曹媛媛，鄧加雄，李桂成，艾晨牧，李云峰

(湖南省郴州市第一人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，郴州 423000)

膿毒癥是臨床常見危重癥，而血管通透性增加導(dǎo)致的全身浮腫是膿毒癥的主要癥狀，也是臨床工作中亟待解決的問題之一[1]。血管內(nèi)皮細(xì)胞激活是導(dǎo)致血管通透性增加的主要機(jī)制[2,3]。研究證實(shí)京尼平在調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能、改善心血管疾病方面具有顯著作用[4,5]，但其對于膿毒癥血管通透性增加的作用尚未見報道。本課題組前期證實(shí)線粒體凋亡信號通過激活天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3(cysteine-containing aspartate-specific proteases 3,caspase-3)裂解內(nèi)皮細(xì)胞緊密鏈接β-catenin蛋白，介導(dǎo)內(nèi)皮通透性增加，而抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡信號激活可以減輕血管通透性增加[6]。且研究證實(shí)沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1，SIRT1)參與調(diào)節(jié)脂多糖介導(dǎo)的內(nèi)皮屏障功能[7]，但機(jī)制并未闡述清楚。因此本研究通過體內(nèi)及體外脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)處理模擬膿毒癥血管通透性增加，觀察京尼平對血管通透性的影響并研究其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

FITC-白蛋白、京尼平及EX527購于美國Sigma公司；TUNEL檢測試劑盒、線粒體膜電位JC-1試劑盒、caspase-3活性檢測試劑盒及線粒體分離試劑盒購于美國Biovision公司；Sirtuin-1蛋白(SIRT1)單克隆抗體、3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphatede hydrogenase,GAPDH)及辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗購于美國ABclonal公司。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)購于廣州賽庫生物公司。

1.2 分組及處理

1.2.1 體外實(shí)驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[7]，HUVECs分為4組：對照組細(xì)胞僅接受0.1%二甲基亞砜(DMSO)處理24.5 h；模型組細(xì)胞接受0.1%DMSO預(yù)處理30 min后與500 ng/ml LPS共孵育24 h；治療組細(xì)胞接受京尼平50 μmol預(yù)處理30 min后同模型組；抑制劑組細(xì)胞接受10 μmol EX527及京尼平50 μmol預(yù)處理30 min后同模型組。

1.2.2 體內(nèi)實(shí)驗(yàn) 雌性SD大鼠24只，采用隨機(jī)數(shù)表法分為4組(n=6)：對照組大鼠經(jīng)尾靜脈注射0.5 ml DMSO 30 min后注射生理鹽水0.5 ml，60 min后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測；模型組大鼠經(jīng)尾靜脈注射0.5 ml DMSO 30 min后注射LPS 10 mg/kg(溶于0.5 ml生理鹽水)，60 min后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測；治療組大鼠尾靜脈注射京尼平5 mg/kg 30 min后同模型組；抑制劑組大鼠經(jīng)尾靜脈注射EX527 5 mg/kg及京尼平5 mg/kg 30 min后同模型組。

1.3 體外指標(biāo)檢測

1.3.1 內(nèi)皮細(xì)胞通透性檢測 參照文獻(xiàn)[7]，HUVECs接種于24孔Transwell上層小室上，待細(xì)胞長至90%融合后，無血清DMEM/F12 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h，使細(xì)胞同步生長并處于靜止期。根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案處理，24 h后檢測各組熒光A值(測定波長520 nm，激發(fā)波長492 nm)。內(nèi)皮通透性Pa=(各組A值)/(對照組A值)。

1.3.2 caspase-3活性檢測 細(xì)胞充分裂解后離心(4℃，12 000轉(zhuǎn)/min，20 min)，取上清。與試劑盒中反應(yīng)液在37℃下孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測熒光強(qiáng)度(波長405 nm)，BCA法檢測蛋白濃度，以熒光強(qiáng)度與蛋白濃度比值表示caspase-3活性，并以對照組進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.3.3 SIRT1含量測定 蛋白質(zhì)免疫印跡試驗(yàn)(Western blotting)檢測SIRT1含量。將細(xì)胞充分裂解后，4℃，12 000轉(zhuǎn)/min，20 min，取上清，BCA法檢測蛋白濃度。凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜，免疫化學(xué)發(fā)光法曝光并進(jìn)行灰度值分析。以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH的灰度值比值表示目的蛋白的相對表達(dá)量，并以對照組進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.3.4 線粒體膜電位測定 處理后的HUVECs經(jīng)PBS洗后重懸，與JC-1 在37℃孵育15 min 后酶標(biāo)儀檢測。熒光探針JC-1 的工作濃度為5 μmol/L。共聚焦顯微鏡下觀察熒光變化，計算綠色熒光與紅色熒光的比值，并以對照組進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。該比值用來衡量線粒體去極化的程度：比例越高表明線粒體去極化增加，膜電位下降；反之則去極化下降，膜電位上升。

1.3.5 細(xì)胞凋亡測定 采用TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡，處理后的HUVECs經(jīng)PBS洗后重懸，根據(jù)說明書步驟進(jìn)行處理，hoechest標(biāo)記細(xì)胞核，熒光顯微鏡下觀察。

1.4 體內(nèi)指標(biāo)檢測

1.4.1 血管通透性檢測 參照文獻(xiàn)[6]，大鼠經(jīng)苯巴比妥30 mg/kg肌注麻醉后正中剖腹，將一小段空腸緩慢拉出并尋找合適觀察的腸系膜靜脈，Kreb液持續(xù)緩慢滴注維持血管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，予FITC-白蛋白50 mg/kg注射，并持續(xù)性滴注FITC-白蛋白0.15 mg/(kg·min)維持熒光穩(wěn)定，熒光顯微鏡下連續(xù)觀察60 min內(nèi)血管FITC-白蛋白滲出情況，并分別測定血管內(nèi)的熒光密度值(Ii)和血管外滲出的熒光密度值(Io)，血管通透性由血管內(nèi)外熒光強(qiáng)度變化(ΔI)決定，ΔI=Io/Ii，其ΔI值越大表示通透性越高。另外，大鼠麻醉后，一側(cè)股動脈置入PE50管，并連接于PowerLab八通道生理記錄儀連續(xù)記錄血壓。

1.4.2 Western blotting檢測組織SIRT1蛋白表達(dá) 腸系膜血管組織充分裂解，4℃，12 000轉(zhuǎn)/min，20 min，取上清，BCA法檢測蛋白濃度。凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜，免疫化學(xué)發(fā)光法曝光并進(jìn)行灰度值分析。以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH的灰度值比值表示目的蛋白的相對表達(dá)量，并以對照組進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 京尼平對內(nèi)皮細(xì)胞通透性及caspase-3的影響

與對照組比較，模型組、治療組及抑制劑組細(xì)胞Pa值及caspase-3顯著增加。與模型組比較，治療組Pa及caspase-3顯著下降。與治療組比較，抑制劑組Pa及caspase-3顯著增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05；表1)。

2.2 京尼平對內(nèi)皮細(xì)胞SIRT1表達(dá)的影響

與對照組(100.0±8.9)%比較，模型組[(61.0±8.5)%]、治療組[(86.7±7.6)%]及抑制劑組[(64.3±4.8)%]的SIRT1表達(dá)水平顯著降低；與模型組比較，治療組SIRT1表達(dá)顯著升高；與治療組比較，抑制劑組SIRT1表達(dá)顯著下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05；圖1)。

表1 4組細(xì)胞內(nèi)皮通透性及caspase-3活性比較

LPS: lipopolysaccharide; caspase-3: cysteine-containing aspartate-specific proteases 3. Compared with control group,*P<0.05; compared with LPS group,#P<0.05; compared with treatment group,△P<0.05.

圖1 4組細(xì)胞SIRT1表達(dá)比較

SIRT1: silent information regulator 1; LPS: lipopolysaccharide; GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphatede hydrogenase. Compared with control group,*P<0.05; compared with LPS group,#P<0.05; compared with treatment group,△P<0.05.

2.3 京尼平對內(nèi)皮細(xì)胞線粒體膜電位的影響

與對照組[(100.0±4.8)%]比較，模型組[(343.0±28.3)%]、治療組[(220.0±13.3)%]及抑制劑組[(309.0±18.5)%]的JC-1綠色/紅色熒光比例顯著增加；與模型組比較，治療組綠色/紅色熒光比值顯著下降；與治療組比較，抑制劑組JC-1綠色/紅色熒光比例顯著增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05；圖2)。

2.4 京尼平對內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響

與對照組[(2.3±1.4)%]比較，模型組[(40.8±8.9)%]、治療組[(28.2±6.6)%]及抑制劑組[(38.0±9.5)%]細(xì)胞凋亡率顯著增加；與模型組比較，治療組細(xì)胞凋亡率顯著下降；與治療組比較，抑制劑組細(xì)胞凋亡顯著上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05；圖3)。

2.5 大鼠血壓變化

給藥前各組大鼠血壓差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；注射后30 min，各組大鼠血壓較給藥前差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；模型組、治療組及抑制劑組大鼠在LPS注射30 min及60 min后，與處理前及對照組比較血壓明顯下降(P<0.05)，但3組大鼠間血壓比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05；表2)。

圖2 4組細(xì)胞線粒體膜電位的比較

A: fluorescent staining(×600); B: quantitative analysis results. LPS: lipopolysaccharide. Compared with control group,*P<0.05; compared with LPS group,#P<0.05; compared with treatment group,△P<0.05.

圖3 4組細(xì)胞凋亡情況比較

A: TUNEL staining(×100)；B: quantitative analysis results. LPS: lipopolysaccharide. Compared with control group,*P<0.05; compared with LPS group,#P<0.05; compared with treatment group,△P<0.05.

表2 各組大鼠不同時間點(diǎn)血壓比較

Group Pre-injection30min after injection60min after injection90min after injectionControl112±13111±10110±9108±7LPS116±12114±1292±8?#92±8?#Treatment113±14118±1291±5?#92±7?#Inhibitor120±11118±1090±6?#91±5?#

LPS: lipopolysaccharide. 1 mmHg=0.133 kPa. Compared with control group,*P<0.05; compared with pre-injection,#P<0.05.

2.6 京尼平對腸系膜血管組織中SIRT1表達(dá)的影響

與對照組[(100.0±4.0)%]比較，模型組[(49.3±8.3)%]、治療組[(87.3±4.7)%]及抑制劑組[(55.3±4.9)%]SIRT1表達(dá)量顯著降低；與模型組比較，治療組SIRT1表達(dá)顯著上升；與治療組比較，抑制劑組SIRT1表達(dá)顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05；圖4)。

圖4 4組大鼠腸系膜血管組織SIRT1表達(dá)

SIRT1: silent information regulator 1; GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphatede hydrogenase; LPS: lipopolysaccharide. Compared with control group,*P<0.05; compared with LPS group,#P<0.05; compared with treatment group,△P<0.05.

2.7 京尼平對血管通透性的影響

與對照組(0.12±0.03)比較，模型組(0.54±0.07)、治療組(0.32±0.05)及抑制劑組(0.53±0.06) ΔI顯著增加；與模型組比較，治療組大鼠ΔI顯著減弱；與治療組比較，抑制劑組大鼠ΔI顯著增強(qiáng)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05；圖5)。

圖5 4組大鼠血管通透性的比較

LPS: lipopolysaccharide. A: fluorescent staining(×100)；B: quantitative analysis results. Compared with control group,*P<0.05; compared with LPS group,#P<0.05; compared with treatment group,△P<0.05.

3 討 論

膿毒癥是感染導(dǎo)致的全身炎癥反應(yīng)綜合征，是臨床常見的危重癥[8]。LPS是格蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的成分之一，由于格蘭陰性細(xì)菌在膿毒癥致病菌中的重要地位，許多研究將LPS應(yīng)用在膿毒癥的模型中[9,10]。本研究中，我們在細(xì)胞水平發(fā)現(xiàn)經(jīng)LPS刺激，HUVECs內(nèi)皮通透性顯著增加；在動物水平，通過在熒光顯微鏡下觀察腸系膜血管白蛋白的滲出來檢測血管通透性發(fā)現(xiàn)，注射LPS后，大鼠血管內(nèi)的熒光白蛋白向外滲出明顯，提示血管通透性增加。以往研究證實(shí)，京尼平可以顯著改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，在心血管疾病治療方面有一定的療效[4,5]，但是其對于血管通透性是否有影響卻少見報到。我們通過研究發(fā)現(xiàn)，京尼平可以顯著減少LPS介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞及血管通透性增加。

SIRT1是沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶家族中的一員，參與線粒體代謝及生成，而其在調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞方面具有重要作用[11,12]。研究證實(shí)，SIRT1激活劑SRT1720可以顯著抑制LPS介導(dǎo)的血管通透性增加[7,13]，那么京尼平是否通過激活SIRT1發(fā)揮其對血管通透性的保護(hù)作用呢？我們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，LPS導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞及血管組織中SIRT1的表達(dá)顯著下降，但京尼平可以顯著提高內(nèi)皮細(xì)胞及血管組織中SIRT1的表達(dá)，而SIRT1抑制劑EX527則可以顯著抑制京尼平對SIRT1激活。另外我們還發(fā)現(xiàn)，EX527可以抑制京尼平對內(nèi)皮及血管通透性的保護(hù)效應(yīng)，提示京尼平可能通過SIRT1發(fā)揮作用。

本課題以往研究證實(shí)，線粒體凋亡信號在血管通透性增加中起著重要作用，抑制線粒體凋亡信號可以顯著改善血管通透性增加[14]。線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔開放后導(dǎo)致膜電位下降，細(xì)胞色素C等線粒體小分子蛋白釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，進(jìn)而激活下游caspase-3[15]。caspase-3的眾多底物中包括β-catenin，而β-catenin是內(nèi)皮之間緊密連接的重要組成部分，裂解后可導(dǎo)致內(nèi)皮-內(nèi)皮間鏈接破壞，間隙增大，最終引起血管通透性增加[16]。我們的研究證實(shí)，在內(nèi)皮細(xì)胞中LPS可導(dǎo)致腸系膜血管線粒體膜電位下降、caspase-3激活及細(xì)胞凋亡，提示線粒體凋亡信號激活。而京尼平可以顯著抑制內(nèi)皮細(xì)胞線粒體凋亡信號激活，從而發(fā)揮血管通透性的保護(hù)作用。加之EX527可以抑制京尼平對線粒體凋亡信號的抑制作用，進(jìn)一步證實(shí)京尼平可能通過激活SIRT1發(fā)揮血管通透性保護(hù)作用。

綜上，京尼平可能通過抑制線粒體凋亡信號激活，最終抑制LPS介導(dǎo)的血管通透性增加，而這些效應(yīng)可能與激活SIRT1有關(guān)。下一步的研究，我們將探討京尼平激活SIRT1的機(jī)制。