王勇 陳燕瓊 溫書恒

摘要 為獲得具有高效溶磷解鉀能力的菌株，采用選擇性培養(yǎng)基從柑橘根部土壤中分離篩選具有溶磷解鉀作用的菌株，通過(guò)液體培養(yǎng)法進(jìn)一步比較篩選菌株的溶磷解鉀能力，選擇溶磷解鉀能力強(qiáng)的菌株進(jìn)行形態(tài)特征、生理生化特征、16S rDNA及gyrB基因同源性分析。結(jié)果表明，LW-1、LW-2、LW-3和LW-4這4株菌株具有解磷解鉀作用;其中，LW-3的解磷解鉀能力最強(qiáng)，其溶解無(wú)機(jī)磷量為19.06 μg/mL，相對(duì)增加38.64%，溶解有機(jī)磷量為17.06 μg/mL，相對(duì)增加28.57%，溶解鉀量為33.59 μg/mL，相對(duì)增加15.96%;經(jīng)鑒定確定菌株LW-3為紡錘形賴氨酸芽孢桿菌LW-3，是理想的菌肥生產(chǎn)用菌株。

關(guān)鍵詞 紡錘形賴氨酸芽孢桿菌;解磷;解鉀;篩選;鑒定

中圖分類號(hào) S182文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）10-0005-05

Abstract In order to obtain a strain of bacteria with efficient activity on solubilizing phosphate and potassium，strains were isolated by using selective medium in the root soil of citrus.The solubilization activity of strains were further compared by liquid culture method，then the strain with the strongest ability to dissolve phosphorus and potassium will be identified by the characteristics of morphological，physiological and biochemical tests and the homology analysis of 16S rDNA and gyrB genes.The results showed that there were four strains of LW1，LW2，LW3 and LW4 having the activity on solubilizing phosphorus and potassium on which the LW3 had the best performance.The strain of LW3 had inorganic phosphatesolubilizing content of 19.06 μg/mL，organic phosphatesolubilizing content of 17.06 μg/mL and potassiumsolubilizing content of 33.59 μg/mL，which relatively increased by 38.64%，28.57% and 15.96% respectively.The strain of LW3 was identified as Lysinibacllus fusiformis LW3 after a series of tests，which had most potentiality as fertilizerproducing bacteria.

Key words Lysinibacllus fusiformis;Phosphorus removal;Potassium removal;Screening;Identification

磷和鉀是植物生長(zhǎng)發(fā)育必需的營(yíng)養(yǎng)元素，土壤磷、鉀的供應(yīng)直接影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。我國(guó)土壤中磷、鉀的形態(tài)主要是不易被作物吸收利用的難溶性磷及礦物態(tài)鉀，能供植物直接吸收利用的磷、鉀資源極其有限[1]。為實(shí)現(xiàn)作物的增產(chǎn)增收，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中長(zhǎng)期大量施用磷肥、鉀肥，造成土壤板結(jié)、環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留等一系列的生態(tài)環(huán)境問(wèn)題和農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全問(wèn)題[2]。由于水溶態(tài)磷進(jìn)入土壤后易發(fā)生化學(xué)固定或吸附固定，使得磷肥當(dāng)季利用率極低，僅為10%～25%[3]，大大降低了磷肥肥效。因此，尋找一種既能增加土壤磷、鉀有效性，提高土壤肥力及磷鉀肥利用效率又能減少環(huán)境污染的方法成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。研究表明，將解磷菌、解鉀菌制成相應(yīng)的菌劑施入到土壤中，可以將土壤中難溶性磷和礦物鉀釋解為速效態(tài)磷、鉀，提高磷、鉀的有效化利用，減少化肥的施用量，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，提高作物產(chǎn)量和改善品質(zhì)[4-7]，同時(shí)微生物菌劑具有無(wú)毒、無(wú)污染的特點(diǎn)，既有化肥的效果，又能避免化肥的缺點(diǎn)，具有廣泛的開發(fā)應(yīng)用前景。為獲得具有高效解磷解鉀能力的菌株，筆者從柑橘根際土壤中分離篩選溶磷解鉀菌，研究其溶磷解鉀能力并進(jìn)行菌種鑒定，以期為生物菌肥的研制提供理論依據(jù)和菌種資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 儀器與試劑。

主要儀器是隔水培養(yǎng)箱（天津市泰斯特儀器有限公司），搖床培養(yǎng)箱（天津市泰斯特儀器有限公司），恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司），高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司），紫外可見分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司），原子吸收分光光度計(jì)（上海儀電分析儀器有限公司）等;主要試劑是過(guò)氧化氫溶液、氫氧化鈉溶液、硝酸溶液、鉬銻貯存溶液、鉬銻抗顯色劑、二硝基酚指示劑、磷標(biāo)準(zhǔn)溶液、鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液等。

1.1.2 培養(yǎng)基。

活化培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA）或LB培養(yǎng)基。種子培養(yǎng)基：玉米淀粉3.00 g，蔗糖1.20 g，硫酸銨0.48 g，硫酸鎂1.20 g，磷酸氫二鉀1.20 g，氯化鐵0.12 g，碳酸鈣1.20 g，酵母粉0.60 g，加蒸餾水定容至1 000 mL，pH 7.0～7.5。解磷固體培養(yǎng)基：①解無(wú)機(jī)磷固體培養(yǎng)基為葡萄糖10.00 g，硫酸銨0.50 g，氯化鈉0.30 g，硫酸鎂0.30 g，硫酸亞鐵0.03 g，硫酸錳0.03 g，碳酸鈣5.00 g，氯化鉀0.30 g，磷酸三鈣5.00 g，瓊脂粉15.00 g，加蒸餾水定容至1 000 mL ，pH 7.0～7.5;②解有機(jī)磷固體培養(yǎng)基同無(wú)機(jī)磷固體培養(yǎng)基，但將磷酸三鈣5.00 g替換為卵磷脂0.30 g。解鉀固體培養(yǎng)基：蔗糖10.00 g，磷酸氫二鈉1.00 g，硫酸銨0.50 g，硫酸鎂1.00 g，酵母膏0.20 g，硫酸亞鐵0.03 g，碳酸鈣2.50 g，鉀長(zhǎng)石粉10.00 g，瓊脂粉15.00 g，加蒸餾水定容至1 000 mL，pH 7.0～7.5。解磷液體培養(yǎng)基：①解無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)基為葡萄糖10.00 g，磷酸三鈣5.00 g，硫酸銨0.50 g，氯化鈉0.20 g，氯化鉀0.20 g，七水硫酸鎂0.30 g，硫酸錳0.03 g，七水硫酸亞鐵0.03 g，酵母粉0.50 g，加蒸餾水定容至1 000 mL，pH 7.0～7.5;②解有機(jī)磷液體培養(yǎng)基同無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)基，但將磷酸三鈣5.00 g替換為卵磷脂0.30 g，并加碳酸鈣5.00 g。解鉀液體培養(yǎng)基為蔗糖10.00 g，七水硫酸鎂0.50 g，硫酸銨0.20 g，氯化鈉0.10 g，碳酸鈣0.10 g，鉀長(zhǎng)石粉5.00 g，加蒸餾水定容至1 000 mL，pH 7.0～7.5。培養(yǎng)基于高壓蒸汽滅菌鍋中121 ℃滅菌20 min。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 溶磷解鉀菌株的分離篩選。

從廣東江門古井采集柑橘根部土壤，將土壤自然風(fēng)干并研磨成粉得土壤樣品。稱取5.0 g土壤樣品溶于裝有45 mL無(wú)菌水和玻璃珠的三角瓶中，150 r/min，30 ℃振蕩20 min，得到10-1的土壤懸液，將土壤懸液置于80 ℃水浴鍋中水浴30 min，然后用移液槍吸取1 mL至裝有9 mL無(wú)菌水試管中，充分振蕩成10-2稀釋液，按無(wú)菌操作依次稀釋成10-5稀釋液。吸取100 μL稀釋液分別涂布于解無(wú)機(jī)磷、解有機(jī)磷和解鉀固體培養(yǎng)基上，于35 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，觀察產(chǎn)生溶磷圈、溶鉀圈的菌株，并挑取于NA培養(yǎng)基上進(jìn)一步純化，將各菌株重復(fù)平板溶磷解鉀試驗(yàn)。最后將各純培養(yǎng)菌株轉(zhuǎn)入25%甘油管并保存于4 ℃冰箱中。

1.2.2 液體培養(yǎng)試驗(yàn)。

將保存的菌株于營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA）或LB培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)24 h，挑取一環(huán)活化的各菌株分別接入50 mL種子培養(yǎng)基中，150 r/min、30 ℃搖床培養(yǎng)至穩(wěn)定期，測(cè)定各培養(yǎng)液的OD600，并用無(wú)菌水將各培養(yǎng)液OD600稀釋至相同后作為種子液;按5%接種量將種子液分別接種至100 mL 已滅菌的解無(wú)機(jī)/有機(jī)磷/鉀液體培養(yǎng)基中，以不接種任何菌液的解無(wú)機(jī)/有機(jī)磷/鉀液體培養(yǎng)基為對(duì)照（CK），3個(gè)重復(fù)，于30 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)7 d，制得解無(wú)機(jī)磷、解有機(jī)磷和解鉀的搖瓶發(fā)酵液供解磷解鉀能力測(cè)定。

1.2.3 解磷能力測(cè)定。

將解無(wú)機(jī)磷和解有機(jī)磷的搖瓶發(fā)酵液分別轉(zhuǎn)入蒸發(fā)皿中，在水浴鍋中濃縮至10 mL左右，加入2.0 mL 20% H2O2溶液，繼續(xù)蒸發(fā)并不斷攪動(dòng)，直至黏性物質(zhì)完全消化。將溶液轉(zhuǎn)移至離心管中3 500 r/min離心10 min，將上清液收集至50 mL容量瓶中，用蒸餾水定容，以磷酸二氫鉀為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，按鉬銻抗比色法[8]測(cè)定溶液中的磷含量，根據(jù)速效磷相對(duì)增加量衡量菌株的解無(wú)機(jī)磷和解有機(jī)磷能力。

1.2.4 解鉀能力測(cè)定。

將解鉀的搖瓶發(fā)酵液轉(zhuǎn)入蒸發(fā)皿中，在水浴鍋中濃縮至10 mL左右，加入2.0 mL 20% H2O2溶液，繼續(xù)蒸發(fā)并不斷攪動(dòng)，如此反復(fù)至黏性物質(zhì)完全消化。將溶液轉(zhuǎn)移至離心管中3 500 r/min離心10 min，將上清液收集至50 mL容量瓶中，用蒸餾水定容，以KCl為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定溶液中速效鉀含量。根據(jù)速效鉀相對(duì)增加量衡量菌株的解鉀能力。

1.2.5 菌株的鑒定。

選擇解磷解鉀能力最強(qiáng)的菌株進(jìn)行鑒定。菌株培養(yǎng)性狀的觀察：按《細(xì)菌分類學(xué)》的細(xì)菌培養(yǎng)性狀方法對(duì)菌株進(jìn)行培養(yǎng)性狀的觀察。常規(guī)生理生化特征的測(cè)定：對(duì)菌株進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)、VP試驗(yàn)、明膠水解試驗(yàn)、產(chǎn)H2S試驗(yàn)、檸檬酸生長(zhǎng)等試驗(yàn)。分子生物學(xué)特性測(cè)定：將純化的菌株LW-3送至中國(guó)科學(xué)院微生物研究所進(jìn)行16S rDNA及gyrB基因測(cè)序，獲得測(cè)序結(jié)果后登陸美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息所（national center for biotechnology information，NCBI）頁(yè)面，使用Blast程序進(jìn)行同源性比對(duì)分析，并通過(guò)MEGA 5.0軟件采用鄰接法建立菌株系統(tǒng)發(fā)育樹。綜合菌種的細(xì)胞形態(tài)、生理生化特征、16S rDNA序列及gyrB序列分析，確定菌株的屬種。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶磷解鉀菌株的分離篩選結(jié)果

用解無(wú)機(jī)磷、解有機(jī)磷和解鉀固體培養(yǎng)基共分離出4株溶磷解鉀菌。對(duì)4株菌株編號(hào)為L(zhǎng)W-1～LW-4，并重復(fù)平板溶磷解鉀試驗(yàn)，測(cè)定溶磷透明圈（D）、解鉀透明圈（D）及菌落直徑（d），以D/d的大小初步判斷菌株的解磷解鉀能力[9]，結(jié)果見表1。由表1可知，LW-3和LW-4在解無(wú)機(jī)磷、有機(jī)磷和鉀培養(yǎng)基上均產(chǎn)生透明圈，LW-1和LW-2分別在解無(wú)機(jī)磷和解鉀平板上無(wú)明顯透明圈產(chǎn)生。LW-3在解無(wú)機(jī)磷、有機(jī)磷和解鉀平板上的D/d均比其他3株菌株的D/d大，初步斷定LW-3的解磷和解鉀能力最強(qiáng)。

2.2 解磷解鉀能力 由表2可知，在解無(wú)機(jī)磷方面， LW-2、LW-3與LW-4菌株發(fā)酵液的速效磷含量相比CK顯著增加，LW-1菌株發(fā)酵液的速效磷含量與CK無(wú)顯著差異，其中，LW-3菌株發(fā)酵液速效磷含量高達(dá)49.33 μg/mL，解無(wú)機(jī)磷量為19.06 μg/mL，相對(duì)增加量最大，說(shuō)明4株菌株中，LW-3的解無(wú)機(jī)磷能力最強(qiáng)，與平板解無(wú)機(jī)磷試驗(yàn)結(jié)果一致。在解有機(jī)磷方面，各菌株均具有明顯的解有機(jī)磷效果，其中， LW-1與LW-2解有機(jī)磷能力無(wú)顯著差異，LW-3菌株發(fā)酵液速效磷含量及相對(duì)增加量最大，分別為59.71 μg/mL和28.57%，解有機(jī)磷量為17.06 μg/mL，其解有機(jī)磷能力也最強(qiáng)，與平板解有機(jī)磷試驗(yàn)結(jié)果一致。在解鉀方面，4株菌株的發(fā)酵液速效鉀含量存在顯著差異且高于CK的速效鉀含量，但LW-2在解鉀平板上無(wú)明顯透明圈產(chǎn)生，原因可能是平板中鉀濃度太大，使得LW-2的解鉀效果無(wú)法顯現(xiàn);4個(gè)菌株發(fā)酵液中，速效鉀含量最高的是LW-3菌株發(fā)酵液，達(dá)210.41 μg/mL，解鉀能力最強(qiáng)。綜合可知，4株菌株中，LW-3在解磷和解鉀方面均表現(xiàn)最顯著效果，解磷解鉀能力最強(qiáng)，是生物菌肥研制理想的菌種資源。

2.3 菌株LW-3的鑒定結(jié)果

2.3.1 菌株LW-3培養(yǎng)形狀。

2.3.2 菌株LW-3生理生化特征。

2.3.3 菌株LW-3分子生物學(xué)特性。

2.3.3.1 16S rDNA序列分析。

2.3.3.2 gyrB基因序列分析。

結(jié)合gyrB基因序列分析對(duì)菌株LW-3進(jìn)一步確認(rèn)，其gyrB基因系統(tǒng)發(fā)育樹見圖5。由圖5可知，菌株LW-3與紡錘形賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus fusiformis RB-21，檢索號(hào)：CP010820.1）的同源性達(dá)99%，因此，綜合菌株的菌落及細(xì)胞形態(tài)、生理生化特征、16S rRNA基因序列、gyrB基因序列等分析，確定菌株LW-3為紡錘形賴氨酸芽孢桿菌LW-3。

3 結(jié)論與討論

從土壤中共分離得到4株溶磷解鉀菌，液體培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果顯示，4株菌株中，菌株LW-3的解磷和解鉀能力最強(qiáng)，溶解無(wú)機(jī)磷量為19.06 μg/mL，相對(duì)增加38.64%，溶解有機(jī)磷量為17.06 μg/mL，相對(duì)增加28.57%，溶解鉀量為33.59 μg/mL，相對(duì)增加15.96%，是理想的菌肥生產(chǎn)用菌株，經(jīng)鑒定確定該菌株為紡錘形賴氨酸芽孢桿菌LW-3（Lysinibacllus fusiformis LW-3）。

除具有溶磷解鉀作用外，研究表明，紡錘形賴氨酸芽孢桿菌可產(chǎn)大量胞外多糖、氨基甲酸乙酯水解酶、植酸酶等有益物質(zhì)，具有溶藻、降解原油、除鉛、防治水稻紋枯病等特性[11-18]，對(duì)研究開發(fā)生物菌肥、生物農(nóng)藥、動(dòng)物飼料添加劑、水體凈化劑、土壤修復(fù)劑等具有重要意義，開發(fā)應(yīng)用前景極其廣闊。

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