胡 維，熊 丹，黃 娟

（湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，長沙 410007）

糖尿病腎?。―N）是糖尿病患者全身性微血管病變表現(xiàn)之一，也是糖尿病引發(fā)危害最大的一種慢性并發(fā)癥，亦是糖尿病患者死亡的主要原因之一[1]。糖尿病患者早期主要的臨床表現(xiàn)是尿蛋白，而蛋白尿是由足細胞損傷引起的[2]。有研究顯示，足細胞損傷的早期主要表現(xiàn)是足細胞通過上皮間充質轉化（EMT）的發(fā)生引起足細胞結構和功能的破壞，最終引起蛋白尿[3]。Rac1在機體生理病理過程中發(fā)揮重要作用，如細胞增殖、黏附及細胞骨架調節(jié)等過程[4-5]。在糖尿病腎病發(fā)生和發(fā)展的過程中炎癥反應及氧化應激與Rac1的激活異常密切相關[6]。Rac1是PAK1、p38MAPK等多條信號通路中發(fā)揮中樞紐帶作用。高糖誘導腎小管上皮細胞可通過激活p38MAPK信號通路誘發(fā)EMT[7]。補腎活血湯具有活血止痛、補腎壯筋的功效，在臨床上常用于治療糖尿病腎病。已有研究證實，補腎活血湯在糖尿病腎病中具有很多功能，如其可改善糖脂代謝，降低血脂水平等[8]，但其作用機制目前還缺乏深入研究。補腎活血湯在多種腫瘤中具有抑制EMT過程[9]，而其在糖尿病腎病中是否具有類似作用尚不明確，因此，本課題探究補腎活血湯在糖尿病腎病中改善足細胞損傷和減少EMT過程中發(fā)揮的作用并對其是否通過調控Rac1信號通路的分子機制進行研究。旨在深入研究補腎活血湯在糖尿病腎病中的作用機制，為臨床應用補腎活血湯進行糖尿病治療，解決目前糖尿病腎病缺乏特效治療手段等提供科學依據和轉化指導。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞：永生化的小鼠足細胞系MPC5購于上海弘順生物科技有限公司。主要試劑：胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基購于美國Hyclone公司；噻唑藍（MTT）購于美國Sigma公司；Transwell小室購于美國Corning公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購于碧云天生物技術有限公司；二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度檢測試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；底物電化學發(fā)光（ECL）試劑盒購于北京艾德萊生物科技有限公司；聚偏二氟乙烯（PVDF）膜購于上海化科實驗器材有限公司；GTP-Rac1抗體、p-PAK1抗體、p-p38抗體、p-β-catenin抗體、p65抗體及二抗均購于美國Abcam公司。

1.2 細胞培養(yǎng)和分組處理 體外培養(yǎng)永生化小鼠足細胞系MPC5，在I型膠原包被的培養(yǎng)瓶中，用RPMI 1640（含 10%FBS）+10 U/mL 重組小鼠 γ-干擾素，于33℃條件下培養(yǎng)足細胞，當融合度達到80%左右進行換液操作。用不含γ-干擾素培養(yǎng)基在37℃條件下，于含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3d換液1次，約14 d左右可見足細胞胞核胞體均顯著增大，胞漿有分枝狀不規(guī)則突起，此時為足細胞分化成熟。成熟的足細胞分為以下幾組進行處理：對照組，使用含有5.6 mmol/L葡萄糖的RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h；高糖組（糖尿病腎病足細胞損傷模型組），在含有30 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基中刺激48 h；補腎活血湯組，在含有30mmol/L葡萄糖、0.1mmol/L補腎活血湯的培養(yǎng)基中刺激48 h；NSC23766+高糖組，在含有30 mmol/L葡萄糖、10 μmol/L Rac1抑制劑NSC23766的培養(yǎng)基中刺激48 h；NSC23766+補腎活血湯組，在含有30 mmol/L葡萄糖、0.1 mmol/L補腎活血湯、10 μmol/L抑制劑NSC23766的培養(yǎng)基中刺激48h；PMA+高糖組，在含有30mmol/L葡萄糖、50 nmol/L激活劑 PMA的培養(yǎng)基中刺激48 h；PMA+補腎活血湯組在含有30 mmol/L葡萄糖、0.1 mmol/L補腎活血湯、50 nmol/L激活劑PMA的培養(yǎng)基中刺激48 h。

1.3 MTT法檢測各組足細胞增殖情況 對照組、高糖組、補腎活血湯組細胞按上所述處理48 h后，采用MTT法測定各組足細胞增殖情況。每孔中加入10 μL（濃度為10 mg/mL的MTT溶液，輕輕混勻后置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，取出細胞培養(yǎng)板，除去培養(yǎng)液，分別在每孔中加入150 μL二甲基亞砜溶液，混勻后置于震蕩儀上，低速震蕩反應10 min，于酶標儀490 nm處測定吸光度值（A值）。

1.4 流式細胞術檢測各組大腸癌細胞凋亡情況 將對照組、高糖組、補腎活血湯組細胞以前述條件下處理48 h后，用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）潤洗1次，加入無乙二胺四乙酸（EDTA）的胰蛋白酶消化1～2 min，加入完全培養(yǎng)基終止消化，以500 g離心5 min，以無菌預冷的PBS輕輕吹洗2次，并重懸制成密度為1×106/mL的單細胞懸液。將每組細胞懸液分別轉移至Falcon管，加入5 μL Annexin V-FITC及PI染料，置于避光處輕輕混合均勻，孵育15 min；各組 Falcon管中分別加入 400 μL binding buffer，1 h內上機檢測，Annexin V-FITC陽性且PI陰性細胞為凋亡細胞，并統(tǒng)計各組足細胞的凋亡率。

1.5 Transwell實驗和劃痕實驗檢測各組足細胞遷移能力 Transwell實驗：在Transwell小室的上室加入200 μL無血清培養(yǎng)基，下室加入600 μL無血清培養(yǎng)基，置培養(yǎng)箱中孵育2 h，將待檢測的對照組、高糖組、補腎活血湯組足細胞用0.25%的胰蛋白酶消化收集，用無血清培養(yǎng)基制備單細胞懸液。除去平衡后的Transwell小室無血清培養(yǎng)基，在Transwell下室加入含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基500 μL，上室加入200 μL細胞懸液，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后取出Transwell小室，用棉簽拭去上室細胞及細胞碎片，用2 mL多聚甲醛固定10 min后加入500 μL結晶紫溶液進行染色，PBS清洗后，在倒置顯微鏡下觀察、拍照、計數(shù)穿膜細胞個數(shù)，以對照組為參照，計算相對遷移指數(shù)表示細胞遷移能力。

劃痕實驗：用記號筆在6孔板背后均勻劃橫線，大約每隔0.5～1 cm一道，橫穿過孔，每孔至少穿過5條線。加入5×105/孔待測各組足細胞于6孔板中，以過夜能鋪滿孔板為宜，第2天用200 μL槍頭盡量垂直于6孔板背后橫線劃痕，槍頭要垂直，不能傾斜，用PBS洗滌細胞3次，去除劃下的細胞，加入無血清培養(yǎng)基。置于37℃含體積分數(shù)為5%CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。24 h取樣拍照，測量各組細胞轉移的距離，以對照組為參照，計算相對遷移指數(shù)表示細胞遷移能力。

1.6 RT-PCR檢測 各組細胞采用Trizol法提取總核糖核酸（RNA），用M-MLV反轉錄酶試劑盒將RNA反轉錄合成cDNA，用SYBR Green PCR Master Mix進行熒光定量PCR，反應體系為20 μL，反應條件為：95 ℃，10 min 預變性；95 ℃，30 s，65 ℃，1 min，共40個循環(huán)。每個樣品設置3個復管，以β-actin為內參，用相對定量 2-ΔΔCT進行分析。

1.7 Western blot檢測 各組細胞處理后培養(yǎng)48 h，收集各組細胞提取總蛋白，以BCA蛋白濃度檢測試劑盒測量提取蛋白濃度，將蛋白樣品與加樣緩沖液按體積比 4∶1混合后，95℃變性 10 min，加入 40 μg變性蛋白至聚丙烯酰胺凝膠電泳每個泳道孔中，在濃縮膠中采用80 V電壓，待溴酚藍進入到分離膠和濃縮膠邊緣時，調整電壓為130 V，電泳結束后將凝膠上的蛋白轉移至PVDF聚偏二氟乙烯膜上，轉膜結束后用TBS緩沖液漂洗，將膜置于含5%的脫脂奶粉封閉液中封閉2 h。除去封閉液，分別加入含相應一抗進行雜交，4℃條件下過夜孵育，再用二抗進行雜交，室溫孵育2 h。轉移至暗室，以ECL化學發(fā)光試劑盒進行發(fā)光，以成像儀曝光后采用Image J圖像分析系統(tǒng)分析各條帶灰度值，以β-actin為內參，分析各組足細胞中待測蛋白的表達量。

1.8 統(tǒng)計學分析 所得實驗數(shù)據均采用軟件SPSS 21.0進行統(tǒng)計分析，數(shù)據以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間差異比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 補腎活血湯改善高糖誘導的足細胞增殖抑制及凋亡 處理后48 h分別以MTT法和流式細胞術檢測各組足細胞增殖和凋亡情況，結果如表1所示，與對照組相比，高糖組細胞吸光度（A值）降低，凋亡率增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與高糖組相比，補腎活血湯+高糖組A值升高，凋亡率降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。提示高糖處理可抑制足細胞增殖，誘導細胞凋亡；補腎活血湯可改善高糖誘導的足細胞增殖抑制作用，減少高糖誘導的足細胞凋亡。說明補腎活血湯對高糖誘導的足細胞具有一定的保護作用。

表1 各組足細胞A值和凋亡率比較（x±s）

2.2 補腎活血湯減弱高糖誘導的足細胞遷移能力 各組足細胞處理48 h后以Transwell和劃痕實驗檢測各組足細胞體外遷移能力，結果如表2所示，與對照組相比，高糖組細胞遷移指數(shù)升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與高糖組相比，補腎活血湯組遷移指數(shù)降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。提示高糖處理可促進足細胞遷移能力，補腎活血湯可減弱高糖誘導的足細胞的遷移能力。

2.3 補腎活血湯減輕高糖誘導的細胞損傷和EMT的發(fā)生 各組足細胞處理48 h后以RT-PCR檢測各組足細胞及EMT發(fā)生過程標志指標的表達水平，結果如表3所示，與對照組相比，高糖組足細胞特異性指標P-cadherin、ZO-1 mRNA的表達水平均明顯降低，EMT發(fā)生過程標志 desmin、FSP-1 mRNA的表達水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與高糖組相比，補腎活血湯組足細胞P-cadherin、ZO-1 mRNA的表達水平明顯升高，desmin、FSP-1mRNA和蛋白的表達量顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。足細胞特異性指標P-cadherin、ZO-1的表達減少提示高糖可誘導足細胞損傷，而補腎活血湯可減少高糖誘導的足細胞損傷；高糖組足細胞間充質標志蛋白的高表達說明高糖誘導足細胞發(fā)生了EMT，而補腎活血湯可逆轉足細胞EMT的發(fā)生。

表2 各組足細胞遷移指數(shù)的比較（x±s）

表3 各組足細胞中P-cadherin、ZO-1、desmin、FSP-1 mRNA 的表達水平（x±s）

2.4 補腎活血湯對Rac1及其下游信號通路的影響 各組足細胞處理48 h后，以Western blot檢測各組足細胞中 GTP-Rac1、p-PAK1、p-p38、p-βcatenin、p65蛋白表達水平，結果如表4和圖1所示，與NSC23766+高糖組相比，NSC23766+補腎活血湯組足細胞中 GTP-GTP-Rac1、p-PAK1、p-p38、pβ-catenin、p65蛋白的表達水平均顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與PMA+高糖組相比，PMA+補腎活血湯組足細胞中GTP-GTP-Rac1、p-PAK1、p-p38、p-β-catenin、p65 蛋白的表達水平均顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。說明補腎活血湯可抑制Rac1及下游信號通路的激活。

3 討論

糖尿病腎病的發(fā)病機制和病因目前還不十分明確，但根據糖尿病腎病的病程和病理生理過程可發(fā)現(xiàn)，蛋白尿與糖尿病腎病進展關系密切[10]。研究表明，糖尿病腎病中足細胞的損傷是導致尿蛋白的主要原因之一[11]。高糖誘導足細胞中核內活化T細胞核因子蛋白介導的過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α的表達下調引起足細胞凋亡[12]。本研究結果顯示，高糖誘導下抑制足細胞增殖，誘導足細胞凋亡，足細胞上皮標志P-cadherin、ZO-1表達量減少，間充質標志desmin、FSP-1的表達顯著升高，提示引發(fā)足細胞發(fā)生EMT，且足細胞遷移能力增加。

表 4 各組足細胞中 GTP-Rac1、p-PAK1、p-p38、p-β-catenin、p65 蛋白表達水平（x±s）

圖1 Western blot檢測各組足細胞中GTP-Rac1、p-PAK1、p-p38、p-β-catenin、p65 蛋白的表達水平

補腎活血湯是治療糖尿病腎病常用的中藥藥劑，在糖尿病腎病治療中具有良好的治療效果，可明顯改善腎功能及血糖水平。近期研究顯示，糖尿病腎病患者以補腎活血湯治療后，患者病情發(fā)展得到有效控制，且尿蛋白排出量減少[13]。補腎活血湯對自發(fā)性高血壓所致大鼠心肌細胞損傷通過抑制心肌細胞凋亡，對心肌細胞具有一定的保護作用[14]。體外培養(yǎng)人乳腺癌MDA-MB-231細胞，在培養(yǎng)基中添加不同濃度的補腎活血湯，結果顯示補腎活血湯可抑制乳腺癌細胞生長和遷移，其作用機制是補腎活血湯與調控SDF-1/CXCR4信號通路活性有關[15]。本實驗結果顯示，補腎活血湯可緩解高糖誘導的細胞凋亡，提高足細胞增殖活性，減少高糖誘導的足細胞遷移，逆轉足細胞EMT的發(fā)生。

Rac1表達可通過與p21激活的激酶1（PAK1）和p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）信號傳導途徑相互作用改變細胞EMT[16]。PAK1、p38MAPK、βcatenin、p65作為Rac1下游重要的效應激酶和基因，這些激酶和基因的激活反應相應信號通路的激活。本實驗在高糖誘導的足細胞中加入Rac1抑制劑或激活劑后，GTP-Rac1、p-PAK1、p-p38、p-βcatenin、p65的表達水平均有不同程度的下調或上調，補腎活血湯處理后逆轉了這些蛋白的表達水平，說明補腎活血湯可調控Rac1及下游信號通路的活性。

綜上所述，足細胞在高糖誘導下發(fā)生凋亡、損傷及EMT，補腎活血湯可緩解高糖誘導的足細胞損傷，逆轉足細胞EMT的發(fā)生，其作用機制與補腎活血湯調控Rac1及下游信號通路的活性有關。為解決臨床應用活血補腎湯改善糖尿病患者腎損害提供實驗依據和理論基礎。