì)菌優(yōu)勢類群的相當(dāng)豐度產(chǎn)生一定的影響。齊虹凌等[21]對不同菌群的相對豐度變化研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌群落在烤煙生長的早期數(shù)量變化較大，而隨著生育期的推進(jìn)細(xì)菌群落相對豐度變化不明顯。本研究中常規(guī)施肥的土壤在團(tuán)棵期，變形菌門的相對豐度減少3.6%，采收期增加了2.9%;團(tuán)棵期綠彎菌門和酸桿菌門分別增加6%和2.8%，采收期分別減少0.7%和2.1%，酸桿菌為嗜酸菌在土壤中分布廣泛，酸桿菌門的相對豐度在不同生育期的變化與施肥后土壤pH變化有關(guān);施用減氮20%腐殖酸型生物有機(jī)肥的土壤，在團(tuán)棵期綠彎菌門的相對豐度增加4%，采收期變形菌門相對豐度增加3%，酸桿菌門減少1.6%，這與王培雯等[22]土壤脲酶與土壤細(xì)菌群落豐度和多樣性均呈現(xiàn)反相關(guān)，單一的氮素水平增加不利于土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化的研究結(jié)果基本一致。施用腐殖酸型有機(jī)無機(jī)復(fù)混肥和腐殖酸型生物有機(jī)肥的土壤變形菌門的相對豐度分別增加2.3%和2.8%，綠彎菌門和酸桿菌門略有減少;采收期，施用腐殖酸型有機(jī)無機(jī)復(fù)混肥和腐殖酸型生物有機(jī)肥的土壤變形菌門的相對豐度分別增加4.2%和2.6%，綠彎菌門和酸桿菌門略有減少，在生育期變化趨勢較一致。本研究中施用腐殖酸型有機(jī)無機(jī)復(fù)混肥和腐殖酸型生物有機(jī)肥在煙草不同生育期對土壤優(yōu)勢菌門的相對豐度影響趨于穩(wěn)定，說明這2種肥料對土壤細(xì)菌群落的影響是一個長期的相對穩(wěn)定的變化過程，肥料中營養(yǎng)元素的配比對土壤細(xì)菌群落也有一定的影響。

Liu等[23-24]的研究表明土壤理化性質(zhì)，尤其是土壤pH和土壤有機(jī)質(zhì)對土壤細(xì)菌群落組成和多樣性有顯著影響。本研究中酸桿菌科的相對豐度與土壤pH呈正相關(guān)，這與不同生育期酸桿菌科的相對豐度和土壤pH的變化相吻合，由此可知酸桿菌科的相對豐度與施肥造成土壤pH的變化相關(guān)，印證了Liu等[23]的研究結(jié)果。變形菌門為細(xì)菌中最大的1個門，其中不乏土壤有益菌群，叢毛單孢菌科、黃色桿菌科和芽單孢菌科同屬于變形菌門，其相對豐度分別與土壤全氮、全磷、速效鉀呈正相關(guān)，說明優(yōu)勢菌門變形菌門的相對豐度變化與土壤中全磷、速效鉀含量相關(guān)。亞硝化單孢菌科、芽單孢菌科的相對豐度與土壤pH呈負(fù)相關(guān);浮霉菌科的相對豐度與全磷呈負(fù)相關(guān)，黃單孢桿菌科的相對豐度與土壤有機(jī)質(zhì)呈正相關(guān)，與全氮呈負(fù)相關(guān);鞘酯菌科的相對豐度與土壤全磷、速效磷、速效鉀均呈正相關(guān)。

施用不同肥料對煙草土壤細(xì)菌優(yōu)勢類群的相對豐度及群落結(jié)構(gòu)的影響不盡相同，施用常規(guī)施肥和-N20%腐殖酸型生物有機(jī)肥對煙草土壤細(xì)菌優(yōu)勢類群的相對豐度及群落結(jié)構(gòu)的影響大于施用腐殖酸型有機(jī)無機(jī)復(fù)混肥和腐殖酸型生物有機(jī)肥，施用腐殖酸型有機(jī)無機(jī)復(fù)混肥和腐殖酸型生物有機(jī)肥在煙草不同生育期對土壤優(yōu)勢菌門的相對豐度影響趨于一致，但施用腐殖酸型有機(jī)無機(jī)復(fù)混肥和腐殖酸型生物有機(jī)肥可以提高土壤細(xì)菌的多樣性。

參考文獻(xiàn)

[1]Chao A N. Non-parametric estimation of the number of classes in a population[J].Scandinavian Journal of Statistics， 1984， 11（4）： 265-270.

[2]趙彤.寧南山區(qū)植被恢復(fù)工程對土壤原位礦化中微生物種類和多樣性的影響[D].楊陵：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2014.

[3]張薇，胡躍高，黃國和，高洪文.西北黃土高原檸條種植區(qū)土壤微生物多樣性分析[J].微生物學(xué)報(bào)，2007，47（5）：751-756.

[4]高菊生，黃晶，董春華，等.長期有機(jī)無機(jī)肥配施對水稻產(chǎn)量及土壤有效養(yǎng)分影響[J].土壤學(xué)報(bào)，2015，51（2）：314-324.

[5]薛超，黃啟為，凌寧，等.連作土壤微生物區(qū)系分析、調(diào)控及高通量研究方法[J].土壤學(xué)報(bào)， 2011， 48（3）： 612-618.

[6]時鵬，高強(qiáng)，王淑平，等.玉米連作及其施肥對土壤微生物群落功能多樣性的影響[J].生態(tài)學(xué)報(bào)， 2010， 30（22）： 6173-6182.

[7]樊曉剛，金軻，李兆君，等.不同施肥和耕作制度下土壤微生物多樣性研究進(jìn)展[J].植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào)，2010，16（3）：744-751

[8]鮑士旦.土壤農(nóng)化分析[M].北京： 中國農(nóng)業(yè)出版社， 2000： 25-114.

[9]Katherine R Amato. et al. Habitat degradation impacts black howler monkey （Alouatta pigra） gastrointestinal microbiomes[J]. The ISME Journal ，2013，7：1344-1353.

[10]雷麗萍，郭榮君，繆作清，等.微生物在煙草生產(chǎn)中應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中國煙草學(xué)報(bào)，2006，12（04）：47-51.

[11]楊友才，黃曉輝，龔理，等.煙草內(nèi)生菌對煙草根結(jié)線蟲病的防治效果[J].生態(tài)學(xué)雜志，2009，28（11）：2269-2272.

[12]Wang Y， Sheng H， He Y， et al. Comparison of the levels of bacterial diversity in freshwater， intertidal wetland， and marine sediments by using millions of illumina tags[J]. Applied and Environmental Microbiology， 2012， 78（23）： 8264-8271.

[13]葛英亮，于水利，時文歆，等.應(yīng)用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)解析O3-BAC飲用水處理過程細(xì)菌多樣性變化[J].食品科學(xué)，2016，37（16）：223-228.

[14]雷麗萍，夏振遠(yuǎn)，郭榮君，等.非硝酸鹽還原細(xì)菌K18降低TSNA機(jī)理的初步研究[J].中國煙草科學(xué)，2009，30（5）：54-57.

[15]黃曉輝，楊友才，譚周進(jìn)，等.四個品種煙草內(nèi)生微生物的分布特征[J].生態(tài)學(xué)報(bào)，2009，29（12）：6827-6833.

[16]彭細(xì)橋，劉紅艷，羅寬，等.煙草內(nèi)生青枯病拮抗細(xì)菌的篩選和初步鑒定[J].中國煙草科學(xué)，2007，28（2）：38-40.

[17]黃祖新，黃搖鎮(zhèn)，葉冰瑩，等.宿根甘蔗根際土壤細(xì)菌多樣性分析中培養(yǎng)法與非培養(yǎng)法比較研究[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)， 2011，7（5）：742-746.

[18]Bartram A K， Lynch M D J，Stearns J C. Generation of multimillion-sequence 16S rRNA gene libraries from complex microbial communities by assembling paired-end Illuminareads [J].Applied and Environmental Microbiology， 2011， 77（11）： 3846-3852

[19]胡智勇，陸開宏，梁晶晶.根際微生物在污染水體植物修復(fù)中的作用[J].環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2010，3（05）： 75-80.

[20]王樹和，王曉娟，王茜，等.叢枝菌根及其宿主植物對根際微生物作用的響應(yīng)[J].草業(yè)學(xué)報(bào)，2007，16（03）：108-113.

[21]王佩雯，朱金峰，陳征，等.高通量測序技術(shù)下連作植煙土壤細(xì)菌群落與土壤環(huán)境因子的耦合分析[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)， 2016，24（11）：1754-1763.

[22]齊虹凌，賀國強(qiáng)，李恒全，等.輪作與連作對烤煙不同生育期根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響[J].中國煙草學(xué)報(bào)，2015，21（5）： 42-48.

[23]Liu J J， Sui Y Yu Z H. High throughput sequencing analysis of biogeographical distribution of bacterialcommunities in the black soils of northeast China[J].Soil Biology and Biochemistry，2014， 70：113-122.

[24]Rousk J，Baath E，Brookes P C. Soil bacterial and fungal communities across a pH gradient in an arable soil [J]. International Society for Microbial Ecology，2010，4（10）：1340-1351.

（責(zé)編：徐世紅）