周書楠,王玉榮,周亞澳,廖 華,張振東,郭 壯,3,*

(1.湖北文理學院食品科學技術學院,鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所,湖北襄陽 441053;2.恩施市農業(yè)局,湖北恩施 445000;3.恩施市公共檢驗檢測中心,湖北恩施 445000)

米酒是以糯米、大米或秈米等谷物為主料,添加酒曲發(fā)酵制成的一類風味獨特的低酒精度飲料,因其具有清香醇厚、營養(yǎng)豐富和工藝簡單等特點,湖北省一直保留著制作和飲用米酒的習慣[1-2]。傳統(tǒng)米酒的制作多在開放環(huán)境下進行,除酒曲中的根霉和酵母菌會進入成品中外,原料及環(huán)境中的多種微生物亦會摻入其中,由此可見,米酒的發(fā)酵過程實際上是多種微生物之間以及微生物與原料中的淀粉、蛋白質、脂肪和礦物質等化學成分之間相互作用的過程。傳統(tǒng)工藝制作的米酒易受微生物、原料和環(huán)境等因素的影響,其成品品質很難保持一致,有時甚至易受致病菌污染[3]。因此,對米酒中微生物種類及多樣性進行全面解析顯得尤為重要。多年來,國內學者對米酒中酵母菌[4-5]、乳酸菌[6]和霉菌[7-8]進行了多項卓有成效的研究,其研究結果均表明米酒中微生物以霉菌和酵母菌等真菌為主。然而以上研究均采用的是基于純培養(yǎng)的傳統(tǒng)微生物學手段,該方法存在一定局限性,不能全面真實的反映米酒中微生物多樣性。

以MiSeq為代表的第二代高通量測序技術具有操作簡單、通量高和結果可信度高的特點,一次可對多個樣本中的微生物群落信息進行平行分析[9]。相較于富集培養(yǎng)、分離純化和生理生化鑒定等傳統(tǒng)微生物手段,MiSeq高通量測序技術可檢測出樣品中低豐度、難培養(yǎng)的微生物類群,能夠更加真實準確的反映樣品中微生物群落結構,并且該技術已在窖泥[10-11]、泡菜[12]、酒曲[13]和白酒[14]等中得到廣泛應用,這些研究的開展為研究米酒中微生物多樣性提供了很好的思路。

本研究以采集自恩施土家苗族自治州的農家自釀米酒為研究對象,在提取樣品宏基因組的基礎上,采用MiSeq高通量測序技術對其真菌多樣性進行解析,同時采用多元統(tǒng)計學手段對樣品間差異性進行分析,以期為米酒中微生物資源發(fā)掘提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

米酒 于2018年2月采集自恩施市10個農戶家中,且發(fā)酵時間均在10 d以上,依照采集次序,依次將樣品編號為MJ1～MJ10;QIAGEN DNeasymericon Food Kit基因組DNA提取試劑盒 德國QIAGEN公司;5×TransStartTM、脫氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate,dNTP)Mix、FastPfu Buffer和FastPfu Fly DNA聚合酶(5 U/μL) 北京全式金生物技術有限公司;DNA 1000試劑盒 美國Agilent公司;正向引物SSU0817F(5′-TTAGCATGGAAT AATRRAATAGGA-3′)、反向引物SSU1196R(5′-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3′) 武漢天一輝遠生物科技有限公司。

5810R臺式高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司;2100芯片生物分析儀 美國Agilent公司;ND-2000C微量紫外分光光度計 美國NanoDrop公司;Vetiri梯度基因擴增儀 美國AB公司;DYY-12電泳儀 北京六一儀器廠;PowerPacTMBasic穩(wěn)壓儀和UVPCDS8000凝膠成像分析系統(tǒng) 美國BIO-RAD公司;MiSeq高通量測序平臺 美國Illumina公司;R920機架式服務器 美國DELL公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 宏基因組DNA提取與檢測 取50 g米酒樣品置于無菌離心杯中,400×g離心10 min以去除米粒等固體雜質,取上清液于4000 r/min下,離心10 min以收集菌體。參照DNA提取試劑盒中的方法,對收集的菌體進行宏基因組DNA提取,使用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳,對提取的宏基因組DNA的質量進行檢測,同時使用微量紫外分光光度計檢測其OD260/280是否在1.8～2.0之間,記錄各樣品DNA濃度,將符合要求的樣品DNA置于-20 ℃的冰箱中備用。

1.2.2 PCR擴增及測序 參照王丹丹等[15]的方法,對樣品真菌18S rRNA的V4-V5區(qū)進行PCR擴增,體系為20 μL:5×PCR buffer 4 μL,2.5 mmol/L dNTPs Mix 2 μL,5 μmol/L正反向引物(正向引物上加7個核苷酸標簽)各0.8 μL,5 U/μL FastPfu Fly DNA聚合酶 0.4 μL,DNA模板10 ng,剩余體積用無菌超純水補齊;擴增條件參照陳慶金等[16]的方法略作改動:95 ℃預變性3 min;95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,30 個循環(huán);72 ℃完全延伸10 min。擴增結束后,用無菌超純水將1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格的擴增產物濃度稀釋至100 nmol/L,并用干冰將其寄至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行MiSeq高通量測序。

1.2.3 序列質量控制及分析 MiSeq測序完成后,根據(jù)序列間的重疊關系將返回的正反向成對單鏈序列拼接成一條完整DNA序列,要求拼接時滿足以下任一條件的序列予以剔除:重疊區(qū)的堿基數(shù)小于10 bp;核苷酸標簽堿基發(fā)生錯配;引物堿基錯配數(shù)大于2 bp或最大錯配比率大于0.2[17]。剩下的序列再按核苷酸標簽序列,將其劃分至對應的樣品中并校正序列方向,最后切除正反引物及核苷酸標簽,若切除的引物和核苷酸后序列長度小于50 bp,則該序列亦舍棄。

序列質控合格后采用QIIME(v1.7.0)分析平臺對序列進行分析[18],用UCLUST軟件[19]首先以100%的相似度得到單一序列,然后以97%的相似度建立操作分類單元,緊接著從每個OTU中挑選一條代表性序列與SILVA[20-21]數(shù)據(jù)庫進行比對,確定各序列和各OTU的微生物學分類地位,進而對米酒真菌的α多樣性指數(shù)和β多樣性指數(shù)進行計算。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用發(fā)現(xiàn)物種數(shù)和香農指數(shù)對真菌豐度和多樣性進行分析,采用基于分類操作單元加權UniFrac距離的聚類分析和基于歐氏距離的差異分析,對樣品真菌群落結構差異進行研究,采用曼-惠特尼檢驗(Mann-Whitney test)對不同聚類間的組間差異顯著性進行分析。使用軟件Matlab R2016b和OriginPro 2017C繪圖。

2 結果與分析

2.1 基于門和屬水平的真菌多樣性分析

采用MiSeq高通量測序技術,從10個米酒樣品中共檢測出85672條有效序列,本研究首先對測序深度進行分析,結果如圖1所示。

圖1 樣品真菌序列稀釋曲線(A)和香農指數(shù)曲線(B)

由圖1A可知,稀釋曲線隨著序列數(shù)的增加呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢,而由圖1B可知,香農指數(shù)曲線在序列數(shù)為10000條左右時就已全部進入穩(wěn)定期,說明隨著測序序列量的增加樣品中可能會有新的物種被發(fā)現(xiàn),但其真菌多樣性不會再有明顯變化,表明本研究測得的85672條序列滿足后續(xù)生物信息學分析要求。由圖1B可知,所有樣品中香農指數(shù)最大的為MJ4,最小的為MJ8,經α多樣性分析發(fā)現(xiàn),在測序深度為34810條序列時二者的香農指數(shù)分別為4.36和0.99,說明樣品MJ4中真菌豐富度最高而樣品MJ8中最低。本研究檢測出的合格序列在97%的相似度下可被劃分至10627個OTU中,從每個OTU中挑選一條代表性序列進行比對,然后統(tǒng)計其界、門、綱、目、科和屬的種類和數(shù)量,其中真菌門水平的分析結果如圖2所示。

圖2 米酒中優(yōu)勢真菌門相對含量分析

由圖2可知,所有米酒樣品中主要檢測出隸屬于子囊菌門(Ascomycota)、毛霉亞門(Mucoromycotina)、擔子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)和芽枝霉門(Blastocladiomycota)的真菌,其中Ascomycota和Mucoromycotina的累積平均相對含量高達99.20%,而Basidiomycota、Chytridiomycota和Blastocladiomycota僅在一個或少數(shù)幾個樣品中存在。由圖2亦可知,MJ1和MJ4中Ascomycota的相對含量明顯低于其他樣品,而MJ5、MJ7和MJ8中Basidiomycota含量亦明顯低于其他樣品,說明各樣品中真菌門的種類和含量存在差異。進一步在屬水平上進行研究時發(fā)現(xiàn)10個樣品共檢測出17個真菌屬,其中平均相對含量大于0.1%的有4個,在本研究中將這4個真菌屬定義為優(yōu)勢真菌屬,則其在各樣品中的分布情況如圖3所示。

圖3 米酒中優(yōu)勢真菌屬相對含量分析

由圖3可知,米酒樣品中的優(yōu)勢真菌屬主要為復膜孢酵母屬(Saccharomycopsis)、根霉屬(Rhizopus)、淀粉菌(Amylomyces)和Poitrasia,其平均相對含量分別為62.44%、20.28%、4.42%和0.47%,所有合格序列僅有12.17%不能鑒定到屬水平。值得一提的是,Saccharomycopsis在MJ1中的相對含量僅有10.39%,而在MJ8中的相對含量高達92.54%;Rhizopus在MJ1中的相對含量為64.32%,而在MJ5、MJ7和MJ8中的相對含量分別為0.43%、2.43%和2.02%;樣品MJ1和MJ10中均不含有Poitrasia。由此可見,雖然米酒樣品中含有大量真菌菌群,但這些優(yōu)勢真菌在各樣品中并非均勻分布。焦晶凱[22]采用DGGE技術對不同發(fā)酵時期傳統(tǒng)釀造米酒中微生物多樣性變化進行分析,發(fā)現(xiàn)米酒中含有的真菌主要為酵母屬(Saccharomyces)、畢赤酵母屬(Pichia)和克魯維酵母屬(Kluyveromyces),與本研究結果存在一定差異性;但王丹丹等[15]采用MiSeq高通量測序技術對孝感鳳窩酒曲真菌微生物多樣進行研究時發(fā)現(xiàn)淀粉霉(Amylomyces)、小克銀漢霉屬(Cunninghamella)、毛霉屬(Mucor)、復膜孢酵母屬(Saccharomycopsis)、曲霉屬(Aspergillus)、念珠菌(Candida)、擬威爾酵母(Cyberlindnera)和接合酵母(Zygosaccharomyces)是其內主要真菌,與本研究結果較為相似,出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是原料來源和實驗方法等因素造成的。

2.2 基于OTU水平的真菌多樣性分析

本研究從10個米酒樣品中得到10627個OTU,各樣品中OTU數(shù)量及種類并非完全相同,如圖4所示為各OTU在所有樣品中出現(xiàn)次數(shù)統(tǒng)計結果。

圖4 OTU出現(xiàn)次數(shù)統(tǒng)計分析

由圖4可知,隨著OTU出現(xiàn)頻次從1到10逐漸升高,其所含OTU數(shù)占總OTU數(shù)的比例整體上呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢,而所含序列數(shù)占總序列數(shù)的比例趨勢恰好相反,尤以出現(xiàn)頻次為1和10的OTU最為明顯。某個樣品中特有的OTU即圖4所示,僅出現(xiàn)1次的OTU占總OTU數(shù)的比例為75.74%,但其所含序列數(shù)僅為2.30%;出現(xiàn)10次的OTU即所有樣品共有OTU占總OTU數(shù)的比例僅為0.40%,而其所含序列數(shù)占到總序列數(shù)的83.82%;其他頻次的OTU即部分樣品中共有OTU的OTU比和序列比值總體上較為相近。說明樣品中特有真菌種類多但在各樣品中的含量少,而多數(shù)為共有真菌菌群。值得一提的是,10627個OTU中序列平均相對含量大于0.1%的OTU有32個,其中相對含量大于0.5%有7個,這7個OTU在各米酒樣品中的相對含量如圖5所示。

圖5 平均相對含量大于0.5% OTU統(tǒng)計分析

由圖5可知,平均相對含量大于0.5%的OTU及其平均相對含量分別為OTU2793(45.40%)、OTU8553(16.41%)、OTU2342(15.90%)、OTU4367(1.18%)、OTU9019(0.63%)、OTU4274(0.59%)和OTU5981(0.53%),其中OTU2793、OTU2342和OTU4274隸屬于Saccharomycopsis,OTU8553、OTU4367和5981隸屬于Rhizopus,OTU9019隸屬于Amylomyces,且這些OTU在各樣品中均存在。由圖5亦可明顯看出,MJ8中OTU2342的相對含量已達92.47%,明顯高于其他樣品,而其OTU2793的相對含量僅為0.02%。由此可見,米酒樣品中的核心優(yōu)勢真菌屬為Saccharomycopsis、Rhizopus和Amylomyces,且各樣品相對含量存在差異。王艷萍等[8]采用分離純化的方法,對荊州自然發(fā)酵米酒中微生物進行分析,發(fā)現(xiàn)米酒發(fā)酵過程中的主要優(yōu)勢菌為霉菌;焦晶凱[22]的研究亦與本研究結果均有一定的相似性。但目前鮮有針對米酒中Amylomyces進行分離純化的研究,這些結果為后續(xù)微生物資源發(fā)掘提供了一定研究靶點。

2.3 樣品差異分析

通過計算樣品間的距離,UniFrac顯著性檢驗可利用各樣品序列類型,來比較樣品在特定的進化譜系中是否有顯著的微生物群落差異[23]。本研究在對不同米酒樣品中真菌進行分析鑒定的基礎上,進一步采用基于分類操作單元加權UniFrac距離顯著性檢驗對樣品間差異性進行了分析,結果如圖6所示。

圖6 樣品UPGMA聚類分析

由圖6可知,采集的10個米酒樣品大致可以分為兩類,聚類Ⅰ包括MJ1、MJ2、MJ4、MJ6、MJ9和MJ10,聚類Ⅱ包括MJ3、MJ5、MJ7和MJ8。在加權UniFrac中,分支的長度是根據(jù)對該分支上兩個群落的相對豐度差異進行加權計算得到的,由圖6亦可知,聚類Ⅰ中各分支長度整體上要長于聚類Ⅱ各分支,為探究其差異顯著性,本研究進一步采用歐氏距離對樣品真菌群落結構組間差異進行分析,結果如圖7所示。

由圖7可知,采用歐氏距離計算不同聚類真菌微生物群落結構差異時,聚類Ⅰ的組內距離為0.082±0.028,聚類Ⅱ的組內距離為0.047±0.014,即聚類I中的歐氏距離大于聚類Ⅱ,說明聚類I中樣品相似度低于聚類Ⅱ。經Mann-Whitney檢驗發(fā)現(xiàn)兩組數(shù)據(jù)差異顯著(p=0.038<0.05),說明聚類Ⅰ樣品真菌群落結構組內差異要顯著高于聚類Ⅱ(p<0.05)。本研究進一步在屬水平上對造成上述現(xiàn)象的因素進行了探究,結果如表1所示。

表1 不同聚類間優(yōu)勢真菌屬差異分析Table 1 Difference analysis of dominant fungi among different clusters

圖7 真菌群落結構組間差異分析

由表1可知,聚類Ⅰ和聚類Ⅱ中Saccharomycopsis、Rhizopus、Amylomyces和Poitrasia的相對含量差異均極顯著(p<0.01)。整體上看,聚類Ⅰ中Rhizopus和Amylomyces的相對含量要高于聚類Ⅱ,而聚類Ⅱ中Saccharomycopsis和Poitrasia要高于聚類Ⅰ。由此可見,Saccharomycopsis、Rhizopus、Amylomyces和Poitrasia是造成米酒樣品兩個聚類微生物群落結構差異顯著的關鍵真菌類群。

3 結論

MiSeq高通量測序結果表明,恩施地區(qū)米酒中的真菌微生物主要隸屬于5個門和17個屬,其中核心優(yōu)勢真菌屬為Saccharomycopsis、Rhizopus和Amylomyces,且有12.17%的序列未能鑒定到屬水平,說明該地區(qū)米酒中含有大量的真菌資源且仍有多種真菌未被發(fā)掘。在對樣品中真菌進行研究時發(fā)現(xiàn),采集自恩施的10個米酒樣品的真菌組成及含量均不相同,所有樣品大致可以分為兩個聚類,采用多元統(tǒng)計學手段分析得知造成這種差異的關鍵真菌類群主要為Saccharomycopsis、Rhizopus、Amylomyces和Poitrasia,而這些因素亦可能是造成不同傳統(tǒng)農家自釀米酒產品品質不穩(wěn)定的主因,這為后續(xù)農家自釀米酒微生物資源的發(fā)掘以及后期米酒制作工藝改進提供了一定的參考。