杜雪梅,鐘 維,唐天才,郝力力

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,四川 成都 610041)

石渠縣隸屬四川省甘孜藏族自治州,是棘球蚴病的重度流行地區(qū),其中泡型棘球蚴和細(xì)粒棘球蚴均有流行。高原鼠兔,屬兔形目、鼠兔屬,是多房棘球絳蟲和石渠棘球絳蟲的重要中間宿主。據(jù)2017年調(diào)查顯示,石渠縣高原鼠兔平均密度達(dá)到9.58只/畝,相當(dāng)于全縣約有3.6億只[1],是當(dāng)?shù)財(cái)?shù)量最多的物種。高原鼠兔中間宿主因吞食蟲卵受感染,蟲卵在體內(nèi)發(fā)育成幼蟲,被狐貍、流浪犬、家犬等終末宿主捕食,終末宿主將蟲卵和孕節(jié)隨糞便排出體外,污染土壤和草地,中間宿主經(jīng)口攝入蟲卵而感染棘球蚴病。多房棘球絳蟲可感染人,而石渠棘球絳蟲尚未發(fā)現(xiàn)感染人的病例。石渠縣包蟲病綜合防治工作自2015年正式啟動(dòng)以來(lái),國(guó)家投入了大量資金,形成了以“雙滅源”、“三切斷”、“八舉措”為主的“238”高寒藏區(qū)畜間包蟲病防控新模式。截至2017年總共完成家犬驅(qū)蟲282,301只/次,每月驅(qū)蟲完成率達(dá)99.99%;共登記、拴養(yǎng)家犬18 368只,登記拴養(yǎng)率達(dá)100%,犬只管理實(shí)現(xiàn)了規(guī)范化[2]。調(diào)查高原鼠兔是了解當(dāng)?shù)丶蝌什×餍械闹匾笜?biāo),也是重要的中間宿主。本試驗(yàn)用PCR方法擴(kuò)增石渠棘球絳蟲和多房棘球絳蟲的ND1基因,對(duì)石渠縣高原鼠兔棘球蚴的感染情況進(jìn)行調(diào)查,以期為當(dāng)?shù)丶蝌什〉姆揽靥峁?shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設(shè)備和試劑 臺(tái)式高速離心機(jī)(Eppendorf 5402型)、Bio-Rad伯樂(lè)梯度PCR儀(PTC240型)、2×EasyTaq PCR Super Mix(北京全式金生物技術(shù)有限公司);組織基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)。

1.2 組織樣本 采集時(shí)間為2017年5月20日到5月23日,由省動(dòng)物疫控中心負(fù)責(zé)采集,共采集82份高原鼠兔肝肺組織,所有樣本均來(lái)自四川省石渠縣色須鎮(zhèn)。多房棘球絳蟲基因組DNA,由本實(shí)驗(yàn)組保存。

1.3 DNA模板制備 使用天根生化科技(北京)有限公司組織基因DNA提取試劑盒,按照說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.4 引物設(shè)計(jì) 本試驗(yàn)中采用PCR方法行進(jìn)檢測(cè)。反應(yīng)中所用引物采用Sean等[3]設(shè)計(jì)ND1基因檢測(cè)石渠棘球絳蟲,序列如下,EsF50：5′-TTATTCTCAGTCTCGTAAGGGTCCG-3′,EsR73： 5′-CAATAACCAACTACATCAATAATT-3′,最終產(chǎn)物大小在400 bp～500 bp之間。(此引物是可以檢出細(xì)粒、多房和石渠棘球絳蟲的基因序列)。

1.5 ND1基因序列的PCR擴(kuò)增、同源性分析及進(jìn)化樹構(gòu)建 PCR反應(yīng)采用25 μL體系：2×EasyTaq PCR Super Mix 12.5μL、上下游引物各 1 μL(10 μmol/L)、DNA 模板1 μL、ddH2O 9.5 μL。 PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min;然后40個(gè)循環(huán)：94℃ 20 s,55℃ 35 s,72℃ 30 s;最后72℃延伸8 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中,以0.5xTBE緩沖液,100 V電壓電泳30 min。電泳結(jié)束后,在紫外燈下觀察目的基因條帶,記錄陽(yáng)性鑒定結(jié)果并拍照保存。挑選PCR陽(yáng)性產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。運(yùn)用Lasergene 7.0軟件對(duì)所測(cè)得的序列拼接、比對(duì)和同源性分析,用MEGA 6構(gòu)建分子進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 剖解疑似感染石渠棘球蚴的高原鼠兔 棘球絳蟲幼蟲在高原鼠兔的肝肺臟器內(nèi)可發(fā)育成為直徑約10 mm的微小包囊(見中插彩版圖1)。與細(xì)粒棘球絳蟲的包囊不同,以單個(gè)包囊存在。囊表面光滑、呈白色、囊液清澈。包囊內(nèi)有育囊,未發(fā)現(xiàn)子囊。囊的角質(zhì)層較厚,而由宿主形成的外圍纖維層卻很薄。

2.2 石渠縣高原鼠兔棘球蚴ND1基因的PCR檢測(cè)及其感染率 82份高原鼠兔肝肺組織樣本經(jīng)PCR檢測(cè),共檢出5份陽(yáng)性,感染率為6.10%(5/82),感染的蟲種均為石渠棘球絳蟲,未檢測(cè)到多房棘球絳蟲。其片段大小約為442 bp,見圖2。

圖2 部分高原鼠兔組織樣本PCR反應(yīng)后電泳圖

2.3 序列比對(duì)、進(jìn)化樹構(gòu)建及分析 應(yīng)用Lasergene 7.0軟件對(duì)擴(kuò)增出的ND1基因序列與報(bào)道的石渠棘球絳蟲的ND1基因序列進(jìn)行同源性分析(圖3)。由圖3可見,來(lái)自石渠縣高原鼠兔感染的棘球蚴與石渠縣報(bào)道的石渠棘球絳蟲(E.shiqu AB208064)同源性在99.0% ～99.7%之間(圖3中對(duì)應(yīng)序號(hào)分別為1、2、3、4、5),其中 2和 3 序列之間同源性為100%。而分離株序列與細(xì)粒棘球絳蟲(E.g KY766908)同源性在52.6% ～53.0%之間;與多房棘球絳蟲(E.m KF171965)同源性在84.5%～85.5%之間。

圖3 石渠棘球絳蟲ND1基因同源性比較

應(yīng)用Mega 6軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(圖4)。從建立的進(jìn)化樹圖4可以看出,高原鼠兔感染的棘球蚴(圖 4中對(duì)應(yīng)序號(hào) E.shiqu1、E.shiqu2、E.shiqu4、E.shiqu5)與石渠縣報(bào)道的石渠棘球絳蟲(E.shiqu AB208064)位于同一分支上,進(jìn)化關(guān)系較近;4個(gè)分離株與細(xì)粒棘球絳蟲(E.g KY766908)在一個(gè)分支上但進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn),與多房棘球絳蟲(E.m KF171965)不在同一個(gè)分支上。

圖4 基于石渠棘球絳蟲ND1基因的進(jìn)化樹分析

3 討論

石渠縣位于四川省的最西北部,有“四川省第一畜牧業(yè)大縣”之稱,是細(xì)粒棘球絳蟲、多房棘球絳蟲和石渠棘球絳蟲的流行區(qū)。中間宿主感染棘球蚴,已經(jīng)成為全球性重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題和社會(huì)經(jīng)濟(jì)問(wèn)題[4],其中細(xì)粒棘球蚴可感染人和家畜,多房棘球蚴感染人和嚙齒類動(dòng)物,而石渠棘球蚴尚未在人和家畜上發(fā)現(xiàn)病例,僅感染嚙齒類動(dòng)物。嚙齒類中間宿主的存在對(duì)棘球絳蟲生活史循環(huán)鏈的形成和棘球絳蟲種群的維持、延續(xù)具有重要意義[5]。2012年張高天等發(fā)現(xiàn),在四川省西部2000、1990-2005、2012年期間高原鼠兔棘球蚴感染率分別為5.60%、5.27%、5.70%[6]。2013年黃富強(qiáng)等發(fā)現(xiàn),青海省稱多縣的高原鼠兔棘球蚴感染率為4.14%(6/145),而藏羊和牦牛棘球蚴的感染率分別為52.30%、36.77%,高原鼠兔的感染率遠(yuǎn)低于家畜的感染率[7]。2016年楊世杰等調(diào)查四川省石渠縣嚙齒類棘球蚴感染率為4.93%(200/4 054)[8]。本試驗(yàn)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示,該地區(qū)高原鼠兔棘球蚴的感染率為6.10%。可見近年來(lái)石渠縣自然狀況下高原鼠兔棘球蚴的感染率數(shù)據(jù)并不高,但是高原鼠兔在石渠縣上分布廣泛,種群數(shù)量極大,是狐貍和流浪犬的捕食對(duì)象,形成了多房和石渠棘球絳蟲在犬和狐貍與中間宿主高原鼠兔間的循環(huán)感染,導(dǎo)致了傳染源的持續(xù)存在,使得棘球絳蟲在石渠縣的流行狀況復(fù)雜。

本試驗(yàn)高原鼠兔棘球蚴感染的均是石渠棘球蚴,未檢測(cè)到多房棘球蚴的感染,可能的原因有：試驗(yàn)采集的82份高原鼠兔樣本是有明顯包囊病變的肝肺組織,沒(méi)有收集表面正常的樣本,而多房棘球蚴感染高原鼠兔為囊泡狀,且早期感染階段癥狀不明顯,因此未檢測(cè)到多房棘球蚴的感染。綜上所述,本試驗(yàn)對(duì)四川省石渠縣高原鼠兔棘球蚴的感染情況進(jìn)行了調(diào)查。后期需要進(jìn)一步增加調(diào)查地點(diǎn)和表面正常的肝肺組織樣本的收集,以及擴(kuò)大調(diào)查范圍、中間宿主的種類(如：高原鼢鼠)、樣本數(shù)量,并對(duì)終末宿主犬感染棘球蚴的情況進(jìn)行充分調(diào)查。