梁 軍，孫錦霞 ，果 靜，夏振華 *亞寶藥業(yè)集團股份有限公司，山西運城 04460；北京亞寶藥物研究院，北京 0

苯磺酸氨氯地平片（Amlodipinebesylate tablets）是由美國輝瑞制藥公司在20世紀80年代中期研制成功的一種新型二氫砒啶類鈣離子拮抗劑，主要用于治療高血壓和心絞痛，是目前治療高血壓病的首選藥物之一。該藥在合成時以及制劑的生產(chǎn)、貯存過程中，可能會產(chǎn)生工藝雜質(zhì)和降解雜質(zhì)（共有7個），分別為氨氯地平雜質(zhì) A、B、D、E、F、G、H。 因此控制這些雜質(zhì)在本品中的含量對保證用藥安全具有重要意義。其有關(guān)物質(zhì)檢測方法EP9.0[1]雖能夠全部檢出，但由于使用乙酸銨緩沖液且pH值為6.8左右，在該pH范圍內(nèi)流動相緩沖能力較弱，主要通過離子強度來達到雜質(zhì)分離的目的，所以耐用性極差，尤其是降解雜質(zhì)D和工藝雜質(zhì)A易發(fā)生重合或互換，給分析檢測帶來麻煩。而 ChP2015[2]、USP41[3]、JP17[4]等各國藥典也均有收載，但不能對所有雜質(zhì)進行有效分離或洗脫。也有文獻[5]對所有雜質(zhì)能夠分離，但使用的是磷酸鈉和甲醇體系，且甲醇比例高達90%，極易導(dǎo)致緩沖鹽析出，給測定帶來諸多困擾。其他文獻[6]不能對所有雜質(zhì)進行有效的分離或洗脫。

1 儀器與藥品、試劑

安捷倫1260高效液相色譜儀；十萬分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）。

氨氯地平雜質(zhì) A、B、D、E、F、G、H 對照品（深圳博泰爾公司）；苯磺酸氨氯地平對照品（中國食品藥品檢定研究院）；苯磺酸氨氯地平片（規(guī)格5 mg，批號1601201，亞寶藥業(yè)）；甲醇、乙腈為色譜純；磷酸、氨水為分析純；水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：C18（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相 A相：0.1%磷酸溶液（氨水調(diào) pH 3.5）-乙腈-甲醇（80∶10∶10）；B 相，乙腈-甲醇（70∶30）[梯度洗脫程序：B 相，0～15 min（25%～45%），15～45 min（45%～75%），45～50 min（75%~25%），50～60 min（25%）]；檢測波長：237nm；柱溫：30℃；流速：1.2mL·min-1；進樣量：20μL。

2.2 溶液的配制

2.2.1 稀釋液 取流動相A和B，以75∶25比例混合，作為稀釋液。

2.2.2 空白輔料溶液 稱取按照處方比例混合的空白輔料細粉適量，置50 mL量瓶中，加稀釋液約40 mL，超聲處理30 min，取出，放冷，用稀釋液稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為空白輔料溶液。

2.2.3 氨氯地平對照品溶液 取苯磺酸氨氯地平對照品適量，精密稱定，用稀釋液配成濃度為10μg·mL-1的氨氯地平對照品溶液。

2.2.4 雜質(zhì)對照品溶液 分別取氨氯地平雜質(zhì)A、B、D、E、F、G、H 對照品適量，精密稱定，分別用稀釋液配成濃度為2μg·mL-1的雜質(zhì)對照品溶液。

2.2.5 系統(tǒng)適用性溶液 稱取苯磺酸氨氯地平對照品約14mg（相當(dāng)含氨氯地平10mg），精密稱定，置10mL量瓶中，加稀釋劑適量使其溶解，再加入各雜質(zhì)貯備液適量，用稀釋液配成各雜質(zhì)濃度分別為2μg·mL-1、氨氯地平濃度為1mg·mL-1的系統(tǒng)適用性溶液。

2.2.6 供試品溶液 取本品1片（相當(dāng)于含氨氯地平50 mg），置50 mL量瓶中，加稀釋液40 mL，超聲處理30 min，使其溶解，取出，放冷，用稀釋液稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3 方法學(xué)驗證

2.3.1 專屬性考察 在“2.1”色譜條件下依次進樣稀釋液、空白輔料溶液、系統(tǒng)適用性溶液、氨氯地平對照品溶液、各雜質(zhì)對照品溶液和供試品溶液，結(jié)果表明，稀釋液和空白輔料溶液在氨氯地平及其7個雜質(zhì)出峰位置處均無顯著色譜峰干擾。見圖1。

圖1 苯磺酸氨氯地平HPLC圖譜

2.3.2 系統(tǒng)適用性考察 在“2.1”色譜條件下，對氨氯地平對照品溶液連續(xù)進樣6針，峰面積RSD為0.1%，小于5.0%，在系統(tǒng)適用性溶液中，氨氯地平和各雜質(zhì)間的最小分離度為2.47，大于1.5，該系統(tǒng)適用性良好。

2.3.3 檢測限和定量限考察 取氨氯地平對照品溶液和各雜質(zhì)對照品溶液，經(jīng)逐級稀釋制成檢測限（LOD，S/N≥3）和定量限（LOQ，S/N≥10）溶液，在“2.1”色譜條件下進行檢測，各組分的檢測限濃度均小于供試品濃度的0.01%，各組分的定量限濃度均小于供試品濃度的0.03%，能夠滿足所有雜質(zhì)的質(zhì)量控制要求，方法靈敏度良好。見表1。

2.3.4 線性范圍考察 取氨氯地平對照品溶液和各雜質(zhì)對照品溶液適量，分別從各雜質(zhì)定量限到限度濃度150%范圍內(nèi)，取不少于5個濃度的對照品溶液，按“2.1”色譜條件測定，以各對照品的峰面積為縱坐標（Y），以各對照品濃度為橫坐標（X，μg·mL-1），得出各雜質(zhì)的線性方程，結(jié)果表明，各雜質(zhì)在定量限到限度濃度150%濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，截距均遠小于雜質(zhì)限度濃度下的峰面積的25%，最大的為雜質(zhì)H，為2.1%，說明使用常見的一點標準濃度測定，給分析帶來方便，且誤差極小。見表2。

表1 各組分的檢測限和定量限

表2 各組分的線性范圍

2.3.5 校正因子的確定 根據(jù)“2.3.4”項下方法分別對各組分做兩條線性回歸方程，用氨氯地平與各雜質(zhì)線性回歸方程斜率比值計算雜質(zhì)校正因子，取兩次校正因子的平均值來確定各雜質(zhì)的校正因子，經(jīng)計算可知，雜質(zhì)A、D、G、H的校正因子分別為0.7、2.2、0.8、1.3； 雜質(zhì) B、E、F 的校正因子均為 1.0。二次的校正因子的測定誤差極小，說明該方法的耐用性好，使用自身對照準確度高。

2.3.6 精密度試驗 由于樣品中常不含有所有雜質(zhì)，為證明該法對所有符合質(zhì)量標準的產(chǎn)品適用，在測定樣品時同時測定加入雜質(zhì) （加入100%限度）的樣品，在“2.1”色譜條件下由兩位實驗員分別于不同時間使用不同儀器和色譜柱、平行制備6份供試品溶液和6份限度雜質(zhì)100%供試品溶液，結(jié)果顯示，在實驗員A和B的6份供試品溶液中，雜質(zhì)D%和總雜%的 RSD（n=6）和 RSD（n=12）均小于 18.0%；在6份雜質(zhì)限度100%供試品溶液中，各雜質(zhì)回收率均在 80.0%～120.0%，且 RSD（n=6）和 RSD（n=12）均小于10.0%，精密度良好，能夠滿足質(zhì)量的控制要求。

2.3.7 準確度試驗 在處方比例混合的空白輔料中，分別加入從LOQ到限度濃度150%范圍的各組分，計算各加樣回收率，各組分在LOQ水平對應(yīng)回收率在86.5%~124.9%，在限度50.0%~150.0%對應(yīng)得回收率在93.2%~115.7%，12份回收率的RSD%均小于7.3%，結(jié)果表明方法準確度較高。見表3。

表3 各組分加樣回收率結(jié)果

2.3.8 溶液穩(wěn)定性考察 取“2.2.3”配制的氨氯地平對照品溶液和“2.2.6”配制的供試品溶液，在“2.1”色譜條件下考察溶液穩(wěn)定性，結(jié)果表明，氨氯地平對照品溶液在室溫下放置69 h穩(wěn)定性良好 （與0 h相比回收率為101.3%），供試品溶液在57 h內(nèi)穩(wěn)定性良好 （與0 h相比各雜質(zhì)變化率均小于10.0%），溶液穩(wěn)定性良好。

2.3.9 耐用性考察 通過調(diào)整色譜柱、柱溫（±5℃）、波長（±2 nm）、流速（±0.1 mL·min-1）、緩沖液 pH 值（±0.2）、流動相比例（±3）等色譜參數(shù)后，系統(tǒng)適用性溶液各相鄰峰間的最小分離度均大于1.5，且系統(tǒng)適用性良好，測得的供試品溶液含量與正常條件相比RSD均小于20.8%（雜質(zhì)含量≤0.1%），在各組分加標100%供試品溶液中，各雜質(zhì)的回收率與正常條件比較均小于5.9%，該方法耐用性良好。

3 討 論

3.1 實驗分別采用PTFE材質(zhì)和尼龍6材質(zhì)為濾膜進行吸附考察，發(fā)現(xiàn)后者過濾時出現(xiàn)保留時間為42 min的未知峰，且該峰與雜質(zhì)A相鄰，分離度大于2.2，經(jīng)過查證為濾膜引入的峰，且與棄去初濾液的體積有關(guān)。濾膜材質(zhì)選擇不當(dāng)，會產(chǎn)生雜質(zhì)峰，且往往誤認為是輔料產(chǎn)生的峰而作出不科學(xué)的判斷。

3.2 在HPLC法測定有關(guān)物質(zhì)時，多使用梯度洗脫，如果有機相甲醇、乙腈比例較高可能會有緩沖鹽析出。本法在流動相A中含有一定的有機相，并改用磷酸的銨鹽作為緩沖液，可有效地避免析出現(xiàn)象。

3.3 三乙胺是HPLC法常見的添加劑，但其噪音很大，而且對柱有一定的損害，現(xiàn)在使用封尾處理的色譜柱可以達到相同的效果，鑒于此沒有采用《中國藥典》[2]的三乙胺體系，各雜質(zhì)及主成分峰對稱性很好。