王雪瑤，陳 爽，王小叢*

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院 1.心臟超聲科；2.生殖中心產(chǎn)前診斷中心，吉林 長春130021)

腎慢性纖維化是多種腎臟疾病發(fā)展到終末期的共同表現(xiàn)，是以腎小管萎縮消失、間質(zhì)肌成纖維細胞增生并產(chǎn)生細胞外基質(zhì)為特征的病理過程[1]。腎纖維化時肌成纖維細胞的來源除腎間質(zhì)內(nèi)固有肌成纖維細胞活化增生外，近年來研究發(fā)現(xiàn)腎小管上皮細胞經(jīng)上皮-間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化，或稱上皮向間充質(zhì)細胞的表型轉(zhuǎn)化也是腎纖維化肌成纖維細胞的重要來源之一[2]。所謂上皮-間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化是指腎小管上皮細胞出現(xiàn)了間充質(zhì)細胞標(biāo)記物，包括α-平滑肌動蛋白(α-SMA)和波形蛋白(vimentin)等，同時其上皮細胞標(biāo)記物表達的降低或消失，如E-鈣粘附蛋白和細胞角蛋白(CK)等。關(guān)于慢性腎纖維化，據(jù)報道有促腎纖維化作用的細胞因子很多，目前較公認的促纖維化因子要屬轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)[1]，TGF-β1促腎纖維化形成的機制尚未完全闡明。本研究以人腎小管上皮細胞體外培養(yǎng)細胞系、HK-2 細胞為觀察對象，觀察TGF-β1是否具有誘導(dǎo)體外培養(yǎng)HK-2細胞出現(xiàn)上皮向間充質(zhì)細胞表型轉(zhuǎn)化能力，期望能為慢性腎纖維化研究提供實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

1.1.1細胞系：HK-2 細胞系(人腎小管上皮細胞體外培養(yǎng)細胞系)購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，培養(yǎng)于含10%胎牛血清(FBS)DMEM/F12培養(yǎng)液。

1.1.2主要試劑：廣譜細胞角蛋白(CK)、E-鈣粘附蛋白和α-SMA的單克隆抗體，及免疫組織化學(xué)UltraSensitiveTM S-P超敏試劑盒購自福州邁新公司。TGF-β1購自Peprotech 公司。RNA抽提試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑，PCR試劑盒TAKARA公司產(chǎn)品。

1.1.3引物：根據(jù)GENBANK數(shù)據(jù)分別設(shè)計α-SMA、細胞角蛋白-19(CK-19)、波紋蛋白(vimentin)和β-actin的PCR引物，引物由上海生工生物工程技術(shù)公司合成，序列見表1。

表1 PCR引物序列

1.2 方法

1.2.1HK-2培養(yǎng)細胞爬片：收集10% FBS DMEM/F12培養(yǎng)的HK-2細胞，以4×103個/孔接種于放有蓋玻片24孔培養(yǎng)板， 在37℃、5%CO2條件10% FBS DMEM/F12培養(yǎng)24 h、無血清DMEM/F12繼續(xù)培養(yǎng)24 h，各誘導(dǎo)各組0.5 ml的DMEM/F12培養(yǎng)體系中加TGF-β1，使TGF-β1終濃度分別為1 μg/L、5 μg/L和10 μg/L，對照組細胞加等體積0.1M PBS代替TGF-β1。每組設(shè)10個重復(fù)樣；分別于誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h，48 h，72 h取出蓋玻片，4%多聚甲醛室溫固定細胞30 min。

1.2.2免疫細胞化學(xué)染色：以CK和E-鈣粘附蛋白為上皮細胞標(biāo)記物；α- SMA為間充質(zhì)細胞的標(biāo)記物。上述固定的細胞經(jīng)0.1%TritonX-100細胞打孔15 min，PBS洗5 min×3次；分別滴加一抗(抗CK抗體、E-鈣粘附蛋白抗體和α-SMA抗體，1∶200稀釋)4℃過夜，按UltraSensitiveTM S-P超敏試劑盒說明操作，DAB顯色、蘇木素復(fù)染細胞核。試劑盒提供的陽性片做陽性對照，0.01M PBS代替一抗為陰性對照。結(jié)果判定：根據(jù)DAB著色的有無，細胞明確棕黃色著色為陽性，無著色為陰性。

1.2.3RT-PCR檢測：以CK-19為上皮細胞標(biāo)記物；vimentin和α-SMA為間充質(zhì)細胞標(biāo)記物，β-actin為RT-PCR的內(nèi)參。收集培養(yǎng)HK-2細胞，3×105接種于25 cm的培養(yǎng)瓶中，后續(xù)培養(yǎng)及TGF-β1誘導(dǎo)濃度分組同上，誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h用Trlzol法提取細胞總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑說明書逆轉(zhuǎn)錄合成第一條cDNA鏈，以等量cDNA為模板進行PCR反應(yīng)，分別檢測CK-19、vimentin和α-SMA 的mRNA 表達。PCR反應(yīng)條件：94℃變性1 min，進入循環(huán)，94℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸1 min；共 30個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。2%瓊脂糖凝膠電泳，陽性條帶以電泳凝膠定量分析系統(tǒng) (EDAS120,Kodak) 進行灰度掃描，計算各標(biāo)記物mRNA相對表達量。計算公式為：mRNA相對表達=標(biāo)記物 mRNA 平均密度值/內(nèi)對照β-actin 平均密度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析簡明統(tǒng)計軟件10.32進行統(tǒng)計學(xué)分析，多組計量資料比較采用方差分析，相互比較，兩組均數(shù)之間用q檢驗，P<0.05具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1誘導(dǎo)HK-2細胞的免疫細胞化學(xué)染色

在TGF-β1濃度分別為1 μg/L、5 μg/L和10 μg/L條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)HK-2細胞至24 h，其上皮細胞標(biāo)記物E-鈣粘附蛋白的陽性染色與對照組相比無明顯差異；繼續(xù)誘導(dǎo)48 h E-鈣粘附蛋白染色強度有所減少；當(dāng)誘導(dǎo)培養(yǎng)至72 h 各誘導(dǎo)組細胞E-鈣粘附蛋白表達與對照組相比明顯減少，10 μg/L TGF-β1誘導(dǎo)組E-鈣粘附蛋白染色消失為陰性。但上皮細胞的另一個標(biāo)記物CK的陽性表達，無論是在誘導(dǎo)培養(yǎng)的24 h、48 h、還是72 h與對照組相比均未見有明顯差異。同時間充質(zhì)細胞的標(biāo)記物α-SMA免疫細胞化學(xué)染色表現(xiàn)為：誘導(dǎo)培養(yǎng)致48 h，各誘導(dǎo)組細胞均出現(xiàn)α-SMA染色的可疑陽性；繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)達72 h，各誘導(dǎo)組細胞的α-SMA陽性染色明確，即各誘導(dǎo)組HK-2細胞出現(xiàn)了明確的間充質(zhì)細胞標(biāo)記物的陽性表達。 以5 μg/L的TGF-β1誘導(dǎo)組，HK-2細胞的α-SMA陽性表達最強。即HK-2細胞經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)培養(yǎng)后，其上皮細胞標(biāo)記物E-鈣粘附蛋白表達明顯減少，同時出現(xiàn)有間質(zhì)細胞標(biāo)記物α-SMA的陽性，說明TGF-β1誘導(dǎo)使體外培養(yǎng)的HK-2細胞出現(xiàn)了上皮向間充質(zhì)細胞的表型轉(zhuǎn)化。

2.2 TGF-β1誘導(dǎo)RT-PCR檢測

為驗證免疫細胞化學(xué)染色結(jié)果，選擇CK-19為上皮細胞標(biāo)記物，α-SMA和vimentin為間充質(zhì)細胞標(biāo)記物，以同樣的TGF-β1濃度和條件誘導(dǎo)培養(yǎng)HK-2細胞48 h，RT-PCR檢測各標(biāo)記物的mRNA表達，結(jié)果見表2。表2中可見在TGF-β1濃度分別為1 μg/L、5 μg/L和10 μg/L誘導(dǎo)培養(yǎng)后， HK-2細胞的上皮細胞標(biāo)記物CK-19 mRNA的陽性表達對照組相比未見有明顯改變，但其間充質(zhì)細胞標(biāo)記物α-SMA和vimentin的mRNA表達出現(xiàn)了明顯的增高，間質(zhì)細胞標(biāo)記物mRNA的表達增高也是以5 μg/L TGF-β1誘導(dǎo)組為最明顯，與免疫細胞化學(xué)染色結(jié)果相對應(yīng)。進一步提示TGF-β1可誘導(dǎo)HK-2細胞出現(xiàn)上皮-向間充質(zhì)細胞的表型轉(zhuǎn)化，以TGF-β1濃度為5 μg/L誘導(dǎo)組細胞的表型轉(zhuǎn)化最為明顯。

表2 HK-2細胞各標(biāo)記物mRNA相對表達量(mean±s，n=4)

*P<0.01 與對照組相比;ΔP<0.01與另兩劑量組比較

3 討論

腎間質(zhì)內(nèi)肌成纖維細胞形成及其產(chǎn)生的細胞外基質(zhì)積聚被認為是慢性腎纖維化的關(guān)鍵因素[3]。1995年Strutz等觀察到腎小管上皮細胞在接觸腎毒素后可轉(zhuǎn)化成具有纖維細胞特征的細胞并能表達波形蛋白，率先提出了腎小管上皮細胞的“上皮-間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化”概念，現(xiàn)亦可稱為“上皮向間充質(zhì)細胞的表型轉(zhuǎn)化”，隨后越來越多的實驗提示腎小管上皮細胞出現(xiàn)的表型轉(zhuǎn)化是腎纖維化肌成纖維細胞重要來源之一[4,5]。到目前為止，人們認為腎纖維化肌成纖維細胞的來源至少有如下幾種可能：腎間質(zhì)成纖維細胞，血管旁周細胞，骨髓來源的纖維細胞，腎小管上皮細胞，血管內(nèi)皮細胞和巨噬細胞[6]。

無論肌成纖維細胞的來源如何，腎纖維化均是由腎臟損傷所釋放的損傷因子引起，包括：TGF-β1、結(jié)締組織生長因子、白細胞介素-1、血管緊張素II、蛋白酶、纖溶酶元激活物抑制劑-1和糖化終產(chǎn)物等[1.3,7]；損傷因子刺激或誘導(dǎo)腎內(nèi)肌成纖維細胞形成并產(chǎn)生細胞外基質(zhì)[7]。為進一步探討腎纖維化的形成機制，本研究選擇目前較公認的促纖維化因子TGF-β1，觀察TGF-β1是否具有誘導(dǎo)體外培養(yǎng)人腎小管上皮細胞系HK-2出現(xiàn)上皮向間充質(zhì)細胞的表型轉(zhuǎn)化，結(jié)果顯示在TGF-β1濃度分別為1 μg/L、5 μg/L和10 μg/L條件下，雖然HK-2細胞CK的免疫細胞化學(xué)陽性染色始終未見有明顯改變；但上皮細胞另一個標(biāo)記物E-鈣粘附蛋白的陽性染色則有所降低，誘導(dǎo)至72 h E-鈣粘附蛋白陽性染色與對照組相比明顯減少，10 μg/L TGF-β1誘導(dǎo)組E-鈣粘附蛋白表達甚至消失；同時間充質(zhì)細胞標(biāo)記物α-SMA在HK-2細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h出現(xiàn)了可疑陽性染色，繼續(xù)誘導(dǎo)至72h α-SMA的陽性染色明確。 說明TGF-β1能夠誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的HK-2細胞出現(xiàn)上皮向間充質(zhì)細胞的表型轉(zhuǎn)化。為驗證免疫細胞化學(xué)染色的結(jié)果，本研究用RT-PCR進一步檢測各標(biāo)記物的mRNA；結(jié)果顯示HK-2細胞經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)，其間充質(zhì)細胞標(biāo)記物α-SMA和vimentin的 mRNA表達明顯增高，但上皮細胞標(biāo)記物CK-19的mRNA表達未見有明顯降低或消失，這與免疫細胞化學(xué)染色結(jié)果相對應(yīng)。 本實驗從mRNA 和蛋白水平上證實了TGF-β1可誘導(dǎo)HK-2細胞出現(xiàn)間充質(zhì)細胞的標(biāo)記物的陽性表達和表達增高,但其上皮細胞標(biāo)記物僅表現(xiàn)為部分標(biāo)記物表達的減少或消失，并非是所有的上皮細胞標(biāo)記物表達的減少消失，該現(xiàn)象意義尚不清楚。實際一直以來體內(nèi)的腎小管上皮細胞是否有完整“上皮-間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化”始終存有爭議，因為通過譜系追蹤方法在體內(nèi)無法證明腎小管上皮細胞能完全轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細胞[8]，因此近期研究又提出了“部分上皮-間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化”的概念，主要是指腎小管上皮細胞獲得間質(zhì)細胞的部分特征如表達α-SMA等，但并未完全轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞，并且認為腎小管上皮細胞雖未能轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細胞，但其出現(xiàn)的細胞表型改變或表型轉(zhuǎn)化足夠影響腎纖維化的進程[9,10]。

從TGF-β1誘導(dǎo)的劑量上看，本實驗免疫細胞化學(xué)染色和RT-PCR檢測結(jié)果均顯示間充質(zhì)細胞標(biāo)記物α-SMA和vimentin陽性表達的最強出現(xiàn)在TGF-β1濃度為5 μg/L誘導(dǎo)組，并非是濃度最高的10 μg/L組，促纖維化因子TGF-β1在體內(nèi)促腎小管上皮細胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化等一系列過程是否也依賴于TGF-β1的計量等相關(guān)問題有待于進一步研究。

總之，本研究結(jié)果顯示TGF-β1可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的HK-2細胞發(fā)生上皮向間充質(zhì)細胞的表型轉(zhuǎn)化，表型轉(zhuǎn)化能力與TGF-β1劑量相關(guān)；進一步提示促纖維化因子TGF-β1可通過促腎小管上皮細胞的表型轉(zhuǎn)化參與或促進慢性腎纖維化的形成。