高曉冉,劉程惠*,陳立國,蘇曉燕,磨佳琳

1(大連民族大學 生命科學學院，遼寧 大連，116600) 2(大商股份有限公司，遼寧 大連，116600)

冷鮮牛肉質(zhì)地細嫩、味道鮮美、營養(yǎng)豐富，含有豐富的蛋白質(zhì)、鉀以及鐵元素，尤其它的肉毒堿和肌氨酸含量更是遠高于其他肉類，能夠加速人體脂肪的新陳代謝、增強免疫力以及促進肌肉的形成，因此冷鮮牛肉已然成為當下國內(nèi)外肉類市場的消費主流[1-2]。但是，冷鮮牛肉從原料檢疫、屠宰、分割排酸，再到包裝、運輸、貯藏、銷售的整個過程中會出現(xiàn)微生物污染、蛋白質(zhì)氧化、色素降解和脂肪氧化等現(xiàn)象，從而導致其貨架期短[3]。如何解決上述問題并延長冷鮮牛肉的貯藏期，一直是國內(nèi)外的研究熱點。

目前，常用的化學保鮮劑大部分都是人工合成的，使用不當會有一定的副作用，對人體健康存在潛在危害[4]。因此，作為代替化學保鮮劑的天然保鮮劑因其安全性高、抗氧化能力強、無毒副作用日益受到關注。應用于肉類的天然保鮮劑主要有：殼聚糖、殼寡糖、茶多酚、乳酸鏈球菌素、溶菌酶、天然香辛料提取物等[5-10]。其中，殼寡糖(chito-oligosaccharide) 是由殼聚糖經(jīng)過降解而得的低分子聚合物，研究發(fā)現(xiàn)它的水溶性、抗氧化性及抑菌性均優(yōu)于殼聚糖，同時它還具有保健的功能，容易被生物體吸收[11-13]。茶多酚有明顯的抗菌、抗氧化作用，且安全無毒，是一種有推廣價值的天然保鮮劑[14]。殼寡糖和茶多酚對肉類的抑菌和保鮮作用已有報道[15-17]。目前許多研究表明，天然保鮮劑復合使用比單一使用對肉類的抑菌和保鮮效果更好。復合使用將成為未來天然保鮮劑應用研究發(fā)展的趨勢[18-19]。殼寡糖是近年來新開發(fā)的一種天然保鮮劑，目前關于殼寡糖與其他天然保鮮劑復配應用于冷鮮牛肉保鮮的研究還鮮少見報道。因此，為了進一步開發(fā)殼寡糖在冷鮮牛肉保鮮方面應用潛力，本研究將殼寡糖與不同濃度的茶多酚復配，研究其對冷鮮牛肉微生物生長、蛋白質(zhì)和脂肪氧化程度、汁液流失率、硬度和顏色變化的影響，探尋殼寡糖與茶多酚在抑菌和保鮮效果的協(xié)同效應，以期為殼寡糖復合保鮮劑在冷鮮牛肉中的產(chǎn)業(yè)化應用提供參考以及科學指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷鮮牛霖，吉林省長春市皓月清真肉業(yè)股份有限公司；殼寡糖(分子質(zhì)量<700)，西安澤邦生物科技有限公司；茶多酚(純度≥98%)，合肥博美生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

VS-1300超凈工作臺，蘇州市蘇信凈化設備廠；DNP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實驗設備有限公司；UV-1600型紫外可見分光光度計，上海尤尼柯儀器有限公司；SN-SQ立式壓力蒸汽滅菌器，重慶雅馬拓科技有限公司；Kjeltec-2300凱氏定氮儀，F(xiàn)cssAnalyticalAB公司；CR400/CR410色差計，日本KonicaMinolta公司；ZK600智能真空包裝機，東莞市益健包裝機械有限公司(真空極限：-0.1MPa)；真空包裝袋，廣東省東莞市廣駿電器公司；TGL-20M醫(yī)用離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；T-25勻漿機，德國IKA公司；DK-98-II型電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司，TA-XTPlus質(zhì)構(gòu)儀，英國StableMicroSystem公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品處理

經(jīng)排酸后的皓月牛霖，剔除筋膜后分割成約1 kg/塊，隨機分成5組，每組21塊。對每組牛肉進行保鮮處理，添加去離子水的組為對照1，其余復合保鮮液添加量如表1。

表1 復合保鮮液添加量 單位：g/100mL

5組肉樣分別在上述保鮮液中浸泡50 s后取出，擺放于滅菌的盤篩中，瀝干，然后將其真空包裝，于0～4 ℃的冷庫中貯藏。分別在0、5、10、15、20、25、30 d測定各項微生物指標和理化指標。每個處理抽取3個樣品重復測定，取平均值。

1.3.2 菌落總數(shù)和大腸菌群的測定

菌落總數(shù)按照GB/T 4789.2—2016測定[20]，結(jié)果以菌落總數(shù)的對數(shù)(lg CFU/g)表示。評價標準為：新鮮肉為104CFU/g以下，次鮮肉為104～106CFU/g，變質(zhì)肉為106CFU/g以上[21]。

大腸菌群參照GB/T 4789.3—2016中的第二法平板計數(shù)法進行測定，結(jié)果以大腸菌群的對數(shù)(lg CFU/g)表示[22]。

1.3.3 色差的測定

用濾紙吸干冷鮮牛肉樣品表面的水分，將其放于光源下，使用色差計測定肉樣的L*(亮度)值和a*(紅度)值，分別對每個樣品的不同部位測定6次，取平均值。

1.3.4 肌紅蛋白氧化狀態(tài)測定

參考郭新穎的方法[23]，結(jié)果用高鐵肌紅蛋白(MetMb)百分含量表示。

1.3.5 脂肪氧化程度的測定(TBARS法)

參考郭新穎的方法[23]，數(shù)據(jù)結(jié)果用mg/kg表示。

1.3.6 揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)的測定

按照GB/T 5009.44—2003采用半微量定氮法測定冷鮮牛肉揮發(fā)性鹽基氮的含量。評價標準如下：新鮮肉為15 mg/100g以下，冷鮮肉為20 mg/100g以下，變質(zhì)肉為20 mg/100g以上[24]。

1.3.7 硬度的測定

將肉樣切割成高約20 mm，底面積約40 mm×40 mm的方塊狀，采用TPA模式加載P-0.5探頭進行質(zhì)構(gòu)測定(texture profileanalysis，TPA)，測試前、測試中及測試后速度均為1.0 mm/s，2次壓縮距離均為10 mm，2次間停頓時間為2 s，通過分析力量-時間曲線，再根據(jù)參數(shù)定義及計算方法得到肉樣的硬度[25]。

將肉樣浸漬保鮮液瀝干后對每塊肉樣進行稱質(zhì)量(m1)，并使用真空包袋分裝。測試時拆開包裝，用濾紙吸干樣品表面的汁液，稱量質(zhì)量(m2)。

(1)

1.3.9 數(shù)據(jù)處理

試驗均重復3次，結(jié)果用平均值±標準偏差表示。用Origin 8.0進行作圖分析，SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行顯著分析和相關性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼寡糖與茶多酚復配處理對冷鮮牛肉菌落總數(shù)和大腸菌群的影響

如圖1所示，隨著貯藏時間的延長，所有組冷鮮牛肉的菌落總數(shù)均逐漸增加(P<0.05)，但處理組的菌落總數(shù)均顯著低于對照組1(P<0.05)。

圖1 殼寡糖與茶多酚復配處理對冷鮮牛肉菌落總數(shù)的影響Fig.1 Effects of chitosan oligosaccharide and tea polyphenols on aerobic plate count of chilled beef

對照1的初始菌數(shù)為4.23 (lg CFU/g)，對照2的初始菌數(shù)為4.05 (lg CFU/g)，各處理組的初始菌落總數(shù)分別比對照1下降了7.52%、5.06%、10.85%。在第20天，對照1的菌落總數(shù)達到6.03 (lg CFU/g)，屬于變質(zhì)肉。第25天，對照2、處理1、處理2的菌落總數(shù)分別達到6.62、6.20、6.31 (lg CFU/g)，均屬于變質(zhì)肉。第30天，處理3的菌落總數(shù)為6.77 (lg CFU/g)，超過牛肉二級鮮度的標準。可見，單獨使用殼寡糖對冷鮮牛肉有抑菌作用，但與茶多酚復配的抑菌效果更好，且處理3能有效抑制冷鮮牛肉中的微生物繁殖，并將菌落總數(shù)控制在25 d內(nèi)不超標。

目前，國標對冷鮮牛肉中的大腸菌群數(shù)量還沒有限量規(guī)定，但大腸菌群仍是評價食品質(zhì)量安全的重要指標之一，其數(shù)值越大表明肉樣受污染程度越大。由圖2可知，隨著貯藏時間的延長，所有組的大腸菌群數(shù)量均呈逐漸上升趨勢。第0～10天，各組之間的大腸菌群數(shù)量變化差異不明顯，從第15天之后，對照組1的大腸菌群數(shù)明顯高于對照組2和處理組(P<0.05)。第30天，對照1的大腸菌群數(shù)為7.20 (lg CFU/g)，對照2的大腸菌群數(shù)達到6.89 (lg CFU/g)，而處理1、處理2和處理3的大腸菌群數(shù)比對照1分別減小了1.17、0.95、1.27 (lg CFU/g)，與對照2相比分別降低了0.85、0.63、0.95 (lg CFU/g)?？梢?，殼寡糖與茶多酚復配處理能夠有效抑制大腸菌群數(shù)量上升，減緩冷鮮牛肉的受污染程度。

本研究中，0.06 g/100mL殼寡糖與0.3 g/100mL茶多酚復配處理對冷鮮牛肉微生物的抑菌作用明顯優(yōu)于單獨使用殼寡糖處理，證明殼寡糖與茶多酚復合處理冷鮮牛肉可以產(chǎn)生良好的協(xié)同抑菌效應，這可能是因為殼寡糖與茶多酚的殺菌和抑菌作用所針對的優(yōu)勢菌不同，兩者復合使殺菌和抑菌的作用范圍擴大，并且殼寡糖能夠增加細菌細胞膜的通透性，使更多的茶多酚通過細胞膜進入細菌內(nèi)部，與遺傳物質(zhì)結(jié)合，阻斷或延緩了細菌的生長和繁殖。

圖2 殼寡糖與茶多酚復配處理對冷鮮牛肉大腸菌群的影響Fig.2 Effects of chitosan oligosaccharide and tea polyphenols on coliform of chilled beef

2.2 殼寡糖與茶多酚復配處理對冷鮮牛肉色差的影響

牛肉的色澤是消費者直觀判斷其新鮮程度的重要依據(jù)。L*值和a*值分別表示肉樣的亮度和紅度，L*值越大表明肉樣顏色越深，a*值越大表明肉樣顏色越紅。由圖3可知，各處理組與對照組冷鮮牛肉的L*值都隨著貯藏時間的延長而減小，肉色穩(wěn)定性不斷降低，失色現(xiàn)象逐漸加重。對照1的L*值始終低于其他組，處理3的L*值在整個貯藏過程中最穩(wěn)定。由圖4可知，第0～5天，所有組冷鮮牛肉的a*值下降較快，之后下降速率減緩，從20 d開始對照1的a*顯著低于對照2和各處理組(P<0.05)。

中國是一個以農(nóng)業(yè)為主的國家，當前許多地區(qū)始終沿襲傳統(tǒng)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)模式，部分地區(qū)因為信息渠道不通暢，無法了解到市場的最新動態(tài)，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)技術(shù)也與市場發(fā)展的要求不一致，農(nóng)業(yè)回報率始終處于較低的水平。伴隨社會的不斷前進，部分先進科技已運用到農(nóng)業(yè)經(jīng)濟發(fā)展中，有效提升了農(nóng)業(yè)經(jīng)營效益，然而國內(nèi)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)模式依舊較為滯后。

圖3 殼寡糖與茶多酚復配處理對牛肉L*值的影響Fig.3 Effects of chitosan oligosaccharide and tea polyphenols on L* of chilled beef

圖4 殼寡糖與茶多酚復配處理對冷鮮牛肉a*值的影響Fig.4 Effects of chitosan oligosaccharide and tea polyphenols on a*of chilled beef

綜合L*值、a*值的結(jié)果可見，殼寡糖與茶多酚復配可以延緩冷鮮牛肉的L*值和a*值下降，能有效防止色澤劣變。

2.3 殼寡糖與茶多酚復配處理對冷鮮牛肉高鐵肌紅蛋白(MetMb)含量的影響

冷鮮牛肉在貯藏過程中發(fā)生的顏色變化主要受肌紅蛋白的影響，其在不同的氧化狀態(tài)下呈現(xiàn)不同的顏色[26]。貯藏初期，冷鮮牛肉細胞中的肌紅蛋白和氧氣反應生成氧合肌紅蛋白，使肉色呈鮮紅色，但氧合肌紅蛋白不穩(wěn)定，隨著貯藏時間的延長，進一步氧化為高鐵肌紅蛋白，肉色逐漸呈暗紅色，高鐵肌紅蛋白積累到一定程度牛肉發(fā)生褐變[27]。

由圖5可知，在0～5 d，各處理組與對照組冷鮮牛肉的MetMb %快速增加，之后增加速率均減小。整個貯藏期間，對照1組冷鮮牛肉的MetMb %始終顯著高于其他組(P<0.05)；在5～30 d，各處理組的MetMb %含量開始低于對照2，但只有處理3的MetMb %含量顯著低于對照2(P<0.05)。

圖5 殼寡糖與茶多酚復配處理對冷鮮牛肉MetMb%的影響Fig.5 Effects of chitosan oligosaccharide and tea polyphenols on MetMb% of chilled beef

2.4 殼寡糖與茶多酚復配處理對冷鮮牛肉TBARS的影響

冷鮮牛肉在貯藏期間，其中的不飽和脂肪酸會發(fā)生酸敗反應，生成丙二醛(MDA)，通過測定硫代巴比妥酸值能夠評價脂肪氧化的程度[28]。由圖6可知，在整個貯藏期間，對照1組冷鮮牛肉的TBARS值呈顯著上升趨勢(P<0.05)，其他組冷鮮牛肉的TBARS值在貯藏前15 d緩慢增加，從第20天開始顯著增加(P<0.05)。從貯藏第10天，對照1組冷鮮牛肉的TBARS值顯著高于其他組(P<0.05)。在第30天時，各處理組冷鮮牛肉的TBARS值分別比對照2組減少了0.25、0.16、0.29 mg/kg。

圖6 殼寡糖與茶多酚復配處理對冷鮮牛肉TBARS值的影響Fig.6 Effects of chitosan oligosaccharide and tea polyphenols on TBARS of chilled beef

UTRERA等研究證實，牛肉蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)生的羰基和脂肪氧化產(chǎn)生的自由基能夠與肌肉蛋白質(zhì)褐色素中的自由氨基反應，從而加速褐色素物質(zhì)的生成[29]。結(jié)合本研究中L*值、a*值的結(jié)果可以得出，冷鮮牛肉中肌紅蛋白和脂肪的氧化程度與肉色穩(wěn)定性成負相關。

2.5 殼寡糖與茶多酚復配處理對冷鮮牛肉TVB-N的影響

TVB-N值是反映鮮肉腐敗程度的重要指標。TVB-N值越大表明肉的腐敗程度越大。由圖7可知，貯藏第0～5天，所有組冷鮮牛肉的TVB-N值基本沒變化，第5天之后，對照組與各處理組的TVB-N值均開始增加，其中對照1組的TVB-N值快速上升，顯著高于其他組(P<0.05)。貯藏20 d時，對照1組冷鮮牛肉的TVB-N值達到20.14 mg/100g，已變質(zhì)；第30天時，對照2、處理1、處理2組的TVB-N值分別20.53、21.06、22.08 mg/100g，均已變質(zhì)，而處理3組的TVB-N值達到19.07 mg/100g，未變質(zhì)?？梢?，殼寡糖與茶多酚復合處理對抑制揮發(fā)性氨基氮的生成有很好的作用，并且0.06 g/100mL殼寡糖復配0.3 g/100mL茶多酚的抑制效果最佳。

圖7 殼寡糖與茶多酚復配處理對牛肉TVB-N值的影響Fig.7 Effects of chitosano ligosaccharide and tea polyphenols on TVB-N of chilled beef

2.6 殼寡糖與茶多酚復配處理對冷鮮牛肉硬度的影響

由圖8可知，在貯藏0～5 d，所有組冷鮮牛肉的硬度基本沒有變化，從貯藏第10天，對照2和各處理組冷鮮牛肉的硬度均低于對照1，且處理3組的硬度顯著低于對照1(P<0.05)，從貯藏第25天，處理3組的硬度顯著低于對照2(P<0.05)。在貯藏第30 天，對照1的硬度達到18.15 N，對照2的硬度達到15.04 N，而處理1、處理2和處理3的硬度比對照1分別低4.78、3.55、5.70 N，比對照2分別低1.67、0.45、2.60 N。

圖8 殼寡糖與茶多酚復配處理對冷鮮牛肉硬度的影響Fig.8 Effects of chitosan oligosaccharide and tea polyphenols on hardness of chilled beef

2.7 殼寡糖與茶多酚復配處理對冷鮮牛肉汁液流失率的影響

由于貯藏過程中冷鮮牛肉中的蛋白質(zhì)膠體發(fā)生不可逆的水解，使得冷鮮牛肉的組織細胞結(jié)構(gòu)變得極為松散，細胞內(nèi)水分等物質(zhì)不斷向外擴散，造成汁液流失現(xiàn)象[30]。汁液流失率越大表明冷鮮牛肉的營養(yǎng)流失越多，肉質(zhì)越差，新鮮程度越低。由圖9可知，隨著貯藏時間延長所有組冷鮮牛肉的汁液流失率逐漸快速增加。貯藏第0～20天，所有組冷鮮牛肉的汁液流失率無顯著差異。第25天開始，對照1顯著高于處理組(P<0.05)。貯藏第30天，對照1組冷鮮牛肉的汁液流失率增加到13.94%，而對照2、處理1、處理2、處理3組的汁液流失率分別比對照1組降低了1.23%、3.09%、3.06%、5.26%?？梢姡瑲す烟桥c茶多酚復配處理能夠抑制冷鮮牛肉汁液流失，并且作用優(yōu)于單獨殼寡糖處理。

圖9 殼寡糖與茶多酚復配處理對冷鮮牛肉汁液損失率的影響Fig.9 Effects of chitosan oligosaccharide and tea polyphenols on dripping loss of chilled beef

2.8 相關性分析

如表2所示，冷鮮牛肉在冷藏條件下微生物及各相關品質(zhì)指標都發(fā)生了變化，通過pearson相關系數(shù)反應微生物指標與各品質(zhì)指標的相關性。冷鮮牛肉貯藏期間菌落總數(shù)與大腸菌群呈極顯著正相關(P<0.01)，表明它們會協(xié)同促進數(shù)量增長；微生物數(shù)量(包括菌落總數(shù)和大腸菌群)與L*值、a*值呈極顯著負相關(P<0.01)，與MetMb %、TBARS、TVB-N、硬度、汁液流失率呈極顯著正相關(P<0.01)，表明冷鮮牛肉貯藏過程中微生物數(shù)量的增加會加速牛肉顏色變暗變深，還會促進高鐵肌紅蛋白和揮發(fā)性氨基氮生成，加速脂肪氧化，破壞冷鮮牛肉的保水性，促使牛肉變硬。

表2 冷鮮牛肉腐敗指標的相關性分析Table 2 Pearson correlation coef?cients of colorimetric value, microorganism content and anticorruption capacity

注：*-顯著相關(P<0.05)；**-極顯著相關(P<0.01)。

此外，L*值、a*值與MetMb %、TBARS、TVB-N呈極顯著負相關(P<0.01)，進一步說明高鐵肌紅蛋白和揮發(fā)性氨基氮積累越多，脂肪氧化程度越高，冷鮮牛肉的色澤越差。

3 結(jié)論

在貯藏期內(nèi)，殼寡糖與茶多酚復合處理對冷鮮牛肉的微生物總數(shù)、色澤(L*值、a*值)、MetMb %、脂肪氧化、蛋白質(zhì)氧化、硬度、汁液損失率均產(chǎn)生有利影響。綜合試驗結(jié)果的理化指標和微生物指標判斷，本研究中各處理組均能延長冷鮮牛肉的貨架期，其中單獨0.06 g/100mL殼寡糖組可將冷鮮牛肉保質(zhì)期延長至20 d，0.06 g/100mL殼寡糖復配0.3 g/100mL茶多酚處理組對冷鮮牛肉的保鮮效果最好，可將冷鮮牛肉控制在25 d不變質(zhì)，說明殼寡糖與茶多酚具有協(xié)同抑菌效應，對冷鮮牛肉的防腐保鮮具有良好的作用。