陸錦明（上海市閔行區(qū)三農(nóng)綜合服務中心 201109）

礬根(Heuchera micrantha)又名珊瑚鈴，為虎耳草科礬根屬植物，原產(chǎn)于美洲中部，是一種多年生的彩葉花卉，其葉色豐富，有紅、綠、橙、紫等多種顏色；花小，呈鐘狀，花期在4月—6月；性耐寒，最低可耐-34 ℃低溫；幼苗長勢較慢，成苗后生長旺盛。由于礬根葉片顏色豐富，且會隨季節(jié)的不同而變化，被稱為“上帝調(diào)色板”，是稀有的優(yōu)良彩葉地被植物[1-4]，且在冬季溫暖地區(qū)葉子四季不凋，適合作花境、花壇、地被材料或庭院綠化材料。但由于很多礬根品種不結(jié)籽或種子細小而成苗困難，導致目前市場上優(yōu)良礬根品種供不應求，且種苗價格較高，從而嚴重影響了優(yōu)良礬根品種的推廣應用[4]。

研究表明，利用生物技術(shù)進行礬根種苗的組織培養(yǎng)和快速繁殖研究，既可進行優(yōu)良種苗的規(guī)?；庇?，又可克服礬根優(yōu)良品種數(shù)量少、短期內(nèi)無法快速推廣的缺點。目前，關(guān)于礬根組織培養(yǎng)的研究雖已有一些報道，但組培成功的品種較少，且不同品種間的差異較大[5-9]。在此背景下，筆者擬以礬根紅葉品種“紅貝露”的嫩葉葉柄為外植體，開展礬根的組織培養(yǎng)與快速繁殖技術(shù)研究，以期為礬根優(yōu)良種苗的規(guī)模化繁育提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

供驗礬根品種為“紅貝露”，來自上海市農(nóng)業(yè)科學院林木果樹研究所花卉溫室，取其幼苗葉片的葉柄作為外植體。

1.2 方法

1.2.1 外植體的消毒與培養(yǎng)

外植體的預處理：選取生長良好、無病蟲害的礬根幼苗，于近基部剪取較嫩的葉片（帶葉柄），在實驗室內(nèi)剪去葉片，用洗潔精清洗后用流水沖洗30～60 min，用70%酒精浸15 s后用蒸餾水清洗。

外植體的消毒：消毒劑選用0.1%HgCl2和8%NaClO3，消毒時間分別為5、10、15 min，共設(shè)6個處理，每處理接種48個外植體。

消毒后在超凈工作臺上用無菌蒸餾水沖洗 5～6次，最后用無菌紗布吸干外植體表面的水分，接種于初始培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24 h后每天觀察外植體污染情況，隨時去除污染材料。

1.2.2 愈傷組織誘導與不定芽分化

利用1.2.1中最優(yōu)的消毒方法消毒外植體，分別接種于不同誘導培養(yǎng)基（植物生長調(diào)節(jié)劑種類與濃度不同）上，見表2。每個處理接種48個外植體，每天觀察外植體污染情況，隨時去除污染材料。培養(yǎng)35 d后統(tǒng)計愈傷組織誘導率，并置于光照條件下繼續(xù)培養(yǎng)30 d后，統(tǒng)計愈傷組織的不定芽分化率。

1.2.3 增殖培養(yǎng)

將不定芽分割為單芽，分別接種于不同增殖培養(yǎng)基上，見表3。每個處理接種6瓶，每瓶接種4個單芽。

1.2.4 試管苗的生根與移栽

生根培養(yǎng)：將叢生芽切割成單芽，分別接種于不同處理的生根培養(yǎng)基上，見表4。每個處理接種6瓶，每瓶接種6株。

試管苗移栽：將試管苗置于常溫下，在瓶中煉苗3～5 d，再打開瓶蓋繼續(xù)煉苗1 d，然后用鑷子輕輕取出試管苗，洗凈其基部培養(yǎng)基后移栽于泥炭∶珍珠巖體積比為6∶1的基質(zhì)中，移栽后澆足定根水，蓋上塑料膜，以保溫保濕。

1.2.5 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

培養(yǎng)基：愈傷組織誘導和不定芽的分化、增殖培養(yǎng)所用的基本培養(yǎng)基均為MS培養(yǎng)基，附加蔗糖3%；生根培養(yǎng)所用的基本培養(yǎng)基為1/2 MS培養(yǎng)基，附加蔗糖2%。所有培養(yǎng)基均按試驗需要添加植物生長調(diào)節(jié)劑，并附加瓊脂粉0.6%，pH均為5.8，均經(jīng)121 ℃、0.11 MPa的高溫高壓滅菌。

培養(yǎng)條件：愈傷組織誘導為黑暗培養(yǎng)；不定芽分化、增殖及生根培養(yǎng)均為光照培養(yǎng)，光照強度為30～35μmol/(m2·s)，光照時間為12 h/d。培養(yǎng)室溫度為（24±2）℃。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

外植體的污染率，于接種后24 h至培養(yǎng)10 d后每天統(tǒng)計并累計；外植體的褐死率，于接種35 d后統(tǒng)計；愈傷組織誘導率，于外植體培養(yǎng)35 d后統(tǒng)計；不定芽分化率，于愈傷組織光照培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計；增殖系數(shù)，于增殖培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計；試管苗根數(shù)、根長及生根率，均于生根培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計；試管苗的移栽成活率，于移栽35 d后統(tǒng)計。

計算公式：污染率（%）=（污染的外植體數(shù)÷接種的外植體數(shù)）×100，褐死率（%）=（褐化死亡的外植體數(shù)÷接種的外植體數(shù)）×100，誘導率（%）=[誘導獲得愈傷組織的外植體數(shù)÷接種的外植體數(shù)(去除污染數(shù)）]×100，不定芽分化率（%）=（分化不定芽的愈傷組織數(shù)÷光照培養(yǎng)的愈傷組織數(shù)）×100，增殖系數(shù)=增殖培養(yǎng)30 d后的有效芽數(shù)÷接種芽數(shù)，生根率（%）=（生根苗數(shù)÷接種苗數(shù)）×100，移栽成活率（%）=（移栽35 d后成活的試管苗數(shù)÷移栽試管苗數(shù)）×100。

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進行方差分析(ANOVA)和多重比較分析（Duncan’s）。

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒方式對外植體培養(yǎng)的影響

由表1可知，消毒劑種類和消毒時間對外植體培養(yǎng)的污染及生長情況影響較大。采用0.1%HgCl2消毒5 min時，外植體的污染率達22.9%，另有20.8%的外植體褐化死亡，成活率為56.3%；將0.1%HgCl2消毒時間延長至10 min時，外植體的污染被控制了，但外植體的褐死率大幅提高，成活率較低，僅為33.3%；當0.1%HgCl2消毒時間延長至15 min時，外植體全部死亡。采用8%NaClO3消毒5 min時，外植體的污染率達70.7%；將8%NaClO3消毒時間延長至10 min時，外植體的污染率大幅下降，僅為10.4%，成活率達81.3%，獲得了較好的消毒效果；將8%NaClO3消毒時間延長至15 min時，外植體的污染率不變，但褐死率大幅提高，大大降低了外植體的成活率。綜合分析認為，來源于溫室培育的礬根幼苗葉柄外植體，經(jīng)預處理后，采用8%NaClO3消毒10 min，是最佳的消毒處理方法。

表1 不同消毒方式對外植體成活的影響

2.2 愈傷組織的誘導與不定芽的分化

培養(yǎng)基中的植物生長調(diào)節(jié)劑種類和濃度配比對外植體的愈傷組織誘導及其不定芽的分化具有較大的影響。由表2可知，單加0.5 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基不能誘導愈傷組織；單加0.5 mg/L NAA的培養(yǎng)基僅能誘導少量愈傷組織，但質(zhì)量差不能分化出不定芽。培養(yǎng)基在含0.5 mg/L 6-BA的基礎(chǔ)上添加0.2～2.0 mg/L NAA，愈傷組織誘導率及其不定芽分化率均呈現(xiàn)先升后降的趨勢。其中，MS+BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L培養(yǎng)基的愈傷組織誘導率和不定芽分化率分別為48.84%和28.57%；當NAA濃度提高至0.5 mg/L時，愈傷組織誘導率和不定芽分化率分別提高至82.50%和69.70%；繼續(xù)提高NAA濃度至1.0 mg/L，愈傷組織誘導率和不定芽分化率開始下降，分別降為64.29%和55.56%。分析認為，愈傷組織誘導與不定芽分化的最佳培養(yǎng)基為MS+BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L，在該培養(yǎng)基上，外植體暗培養(yǎng)15 d后開始形成愈傷組織，培養(yǎng)30 d后愈傷組織逐漸長大，并呈現(xiàn)半透明狀；在光照條件下，繼續(xù)培養(yǎng)2周后，部分愈傷組織開始轉(zhuǎn)綠并逐漸分化形成不定芽，在光照條件下培養(yǎng)30 d，愈傷組織的不定芽分化達到高峰。

表2 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對愈傷組織誘導及分化的影響

2.3 增殖培養(yǎng)

由表3可知，在含IAA 0.1 mg/L的MS培養(yǎng)基上，6-BA濃度在0.1～1.0 mg/L范圍內(nèi)，礬根芽的增殖系數(shù)呈先增后降的趨勢，且各處理間差異達顯著水平。在不添加植物生長調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基上，礬根芽的增殖很慢，培養(yǎng)30 d后增殖系數(shù)僅為1.13；在MS+6-BA 0.1 mg/L+IAA 0.1 mg/L培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30 后可顯著提高其增殖系數(shù)，達2.88；繼續(xù)提高6-BA濃度至0.2 mg/L，增殖系數(shù)達到最高值，為7.71，顯著高于其他處理；繼續(xù)提高6-BA濃度至0.5 mg/L，開始出現(xiàn)玻璃苗現(xiàn)象，有效芽數(shù)比MS+6-BA 0.2 mg/L+IAA 0.1 mg/L處理減少，芽的增殖系數(shù)開始降低，為6.41；繼續(xù)提高6-BA濃度至1.0 mg/L，增殖芽細弱且產(chǎn)生大量玻璃苗，芽的增殖系數(shù)顯著降低。綜合分析認為，芽增殖的最適宜培養(yǎng)基是MS+6-BA 0.2 mg/L+IAA 0.1 mg/L，該培養(yǎng)基培養(yǎng)的芽叢生長健壯、增殖快。

表3 不同培養(yǎng)基對芽增殖情況的影響

2.4 試管苗生根與移栽

由表4可知，生根培養(yǎng)基中，適當添加IBA可有效提高其生根率和生根數(shù)。在不添加IBA的1/2 MS培養(yǎng)基上，試管苗培養(yǎng)2周左右有部分小苗開始生根，但根系細弱、生長差。在含IBA的培養(yǎng)基上，礬根試管苗培養(yǎng)7 d后基部就開始長出白色根；培養(yǎng)30 d后大部分試管苗能形成完整的根系，且添加低濃度的IBA(0.2 mg/L)，即可大幅度提高礬根“紅貝露”試管苗的生根率（從69.44%提高到91.67%）；當培養(yǎng)基中IBA濃度提高到0.5～2.0 mg/L時，試管苗的生根率均達100%。培養(yǎng)基中IBA濃度在0.2～2.0 mg/L范圍內(nèi)，礬根“紅貝露”試管苗的平均單株生根數(shù)和根長均呈先升后降的趨勢，其中，1/2 MS+IBA 1.0 mg/L培養(yǎng)基的平均單株生根數(shù)和根長均為最高，分別為23.33條和3.96 cm，當IBA濃度提高至2.0 mg/L時，生根數(shù)和根長均有所下降，平均單株生根數(shù)和根長分別為15.33條和2.88 cm，且試管苗基部產(chǎn)生少量愈傷組織，并有部分幼苗的葉片發(fā)黃。綜合分析認為，礬根“紅貝露”試管苗生根的適宜培養(yǎng)基是1/2 MS+IBA 1.0 mg/L，用該培養(yǎng)基培養(yǎng)的試管苗葉色較深，根系發(fā)達，植株生長良好。

將來源于1/2 MS+IBA 1.0 mg/L培養(yǎng)基的試管苗，經(jīng)煉苗后移栽，恢復生長快，生長勢良好，試管苗移栽成活率達95.33%。

表4 不同培養(yǎng)基對試管苗生根的影響

3 結(jié)論與討論

根據(jù)已有文獻報道，礬根組織培養(yǎng)一般以植株頂芽、莖尖、葉基組織等材料作為外植體進行初始培養(yǎng)[5-10]，但這些方法對母株影響很大，有的甚至會對母株造成毀滅性傷害。本研究是以礬根葉柄作外植體，取材更容易，且對母株影響較小。

外植體消毒是建立無菌系的關(guān)鍵因子之一。HgCl2和NaClO3是組織培養(yǎng)中較常用的兩種消毒劑，前者毒性大，消毒效果較好，但受使用濃度和消毒時間影響較大，如果消毒劑的使用濃度過低或時間過短很容易引起外植體污染，相反則容易殺死外植體而無法獲得無菌系，且對環(huán)境影響較大。本研究中，以礬根“紅貝露”幼嫩葉片的葉柄作為外植體，用HgCl2消毒易褐化死亡，效果不好；而經(jīng)流水沖洗30 min、70%酒精消毒20 s后，再用8%NaClO3消毒10 min，可獲得良好的消毒效果。該消毒處理方法對其它花卉進行組培時的外植體消毒具有一定的借鑒意義。

葉柄外植體在MS+BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L培養(yǎng)基上經(jīng)暗培養(yǎng)獲得愈傷組織后，將其轉(zhuǎn)移至光培養(yǎng)條件下，愈傷組織又在同一培養(yǎng)基上分化不定芽，省去了不定芽分化培養(yǎng)基的配制及分化培養(yǎng)的轉(zhuǎn)接工作。

增殖系數(shù)是影響花卉組培繁育種苗效率的重要影響因子。一般情況下，適當增加細胞分裂素濃度即可提高培養(yǎng)物的增殖系數(shù)，但濃度過高，易產(chǎn)生玻璃苗，減少有效芽數(shù)，從而影響組培苗的繁殖效率。本研究結(jié)果顯示，礬根“紅貝露”芽增殖的最適宜培養(yǎng)基是MS+6-BA 0.2 mg/L+IAA 0.1 mg/L，當6-BA濃度高于0.5 mg/L時，容易出現(xiàn)玻璃苗，影響組培苗的繁殖效率。

試管苗的移栽成活率是植物組培技術(shù)能否真正應用于生產(chǎn)的關(guān)鍵，而試管苗的生根質(zhì)量是影響其移栽成活率的主要影響因子。本研究結(jié)果顯示，礬根“紅貝露”試管苗生根的適宜培養(yǎng)基是1/2 MS+IBA 1.0 mg/L，采用該培養(yǎng)基培養(yǎng)的礬根試管苗葉色較深，根系發(fā)達，經(jīng)煉苗后移栽，成活率達95.33%。

本研究建立了礬根的組織培養(yǎng)與快速繁殖技術(shù)體系，不僅為規(guī)?；庇\根優(yōu)質(zhì)種苗提供了技術(shù)支撐，還為礬根優(yōu)良品種的推廣應用奠定了基礎(chǔ)。