秦遠(yuǎn)，黃丹丹，付彬玉，羅楊坤

610041成都，四川省腫瘤醫(yī)院·研究所，四川省癌癥防治中心，電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院 放療中心

非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer ，NSCLC)是肺癌最常見的組織學(xué)類型，可進(jìn)一步分為鱗癌、腺癌和大細(xì)胞癌，約占所有肺癌病例的80%～85%[1]。近年來NSCLC發(fā)病率不斷增高，是癌癥致死率最高的腫瘤，約75%患者發(fā)現(xiàn)時已處于中晚期，預(yù)后較差[2]。目前NSCLC治療決策及預(yù)后預(yù)測主要依靠的是以解剖信息為基礎(chǔ)的TNM分期系統(tǒng)[3]。尋找能夠反映腫瘤生物學(xué)特征的分子標(biāo)記可能會更好地進(jìn)行預(yù)后判斷從而提高NSCLC的生存率。缺氧是肺癌常見的生物學(xué)特征，誘導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor，HIF)表達(dá)的增加。高表達(dá)HIF與腫瘤的惡性程度、治療抵抗和較差預(yù)后相關(guān)[4-5]。而HIF的穩(wěn)定性是由脯氨酰羥化酶(prolyl hydroxylase，PHD) 緊密調(diào)節(jié)，該酶屬于雙加氧酶超家族成員，分為PHDl、PHD2和PHD3亞型，羥基化HIF的2個脯氨酸殘基，是HIF氧依賴性降解的關(guān)鍵酶[6]。其中PHD3受缺氧誘導(dǎo)表達(dá)最強(qiáng)，且在缺氧狀態(tài)下仍能保持其酶活性[7]。既往研究顯示PHD3(又名egl-9 family hypoxia inducible factor 3,EGLN3)在多種腫瘤中異常表達(dá)，在抑制腫瘤生長及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡中具有重要作用且與預(yù)后相關(guān)[4, 8-10]。但僅有很少的研究探索了PHD3在NSCLC中的預(yù)后價值[11-12]。本研究利用ONCOMINE和GEO (Gene Expression Omnibus)數(shù)據(jù)庫分析PHD3在NSCLC組織中的表達(dá)情況，并使用KaplanMeier Plotter和SurvExpress數(shù)據(jù)庫來探索其預(yù)后價值。

1 材料與方法

1.1 Oncomine 數(shù)據(jù)庫

ONCOMINE基因表達(dá)陣列數(shù)據(jù)庫 (www.oncomine.org), 是一個在線的癌癥微陣列數(shù)據(jù)庫以及數(shù)據(jù)挖掘平臺。在本研究中此數(shù)據(jù)庫被用來分析PHD3 mRNA在NSCLC腫瘤及正常組織中的表達(dá)水平[13]，應(yīng)用Students’t-test 分析PHD3 mRNA兩者間的表達(dá)差異。臨界值設(shè)定：P值為0.01；倍數(shù)變化為2。結(jié)果采用柱狀圖表示。

1.2 GEO 數(shù)據(jù)庫

為研究PHD3 mRNA表達(dá)與NSCLC臨床病理參數(shù)的關(guān)系，本研究從GEO數(shù)據(jù)庫中下載了表達(dá)譜和相應(yīng)的臨床信息。GSE41271包含275個病例，其中腺癌(lung adenocarcinoma，LUAD)183例，鱗癌(lung squamous cell carcinoma，LUSC)80例，刪除分期不明及無隨訪數(shù)據(jù)各1例，共有261例患者納入本研究。病例由PHD3 mRNA中位表達(dá)水平分為高低兩組，組間表達(dá)水平差異由卡方或t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。統(tǒng)計(jì)采用SPSS 22.0軟件包，雙側(cè)P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖像用GraphPad軟件繪制。

1.3 Kaplan-Meier Plotter(KM plotter)數(shù)據(jù)庫

PHD3的預(yù)后價值由KM plotter數(shù)據(jù)庫(www.kmplot.com)進(jìn)行分析，該數(shù)據(jù)庫包含了基因表達(dá)和臨床數(shù)據(jù)，可分析54 675個基因?qū)︻A(yù)后的影響，共有10 461例癌癥標(biāo)本，其中包含了中位隨訪期為49個月的2 437例NSCLC[14]。PHD3按中位表達(dá)值分為高和低兩組，采用Kaplan-Meier分析，相應(yīng)P值、風(fēng)險比(hazard ratio，HR)以及95%置信區(qū)間(confidence intervals，CI) 計(jì)算并被顯示在網(wǎng)頁上。Affymetrix探針集(219232_s_at)是PHD3的一個JetSet 探針集，被選擇產(chǎn)生Kaplan-Meier圖。

1.4 SurvExpress數(shù)據(jù)庫

SurvExpress數(shù)據(jù)庫是一個基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫和在線標(biāo)志物驗(yàn)證工具，使用標(biāo)志物基因作為輸入條件提供危險評估和生存分析[15]。本研究對The Cancer Genome Atlas(TCGA)數(shù)據(jù)庫中包含mRNA表達(dá)和臨床資料的650例NSCLC病例(LUAD 475例，LUSC 175例)進(jìn)行COX回歸分析。將PHD3輸入該數(shù)據(jù)庫分析，參數(shù)設(shè)置：使用原始分?jǐn)?shù)歸一化數(shù)據(jù)；多探針集采用最大行平均數(shù)；截尾數(shù)值為存活時間(天)。

2 結(jié) 果

2.1 PHD3 mRNA 在NSCLC中的表達(dá)水平

Oncomine數(shù)據(jù)庫中共有10項(xiàng)研究分析了PHD3 mRNA在NSCLC腫瘤組織和正常組織中的表達(dá)水平。薈萃10項(xiàng)研究結(jié)果顯示，與正常組織相比，PHD3 mRNA在腫瘤組織中高表達(dá)(P=0.028，圖1)。兩種病理亞型按臨界值設(shè)定的分析結(jié)果顯示，LUAD(Okayama，Su，Hou 數(shù)據(jù)集)和LUSC(Garber和 Hou 數(shù)據(jù)集)中PHD3 mRNA表達(dá)水平相對于正常組織均顯著增高(圖2A-E)。

圖1 Oncomine數(shù)據(jù)庫中PHD3在NSCLC中的表達(dá)

Figure 1. Expression of PHD3 in Non-Small Cell Lung Cancer(Oncomine Database)

圖2 Oncomine數(shù)據(jù)庫中PHD3在LUAD和LUSC中的表達(dá)

Figure 2. Expression of PHD3 in Lung Adenocarcinoma and Lung Squamous Cell Carcinoma (Oncomine Database)

2.2 PHD3 mRNA表達(dá)與NSCLC臨床病理參數(shù)的關(guān)系

本研究分析了GSE41271數(shù)據(jù)集中PHD3 mRNA表達(dá)與年齡、性別、種族、吸煙史、臨床分期、組織學(xué)類型等臨床病理參數(shù)的關(guān)系(表1)。

表1 PHD3 mRNA表達(dá)與NSCLC臨床病理參數(shù)的關(guān)系

Table 1. PHD3 mRNA Expression and Clinicopathological Parameters in Patients with Non-Small Cell Lung Cancer

ParametersNPHD3ExpressionLow(%)High(%)χ2PAge1.0870.297 ≤64(year)13373(54.89)60(45.11) >64(year)12862(48.44)66(51.56)Gender3.8860.049 Male14165(46.10)76(53.90) Female12070(58.33)50(41.67)Race3.0310.082 Caucasian231115(49.78)116(50.21) Non-caucasian3020(66.67)10(33.33)Smoking4.8730.087 Non2518(72.00)7(28.00) Yes233116(49.79)117(50.21)Miss31(33.33)2(66.67)Histology14.925<0.001 LUAD181108(59.67)73(40.33) LUSC8027(33.75)53(66.25)FinalStage15.1830.001 ⅠA～ⅠB13284(63.64)48(36.36) ⅡA～ⅡB4518(40.00)27(60.00) Ⅲ～Ⅳ8433(40.74)51(60.71)

PHD3: prolyl hydroxylase 3; LUAD: lung adenocarcinoma; LUSC: lung squamous cell carcinoma

結(jié)果顯示PHD3 mRNA在兩種病理亞型及臨床分期中表達(dá)顯著不同(P<0.001，P=0.001；圖3A、3B)。以PHD3 mRNA表達(dá)的中位值將患者分為兩組進(jìn)一步分析顯示，PHD3在男性(P=0.049)；臨床分期為Ⅱ及Ⅲ～Ⅳ期(P=0.001)以及LUSC亞型(P<0.001)的患者中表達(dá)增高；但在不同年齡，種族以及吸煙史組中無顯著差異。將性別、病理類型及臨床分期納入多因素Logistic回歸分析顯示：PHD3 mRNA表達(dá)與臨床分期(P=0.001)及病理類型(P<0.001)顯著相關(guān)，而與性別(P=0.222)無顯著相關(guān)性。

圖3 GSE41271數(shù)據(jù)集中PHD3在不同病理類型及臨床分期中的表達(dá)(A：病理類型；B：臨床分期 )

Figure 3. PHD3 Expression of in Different Pathological Types and Clinical Stages (GSE41271 Dataset)(A:Pathological Types; B: Clinical Stages)

2.3 PHD3 mRNA表達(dá)水平與NSCLC預(yù)后的關(guān)系

本研究應(yīng)用KM plotter數(shù)據(jù)庫分析PHD3 mRNA表達(dá)水平與NSCLC患者總生存率(overall survival, OS)的關(guān)系。分別有NSCLC患者(n=1 726，圖4A)，LUAD患者(n=591，圖4B)，LUSC患者(n=492，圖4C) 納入分析。結(jié)果顯示PHD3 mRNA表達(dá)水平顯著影響NSCLC和LUAD患者的OS (HR1.25,95%CI1.1～1.4,P<0.001；HR1.45,95%CI1.14～1.86,P=0.003)。高表達(dá)PHD3 mRNA患者的預(yù)后明顯低于低表達(dá)患者。而PHD3 mRNA表達(dá)水平對LUSC患者的預(yù)后無影響(HR1.15,95%CI0.9～1.47,P=0.260)。

本研究應(yīng)用SurvExpress數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步分析PHD3 mRNA表達(dá)水平與NSCLC患者的預(yù)后危險因素和累積生存的關(guān)系。該數(shù)據(jù)庫以PHD3 mRNA表達(dá)水平為風(fēng)險因素計(jì)算預(yù)后指數(shù)，用于生成風(fēng)險組別(高風(fēng)險和低風(fēng)險組)。本研究中風(fēng)險組別的樣本是以平分的形式進(jìn)行分析。對475例LUAD(LUAD-TCGA-lung adenocarcinoma dataset June 2016)的分析結(jié)果顯示PHD3 mRNA高表達(dá)與較差的生存顯著相關(guān)(P=0.013，圖5A)，在高風(fēng)險組中其表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.001，圖5B)。而對175例LUSC(LUAD-TCGA-lung squamous cell carcinoma dataset June 2016)的分析結(jié)果顯示，盡管PHD3 mRNA在高風(fēng)險組中顯著下調(diào)(P<0.001，圖6B)，但與預(yù)后無相關(guān)性(P=0.724，圖6A)。

圖4 Kaplan-Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫分析PHD3 mRNA對NSCLC患者總生存率的影響(A：NSCLC；B：LUAD；C：LUSC)

Figure 4. Effect of PHD3 mRNA on the Overall Survival of NSCLC Patients Generated from Kaplan-Meier Plotter(A: NSCLC; B: LUAD; C: LUSC)

圖5 SurvExpress數(shù)據(jù)庫分析PHD3 mRNA對LUAD患者預(yù)后的影響(A：生存曲線；B：不同風(fēng)險組基因表達(dá)水平)

Figure 5. Effect of PHD3 mRNA on the Prognosis of Lung Adenocarcinoma Patients Generated from SurvExpress(A:Survival Curves; B: Gene Expression in Different Risk Groups)

圖6 SurvExpress數(shù)據(jù)庫分析PHD3 mRNA對LUSC患者預(yù)后的影響(A：生存曲線；B：不同風(fēng)險組基因表達(dá)水平)

Figure 6. Effect of PHD3 mRNA on the Prognosis of Lung Squamous Cell Carcinoma Patients Generated from SurvExpress(A:Survival Curves; B: Gene Expression in Different Risk Groups)

3 討 論

本研究應(yīng)用四個公共數(shù)據(jù)庫對PHD3 mRNA在NSCLC中的表達(dá)水平以及預(yù)后價值進(jìn)行挖掘分析，結(jié)果顯示與正常組織相比，腫瘤組織中PHD3 mRNA表達(dá)水平明顯增高。高表達(dá)PHD3 mRNA提示NSCLC患者具有較差的預(yù)后。本研究還發(fā)現(xiàn)PHD3 mRNA表達(dá)水平與LUSC預(yù)后呈顯著負(fù)相關(guān)，但與LUSC的預(yù)后無相關(guān)性。因此本研究提示PHD3的表達(dá)水平可以作為LUAD預(yù)后的一個潛在生物學(xué)指標(biāo)。

PHD3是PHD家族的一員，包含兩個羥化酶單位及兩個蛋白二硫化物異構(gòu)酶亞單位，可羥基化HIF分子中特定的脯氨酸殘基，進(jìn)而通過泛素連接酶-蛋白酶途徑降解HIF[6]。PHD3不僅是腫瘤組織中氧分壓的感受器，還受其他應(yīng)激相關(guān)機(jī)制如生長因子剝脫的調(diào)節(jié)，這些特征使得PHD3成為腫瘤微環(huán)境的一個關(guān)鍵壓力感受器[16]。PHD3還具有不依賴于HIF的生物學(xué)功能，如調(diào)節(jié)細(xì)胞形態(tài)，抑制腫瘤細(xì)胞生長、分化、轉(zhuǎn)移及在缺氧條件下促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[17]。既往研究顯示PHD3在多種腫瘤中存在異常表達(dá)。本研究結(jié)果顯示PHD3 mRNA在NSCLC腫瘤組織中呈高表達(dá)，與既往研究結(jié)果一致[11, 18]。PHD3表達(dá)與臨床病理參數(shù)的研究結(jié)果存在著不一致：Giatromanolaki 等[19]分析結(jié)果顯示LUSC中PHD3表達(dá)增高；Andersen等[11]結(jié)果提示PHD3表達(dá)與臨床病理參數(shù)無相關(guān)性；Chen等[18]發(fā)現(xiàn)在較早臨床分期及分化較好的患者PHD3中高表達(dá)。本研究結(jié)果顯示PHD3 mRNA高表達(dá)與LUSC亞型，較晚的臨床分期相關(guān)。PHD3表達(dá)檢測水平(蛋白水平和mRNA水平)的不同可能會導(dǎo)致結(jié)果不一致。另外，本研究的組間分布不均(LUAD及早期臨床分期占多數(shù))及樣本量偏少也可能影響結(jié)果。PHD3表達(dá)受到多種因素調(diào)節(jié)：如神經(jīng)生長因子[16]，細(xì)胞間營養(yǎng)狀態(tài)[6]，HIF多態(tài)性[19]，PHD3甲基化[12, 20]；另外，肺癌是一個高度異質(zhì)性腫瘤，常伴隨著不同的分子表型和臨床特征[21-22]。因此PHD3的多因素調(diào)節(jié)以及腫瘤的異質(zhì)性特征使其表達(dá)呈現(xiàn)復(fù)雜性。未來應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量研究PHD3表達(dá)與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系。

關(guān)于PHD3在NSCLC中的預(yù)后價值，既往研究結(jié)果不一；Dopeso等[12]研究顯示，由于啟動子甲基化沉默PHD3基因，導(dǎo)致PHD3 mRNA低表達(dá)，與LUSC較差的OS相關(guān)。而另一項(xiàng)基于免疫組化的研究結(jié)果顯示高表達(dá)PHD3提示較差的疾病特異性生存率[11]。本研究結(jié)果顯示高表達(dá)PHD3 mRNA與NSCLC較差的OS相關(guān)，與后一個研究結(jié)果相似[11]。本研究還對PHD3在NSCLC的兩種主要亞型中的預(yù)后價值進(jìn)行了分析。對于LUAD，兩個生存數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果均顯示PHD3 mRNA表達(dá)增高提示較差的預(yù)后，提示PHD3發(fā)揮癌基因的作用，與蛋白水平的研究結(jié)果相似[11]。對于LUSC，本研究發(fā)現(xiàn)PHD3 mRNA表達(dá)水平與預(yù)后無相關(guān)性。盡管在高危險組中PHD3表達(dá)顯著降低，但PHD3不能將高危險組預(yù)后差的患者從總體患者中鑒別出來，與既往PHD3是抑癌基因的研究觀點(diǎn)不一致[4, 8-10]。本研究推測原因可能與LUSC數(shù)據(jù)集樣本含量偏少有關(guān)。未來應(yīng)該擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步分析PHD3在LUSC中的預(yù)后價值。另外本研究只針對mRNA水平進(jìn)行了分析，未對蛋白水平進(jìn)行分析，而且本研究是基于公共數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)挖掘分析，尚需獨(dú)立數(shù)據(jù)集的驗(yàn)證，也缺乏對相關(guān)分子生物學(xué)機(jī)制的基礎(chǔ)研究，因此仍需更多基于PHD3表達(dá)與NSCLC預(yù)后的研究進(jìn)一步驗(yàn)證兩者關(guān)系。

綜上，本研究深入分析了PHD3 mRNA在NSCLC中的表達(dá)水平以及預(yù)后價值，提示PHD3 mRNA在NSCLC腫瘤中呈高表達(dá),與NSCLC尤其是LUAD亞型的預(yù)后顯著相關(guān)。PHD3表達(dá)可以作為反映LUAD預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)。本研究結(jié)果為探索PHD3在肺癌中的研究提供了基礎(chǔ)，為預(yù)測患者的預(yù)后，鑒定高?；颊哌M(jìn)行個體化治療以及發(fā)展?jié)撛诘陌邢蛩幬锾峁┝死碚撘罁?jù)。

作者聲明：本文第一作者對于研究和撰寫的論文出現(xiàn)的不端行為承擔(dān)相應(yīng)責(zé)任；

利益沖突：本文全部作者均認(rèn)同文章無相關(guān)利益沖突；

學(xué)術(shù)不端：本文在初審、返修及出版前均通過中國知網(wǎng)(CNKI)科技期刊學(xué)術(shù)不端文獻(xiàn)檢測系統(tǒng)學(xué)術(shù)不端檢測；

同行評議：經(jīng)同行專家雙盲外審，達(dá)到刊發(fā)要求。