戴圻霏 張斯童 孫旸

摘要 纖維素是地球上豐富的天然生物聚合物，是重要的可再生有機(jī)資源，在農(nóng)作物秸稈中尤為豐富。纖維素、半纖維素和木質(zhì)素混合組成木質(zhì)纖維素，木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性限制自然界中大量秸稈的降解。纖維素酶是將纖維素降解成葡萄糖的一類酶的總稱，主要作用于纖維素及其衍生物，在木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化利用方面發(fā)揮核心作用。解淀粉芽孢桿菌是一類具有纖維素酶合成能力的細(xì)菌，其合成的纖維素酶具有產(chǎn)酶條件簡單，培養(yǎng)周期短，酶活力高的特點(diǎn)，因此具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值和前景。對近年來產(chǎn)纖維素酶解淀粉芽孢桿菌的篩選與發(fā)酵工藝及其特性進(jìn)行綜述，以期為纖維素酶的生產(chǎn)和應(yīng)用提供理論幫助。

關(guān)鍵詞 解淀粉芽孢桿菌;木質(zhì)纖維素;纖維素酶

中圖分類號 TQ925文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）10-0014-04

Abstract Cellulose is a rich natural biopolymer on the earth. It is an important renewable organic resource and is especially abundant in crop straw.Lignocellulose consists of a mixture of cellulose，hemicellulose and lignin.But the complexity of lignocellulosic structure limits the degradation of large amounts of straw in nature.Cellulase is a general term for a class of enzymes that degrade cellulose into glucose. It mainly acts on cellulose and its derivatives and plays a central role in the conversion and utilization of lignocellulose.Bacillus amyloliquefaciens is a kind of bacteria with cellulase synthesis ability. Its synthesized cellulase has the characteristics of simple enzyme production conditions，short culture period and high enzyme activity. So it has wide application value and prospect.In this paper，the screening，fermentation process and characteristics of cellulaseproducing Bacillus amyloliquefaciens were reviewed in order to provide theoretical help for the production and application of cellulase.

Key words Bacillus amyloliquefaciens;Lignocellulose;Cellulase

秸稈是由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素混合組成的。由于秸稈莖葉表皮角質(zhì)層和硅細(xì)胞的阻抑、纖維素鏈分子結(jié)晶結(jié)構(gòu)的高抗蝕性等限制因素的存在，使其難以利用。纖維素是植物秸稈的三大重要成分之一，其主要的成分是由葡萄糖組成的大分子多糖[1]。纖維素在自然界中分布十分廣泛，并且是含量最多的一種多糖，占植物界碳含量的50%以上[2]。目前，纖維素是全球最為豐富的可再生生物資源，其開發(fā)利用被認(rèn)為是對秸稈能源回收再利用方面問題重要關(guān)鍵點(diǎn)。21世紀(jì)以來，能源問題越來越得到重視并且日益嚴(yán)峻，所以纖維素的開發(fā)和利用也成為目前研究的熱點(diǎn)，降解纖維素的方法很多，一般采用物理、化學(xué)、微生物法，但是物理和化學(xué)法因?yàn)樯a(chǎn)成本高、環(huán)境污染等問題導(dǎo)致效果并不是十分理想。與之相比，具有反應(yīng)條件溫和易控等優(yōu)點(diǎn)的生物降解法就備受青睞，纖維素酶能夠有效降解纖維素，纖維素酶在分解纖維素時(shí)起生物催化作用，纖維素是800～1 200個葡萄糖分子聚合而成，它可以將纖維素分解成寡糖或單糖的蛋白質(zhì)。因此，可通過微生物發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶降解秸稈中的纖維素，用于提高畜禽生產(chǎn)性能，提高秸稈利用率，改善飼料的營養(yǎng)價(jià)值，降低能源成本和提高經(jīng)濟(jì)效益，具有廣闊的開發(fā)前景，今后應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)纖維素酶研究和開發(fā)工作[3]。因此，篩選出高產(chǎn)纖維素酶菌株成為開發(fā)利用纖維素資源的核心工作。

解淀粉芽孢桿菌是一種與枯草芽孢桿菌親緣性很高的細(xì)菌，屬革蘭陽性芽孢桿菌[4]，菌落在多種固體培養(yǎng)基上均不產(chǎn)生熒光素。在LB培養(yǎng)基上呈淡黃色不透明菌落，可以合成多種纖維素酶，酶活力較高的是羧甲基纖維素酶和濾紙酶活，并且具有促進(jìn)木質(zhì)纖維素分解的能力。并且該細(xì)菌生長速度快，繁殖能力強(qiáng)，培養(yǎng)方式單一，產(chǎn)纖維素酶能力較強(qiáng)[5]。解淀粉芽孢桿菌對秸稈中纖維素再利用具有潛在的前景和價(jià)值。

1 纖維素酶

1.1 纖維素酶的來源與應(yīng)用

關(guān)于纖維素酶的研究[6]，早在1906年從蝸牛消化液中被發(fā)現(xiàn)，20世紀(jì)50年代Reese等提出C1-Cx假說來解釋對纖維素酶的作用方式，80年代中后期開始利用基因工程的方法對纖維素酶的基因進(jìn)行克隆并測定出一級結(jié)構(gòu)，90年代初開始探究厭氧細(xì)菌纖維小體超分子，并更深一層的探究其復(fù)合體結(jié)構(gòu)功能，現(xiàn)如今已經(jīng)進(jìn)入分子時(shí)代，開始探究纖維素酶的基因以及氨基酸[7]。一些產(chǎn)纖維素酶微生物和一些分泌纖維素酶原生動物是纖維素酶主要來源，真菌是目前工業(yè)生產(chǎn)更是纖維素酶的主要菌種，其中絲狀真菌以木霉屬、曲霉屬和青霉屬為主，纖維素酶產(chǎn)量高于其他微生物，所以被廣泛使用于纖維素酶產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。其他的真菌、細(xì)菌和放線菌也可以產(chǎn)纖維素酶[8]。產(chǎn)纖維素酶的細(xì)菌主要有梭狀芽抱桿菌、白色瘤胃球菌，所產(chǎn)纖維素酶是胞內(nèi)酶或吸附于細(xì)胞壁上，但是其酶活力與真菌相比較低一些，所以細(xì)菌產(chǎn)纖維素酶產(chǎn)業(yè)化開發(fā)受到一定的影響[9]。放線菌產(chǎn)纖維素酶主要包括鏈霉菌和彎曲高溫單孢菌等，其中鏈霉屬、高溫放線菌屬等酶活較高，但因產(chǎn)酶量相對較低且生長緩慢，所以近國內(nèi)外詳細(xì)研究較為困難。纖維素酶的主要應(yīng)用是生物拋光、生物石料、生物整理等紡織工業(yè)，食品工業(yè)中的淀粉加工、谷物酒精發(fā)酵、啤酒和釀酒業(yè)釀造、麥芽、提取和加工等，在農(nóng)業(yè)上主要用于控制植物病原體和疾病在農(nóng)業(yè)上，還有在家里洗衣服的洗滌劑，改善織物的柔軟度和亮度等[10-12]。

1.2 纖維素酶的成分與作用機(jī)制

纖維素酶是3種酶混合在一起的總稱：①內(nèi)切葡聚糖酶（endo-1，4-β-D-glucanase，EC.3.2.1.4，來自真菌的簡稱EG，來自細(xì)菌的簡稱Cen），作用于纖維素的非結(jié)晶區(qū)，主要水解纖維素長鏈中的β-1，4糖苷鍵，把纖維素大鏈分解成大量不同聚合程度的并且還帶有非還原端的纖維素短鏈[13];②外切葡聚糖酶（exo-1，4-β-D-glucanase，EC.3.2.1.91，又稱纖維二糖水解酶，來自真菌簡稱CBH，來自細(xì)菌簡稱Cex） ，與內(nèi)切葡聚糖酶相輔相成，作用于纖維素的結(jié)晶區(qū)，水解微晶纖維素分子中的還原端和非還原端的 β-1，4糖苷鍵并且釋放出大量的二糖;③β-葡萄糖苷酶（β-D-glucosidase，EC3.2.1.21，又稱β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，別名龍膽二糖酶、纖維二糖酶，簡稱BG），主要水解纖維二糖和可溶性寡糖，生成葡萄糖[14]，這是按照催化功能把纖維素酶分成了三大類。這3種酶相互協(xié)調(diào)共同作用在纖維素上，使纖維素長鏈最終水解成葡萄糖，如圖1所示。

2 解淀粉芽孢桿菌

最早由Priest 發(fā)現(xiàn)并鑒定出解淀粉芽孢桿菌，其經(jīng)典模式菌株為ATCC23350，自然界分布十分廣泛，在堆肥、土壤、植物表面和動物體內(nèi)、青貯玉米秸稈飼料、海洋赤潮甚至污水湖泊的底泥中均可發(fā)現(xiàn)并分離得到，并且根據(jù)國內(nèi)外不斷完善的菌種鑒定技術(shù)和鑒定方法和各種各樣的生理生化特征從而得到不同種的解淀粉芽孢桿菌。該菌基本特征是在LB固體培養(yǎng)基上形成圓形、扁平、濕潤有粘性的小菌落;在血瓊脂平板上呈現(xiàn)比較明顯透明溶血;在種子液中混濁生長，震蕩后管底沉淀生長[15]，經(jīng)革蘭染色，呈陽性。在顯微鏡下可見兩端鈍圓并且長短不一的桿菌，形狀狀呈直或接近直，約有（0.3～2.2） μm×（1.2～7.0） μm，并有大于菌體的次末端芽胞。解淀粉芽孢桿菌在 90%乙醇中 72 h、1 000 mg/L的 84消毒液中 18 h 、20 g/L戊二醛中60 min仍可以存活。但是通過紫外線照射 30 min，121 ℃壓力蒸汽滅菌 20 min，100 ℃煮沸 5 min都可以完全消滅其菌。此屬菌的模式菌為枯草芽孢桿菌，其最高生長溫度為 45～55? ℃，最低生長溫度為5～20? ℃[16]，嚴(yán)格好氧可兼性厭氧。利用基因序列進(jìn)行鑒定和分類的方法鑒定出其基因包括16S rDNA 和部分保守看家基因。目前，在 NCBI 中公布了大量解淀粉芽孢桿菌核糖體 16S rDNA 序列，可以作為參考序列進(jìn)行種間的比較鑒定[17-19]，特別是近年來隨著測序成本的降低，所以利用全基因組測序方法開展解淀粉芽孢桿菌的比較鑒定更為準(zhǔn)確和清晰。

3 解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶的研究

結(jié)合國內(nèi)外對解淀粉芽孢桿菌的研究，發(fā)現(xiàn)該菌可以降解秸稈，并可以作為分解纖維素能力較高的細(xì)菌，所以就目前來看解淀粉芽孢桿菌的選育是提高其纖維素酶酶活力研究的重點(diǎn)，利用合理的方法提高解淀粉芽孢桿菌的產(chǎn)纖維素酶和提高纖維素酶的穩(wěn)定性是目前研究的熱點(diǎn)，綜合目前國內(nèi)外的研究成果，對提高解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶活力的方法進(jìn)行概括，以期為纖維素酶的生產(chǎn)提供技術(shù)指導(dǎo)。

3.1 產(chǎn)纖維素酶解淀粉芽孢菌的分離與突變

目前國內(nèi)外針對解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶特異性的篩選方法已經(jīng)非常成熟。李蘅香等[20]從沼氣站的秸稈堆肥中分離篩到 1 株常溫下產(chǎn)纖維素酶的菌株，經(jīng)鑒定為解淀粉芽孢桿菌 CEL-1，采用Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)使其纖維素酶酶活力達(dá)161.34 U/mL，比優(yōu)化前提高了2.71 倍。劉宇等[21]從飼料樣品中篩選產(chǎn)纖維素酶益生菌，并通過形態(tài)學(xué)和系統(tǒng)進(jìn)化樹方法鑒定分離菌。同時(shí)對培養(yǎng)時(shí)間、pH和溫度等酶促反應(yīng)條件進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，最后經(jīng)過16S rRNA鑒定其為解淀粉芽孢桿菌，該菌粗酶液的濾紙酶活為1.5 U/mL，林曉瓊等[22]以玉米秸稈中的土壤里分離出的解淀粉芽孢桿菌為出發(fā)菌株，采用常壓室溫等離子體誘變系統(tǒng)（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）進(jìn)行物理誘變，用96孔板高通量篩選法細(xì)篩產(chǎn)纖維素酶活力高的突變菌株，找出了一株遺傳穩(wěn)定性良好的突變菌株T-16。產(chǎn)纖維素酶活力達(dá)到 1.759 U/mL，比出發(fā)菌株提高了 41.8%。 綜上所述，產(chǎn)纖維素酶的解淀粉芽孢桿菌多在土壤、飼料中以及秸稈表面容易發(fā)現(xiàn)并分離，同時(shí)不定向進(jìn)化較為效果顯著。

3.2 解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶發(fā)酵條件優(yōu)化

解淀粉芽孢桿菌根據(jù)培養(yǎng)基配方及其比例的改變，從而改變該菌生長活力，也可以導(dǎo)致產(chǎn)纖維素酶的能力也有所改變。培養(yǎng)基中碳源、氮源、金屬離子、接種量、培養(yǎng)時(shí)間、溫度、pH、表面活性劑及轉(zhuǎn)速等等因素都可以影響解淀粉芽孢桿菌的產(chǎn)纖維素酶的能力，所以可以通過試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化提高其纖維素酶活力，從而適合大規(guī)模生產(chǎn)。姜軍坡等[23]對解淀粉芽孢桿菌Tu-115菌株產(chǎn)纖維素酶液體發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，使其發(fā)酵液中羧甲基纖維素活力達(dá)到最高值為18.43 U/mL，比優(yōu)化前提高26.5倍。李紅亞等[24]前期獲得2株具有木質(zhì)素和纖維素降解能力的解淀粉芽孢桿菌菌株的基礎(chǔ)上，采用均勻設(shè)計(jì)法對解淀粉芽胞桿菌FJAT-8754產(chǎn)纖維素酶進(jìn)行三因素四水平優(yōu)化試驗(yàn)，在初始的發(fā)酵條件進(jìn)行重新發(fā)酵，24 h后，玉米秸稈中木質(zhì)素、纖維素和半纖維素的降解率分別達(dá)48.4%、30.5%和41.4%，優(yōu)于單株解淀粉芽孢桿菌降解秸稈能力。所以解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶的能力，對于秸稈飼草化利用中極具應(yīng)用前景，對降解秸稈方面有一定的開發(fā)價(jià)值，對保護(hù)環(huán)境做出貢獻(xiàn)。

3.3 對解淀粉芽孢桿菌纖維素酶基因的分子改造

早在20世紀(jì)90年代，Amold提出指定性進(jìn)化技術(shù)，通過試管作為載體，并通過某種手段快速改造酶基因，從而達(dá)到目標(biāo)酶某些理想性狀大量提高的目的[25-27]。自定向進(jìn)化技術(shù)發(fā)展以來，國內(nèi)外許多研究者通過PCR技術(shù)改造目標(biāo)酶，后期通過建立一定的篩選方法，篩選得到目標(biāo)酶目標(biāo)性狀有所提高的酶基因[28]。陳玉娟等[29]通過PCR擴(kuò)增獲得β-葡聚糖酶的基因，用電轉(zhuǎn)化的方法將其導(dǎo)入解淀粉芽孢桿菌B4801中，得到了能高效表達(dá)β-葡聚糖酶的重組菌株。該重組菌株在搖瓶發(fā)酵條件下的β-葡聚糖酶最高酶活為303 U/mL，是原始菌株酶活水平的11.84倍。15 L發(fā)酵罐發(fā)酵條件下胞外β-葡聚糖酶最高酶活為2 023 U/mL，是搖瓶發(fā)酵條件下酶活水平的6.67 倍。苗會[30]從解淀粉芽孢桿菌克隆得到內(nèi)切葡聚糖酶基因，成功在大腸桿菌BL21（DE3）中表達(dá)，通過易錯PCR改造內(nèi)切葡聚糖酶，通過高通量篩選，篩選出一株高產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶的菌株，其酶活測定顯示，相比原始菌株高17%，其最適pH由原來的5.6偏移到6.5，在pH 7.0～9.0時(shí)仍保持70%以上。目前已克隆得到多種纖維素酶的基因，很多都源于細(xì)菌，且解淀粉芽孢桿菌是革蘭氏陽性細(xì)菌，相比真菌更容易進(jìn)行基因的改造。

4 解淀粉芽孢桿菌益生特性

解淀粉芽孢桿菌不僅可以產(chǎn)纖維素酶，還具有其他諸多益生特性，很多學(xué)者根據(jù)不同益生特性的解淀粉芽孢桿菌菌株做出相關(guān)特異性試驗(yàn)。如對很多病菌具有抑制活性的抑菌蛋白 ba-ciamin，Wong等[31]從解淀粉芽孢桿菌NK10中通過分離純化得到此抑菌蛋白，使病原真菌生物膜通透性同時(shí)還得到增加。解淀粉芽孢桿菌還可以通過自身分泌的次生代謝物質(zhì)來促進(jìn)和保護(hù)菌體在植物體內(nèi)的叢集運(yùn)動、生物膜形成、定殖和繁殖等[32-33]來實(shí)現(xiàn)對植物的相互作用。有些具有能夠抑制使棉花枯萎病菌的生長特殊能力解淀粉芽孢桿菌，其菌株粗提液能夠造成棉花枯萎病的病原菌的菌絲消融、變細(xì)，菌絲膜發(fā)生破裂，原生質(zhì)體凝集滲漏，菌絲體扭曲變形，形成泡囊結(jié)構(gòu)，孢子的產(chǎn)生受到嚴(yán)重抑制，從而使病原菌無法正常生長[34]。并且根據(jù)上文所述，解淀粉芽孢桿菌具有很強(qiáng)的生長能力和適應(yīng)能力，并且廣泛生存在土壤中和在植物中，該菌有多種優(yōu)點(diǎn)，比如無不良反應(yīng)、無殘留、無污染、不產(chǎn)生耐藥性等，所以解淀粉芽孢桿菌應(yīng)用于益生菌制劑應(yīng)用價(jià)值巨大，潛力無窮。

5 展望

我國農(nóng)作物的秸稈蓄積量非常高，是極為豐富且能直接利用的可再生有機(jī)資源，但是我國秸稈的綜合利用僅在很小的一部分，大多數(shù)的秸稈都被人為就地點(diǎn)燃焚燒或直接丟棄在田間地頭，造成大量秸稈資源的浪費(fèi)并且還污染環(huán)境[35-36]。在眾多的秸稈利用技術(shù)中，微生物發(fā)酵技術(shù)因其能耗低，副產(chǎn)物少的優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用。由于秸稈中含有大量的木質(zhì)纖維素，微生物發(fā)酵技術(shù)在木質(zhì)纖維素的降解、菌體蛋白的富集以及有益代謝物的積累等方面就具有更為突出作用，其對環(huán)境友好及能源再生等優(yōu)點(diǎn)近年來受到國內(nèi)外科學(xué)工作者的廣泛關(guān)注。

解淀粉芽孢桿菌作為可以產(chǎn)纖維素酶的細(xì)菌，在自然界分布廣泛，易分離培養(yǎng)且易改造等優(yōu)點(diǎn)，可以有助于改善環(huán)境，減少秸稈的焚燒。通過不同方法在提高解淀粉芽孢桿菌的酶活力的同時(shí)也降低產(chǎn)酶成本，并且借鑒國內(nèi)外已有的研究成果，提高其產(chǎn)纖維素酶的酶活力，從而形成一個比較完善的木質(zhì)纖維素利用系統(tǒng)，最終實(shí)現(xiàn)木質(zhì)纖維素的分級利用，以達(dá)到節(jié)能減排和經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展的目標(biāo)。

纖維素酶作為一種高分子復(fù)合酶，具有復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)且不易分離、純化的特點(diǎn)，生產(chǎn)工藝需要不斷的研究和進(jìn)一步的完善，所以選擇優(yōu)良的菌株是提高纖維素酶活力關(guān)鍵。解淀粉芽孢桿菌繁殖能力強(qiáng)且增殖速度快，容易篩選與分離，發(fā)酵周期短，在工業(yè)生產(chǎn)上可以通過液態(tài)發(fā)酵工藝產(chǎn)酶。解淀粉芽孢桿菌作為細(xì)菌提高產(chǎn)纖維素酶活力的方法眾多，容易改造，在工業(yè)方面可以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。解淀粉芽孢桿菌不光具有產(chǎn)纖維素酶的特性，也還具備其他諸多的益生特性，所以解淀粉芽孢桿菌應(yīng)用于秸稈降解和畜牧養(yǎng)殖業(yè)，不僅能提高秸稈回收利用率，還可以在醫(yī)療方面防蟲治病，促進(jìn)動植物生長，同時(shí)緩解能源方面具有巨大的壓力，二次能源回收再利用具有很大的前景和應(yīng)用價(jià)值。并且根據(jù)國內(nèi)外目前所使用的方法可以提高解淀粉芽孢桿菌生產(chǎn)纖維素酶能力，為降低糧食加工副產(chǎn)物中纖維素含量、提高其利用率提供了參考。

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