李美和，黨慧敏，劉艷巧，吳曉玲，劉潤俠，安 鵬

(1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院中醫(yī)科；2.婦產(chǎn)科，陜西 西安 710004)

氧化應(yīng)激(oxidative stress)是指活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)生成超出了機體內(nèi)抗氧化防御能力的不平衡狀態(tài)。過量的活性氧會損害細胞的脂類、蛋白質(zhì)或DNA，抑制其正常功能。因此，氧化應(yīng)激與許多人類疾病都有關(guān)系。越來越多的證據(jù)顯示，氧化應(yīng)激與流產(chǎn)、子癇前期等病理性妊娠的發(fā)生有密切關(guān)系[1-3]。在正常妊娠過程中，機體的氧化和抗氧化功能二者保持相對平衡，不會產(chǎn)生氧化應(yīng)激[4-5]。然而，由于任何原因引起的人滋養(yǎng)細胞氧化損傷，都會使其增殖和侵襲能力下降，胎盤形成和發(fā)育異常，最終發(fā)生病理妊娠[6]。

人胎盤滋養(yǎng)HTR-8/SVneo細胞系是一種永生化的滋養(yǎng)細胞株，與人類原代滋養(yǎng)細胞具有許多相似的特性。因人類原代滋養(yǎng)細胞在培養(yǎng)過程中不能維持很長時間，故HTR-8/SVneo細胞系已成為研究胎盤功能和妊娠相關(guān)疾病的有用工具。本資料選取此細胞系作為研究對象，試圖通過采用不同濃度及不同時間的過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)誘導(dǎo)滋養(yǎng)細胞發(fā)生氧化應(yīng)激，找到建立HTR-8/SVneo人胎盤滋養(yǎng)細胞氧化應(yīng)激模型的最佳條件，為研究人類妊娠病理性疾病奠定良好的基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料及儀器

2017年11月至2018年2月于西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院進行實驗，本研究采用一種永生化、孕早期、絨毛外滋養(yǎng)層細胞系HTR-8/SVneo(由加拿大安大略省皇后大學(xué)Charles Graham博士提供)。

DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素混合液及0.25%胰酶購于美國GIBCO公司。H2O2購于美國Sigma-Aldrich公司；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、丙二醛(malonic dialdehyde，MDA)及過氧化氫酶(catalase，CAT)試劑盒購于南京建成生物工程研究所有限公司；細胞增殖-毒性檢測試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8)購自日本株式會社上海同仁化學(xué)研究所；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)測試盒購于碧云天生物技術(shù)研究所；超氧化物陰離子熒光探針(dihydroethidium，DHE)購于英國Abcam公司；PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I細胞凋亡檢測試劑盒購于美國BD公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)與處理

在DMEM/F12培養(yǎng)基中對HTR-8/SVneo細胞進行培養(yǎng)，加入10%滅活的胎牛血清和1%青鏈霉素混合液，在37°C、5%CO2中培養(yǎng)至細胞狀態(tài)良好時進行下一步實驗。

1.2.2細胞形態(tài)觀察

取對數(shù)生長期的HTR-8/SVneo細胞，以每孔1×105細胞種植于6孔培養(yǎng)板，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后，實驗組分別給予不同終濃度的H2O2，分為50μmol/L H2O2組、150μmol/L H2O2組、300μmol/L H2O2組和500μmol/L H2O2組；同時設(shè)立對照組，相同實驗條件下分別繼續(xù)培養(yǎng)1、3、6、12h，棄培養(yǎng)上清，PBS洗2遍，即放于相差倒置顯微鏡下，于相同的物鏡倍數(shù)(10×)觀察細胞形態(tài)學(xué)改變并拍照。

1.2.3 CCK-8法檢測細胞存活率

前期實驗條件同1.2.2內(nèi)容，后棄培養(yǎng)上清，PBS洗2遍，加入提前配制的CCK-8工作液110μL(CCK-8溶液與培養(yǎng)基體積比為1：10)，置于37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育2h，在自動酶標儀上檢測450nm波長處各孔吸光度(OD)值。按下述公式計算細胞存活率：存活率(%)=(實驗組OD-空白孔OD)/(對照組OD-空白孔OD)×100%

1.2.4流式細胞儀檢測細胞凋亡

前期實驗條件同1.2.2內(nèi)容，后棄培養(yǎng)上清，冰冷的PBS洗2遍，用0.25%胰酶消化，收集細胞，800r/min離心5min，用100μL 1×loading buffer結(jié)合緩沖液重懸，分別加入5μL Annexin-V PE和5μL 7-AAD，混勻，室溫避光孵育15min，加入400μL 1×結(jié)合緩沖液，樣品置于冰上，1h內(nèi)用流式細胞儀(FACScanTM；Becton Dickinson Bioscience，加利福尼亞州圣何塞)檢測細胞凋亡情況。細胞分析采用配備的CellQuestTM軟件(Becton Dickinson生物科學(xué))。

1.2.5 DHE熒光探針檢測細胞內(nèi)ROS水平

前期實驗條件同1.2.2內(nèi)容，后棄培養(yǎng)上清，冰冷的PBS洗2遍，用1mL DHE(5μmol/L)重懸，37℃避光孵育30min，800r/min離心3min，冰冷的PBS洗2遍，用200μL PBS重懸，在流式細胞儀上進行檢測。用平均熒光強度(mean flourscenceindensity，MFI)表示ROS水平。

1.2.6檢測細胞培養(yǎng)上清中LDH含量及勻漿中SOD、CAT和MDA活性

前期實驗條件同1.2.2內(nèi)容，后吸取培養(yǎng)上清，隨后按試劑盒說明檢測細胞培養(yǎng)上清中LDH含量及細胞勻漿中SOD、CAT及MDA活性。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

2結(jié)果

2.1 CCK-8法檢測H2O2對HTR-8/SVneo細胞活力的影響

HTR-8/SVneo細胞50μmol/L在H2O2作用1、3、6h后，細胞存活率分別為103.48%、101.68%、96.79%；150μmol/L在H2O2作用1、3、6h后，細胞存活率分別94.69%、96.4%、88.17%，較對照組100%的存活率無明顯變化(P值分別為0.99、1.00、0.98、0.86、1.00、0.55)。與對照組100%相比，50μmol/L在H2O2作用12h后細胞存活率有所下降(80.74%)(*P<0.05)；300μmol/L在H2O2作用6、12h及500μmol/L在H2O2作用3、6、12h后，細胞損傷較重，且500μmol/L在H2O2作用后隨著時間增加，細胞損傷有加重趨勢，細胞存活率下降，分別為42.3%、32.77%、23.59%、12.85%；300μmol/L在H2O2作用3h后細胞存活率為76.78%，與對照組100%比較，細胞存活率明顯降低(F=7.793，**P<0.01)，既達到細胞損傷狀態(tài)，又存有一定的細胞活力，符合細胞實驗研究條件要求，見圖1。

圖1CCK-8法檢測H2O2對HTR-8/SVneo細胞存活率的影響

Fig.1EffectofH2O2onHTR-8/SVneocelllineactivityusing CCK-8method

2.2 HTR-8/SVneo細胞形態(tài)學(xué)觀察

50、150μmol/L H2O2組HTR-8/SVneo細胞形態(tài)無明顯改變，細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常、細胞輪廓清晰；300μmol/L H2O2組HTR-8/SVneo細胞形態(tài)發(fā)生改變，細胞皺縮、間隙增寬，有些呈片狀壞死脫落，但仍存活相對較多細胞；500μmol/L H2O2組HTR-8/SVneo細胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，細胞皺縮變圓，間隙增大，體積變小相應(yīng)減少，貼壁細胞明顯減少，大部分呈片狀壞死脫落，存活細胞較少，見圖2。

圖2不同濃度3h的H2O2作用HTR-8/Svneo細胞的形態(tài)的影響

Fig.2EffectofdifferentconcentrationsofH2O2oncellmorphologyafterculturingfor3hours

2.3流式細胞儀檢測H2O2對HTR-8/SVneo細胞凋亡的影響

與對照組2.35%比較，50、150μmol/L在H2O2作用1、3、6h引起的HTR-8/SVneo細胞凋亡率僅有輕度增加(50μmol/L 1、3、6h細胞凋亡率分別為4.15%、5.18%、5.23%，150μmol/L 1、3、6h細胞凋亡率分別為4.91%、5.25%、6.15%)，經(jīng)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P值分別為1.00、0.89、0.29、1.00、0.86、0.06)；隨作用時間延長，300μmol/L H2O2組的細胞凋亡率不斷增加(均**P=0.00<0.01)，其中300μmol/L在H2O2作用3h細胞凋亡率為25.05%，而300μmol/L在H2O2作用6、12h及500μmol/L在H2O2作用3、6、12h引起的細胞凋亡率呈快速上升趨勢(300μmol/L 6、12h細胞凋亡率分別為25.02%、39.05%，500μmol/L 3、6、12h細胞凋亡率分別為29.23%、44.05%、44.24%)，雖然與對照組2.35%相比有顯著差異(F=196.500，均**P=0.00<0.01)，但是其凋亡率較高，該處理對細胞損傷較大，導(dǎo)致細胞壞死，無法進一步研究使用，見圖3。

注：A圖中，Control為對照組；A1～A4為50μmol/L在H2O2作用1、3、6、12h情況；B1～B4為150μmol/L在H2O2作用1、3、6、12h情況；C1～C4為300μmol/L在H2O2作用1、3、6、12h情況；D1～D4為500μmol/L在H2O2作用1、3、6、12h情況。B圖為各組細胞存活率的定量分析。

圖3流式細胞術(shù)檢測H2O2對HTR-8/SVneo細胞凋亡的影響

Fig.3EffectofH2O2oncellapoptosisofHTR-8/SVneocellusingflowcytometry

2.4 DHE熒光探針檢測H2O2對HTR-8/SVneo細胞內(nèi)ROS水平的影響

與對照組相比，H2O2對HTR-8/SVneo細胞MFI水平的影響呈現(xiàn)出明顯的濃度和時間依賴性。與對照組12.63比較，50μmol/L及150μmol/L在H2O2作用1、3、6h，細胞MFI升高不明顯(50μmol/L 1、3、6h ，MFI值分別為12.76、13.59、15.50，150μmol/L 1、3、6h，MFI值分別為15.41、15.99、16.86)P值分別為1.00、0.72、0.66、0.77、0.56、0.41，均P>0.05 )，300μmol/L在H2O2作用3h的細胞MFI(17.95)明顯高于對照組的12.63(F=325.300，**P=0.00<0.01)，但300μmol/L在H2O2作用6、12h，細胞MFI分別為19.24、24.11及500μmol/L在H2O2作用3、6、12h，細胞MFI分別為19.82、34.57、42.26，造成大部分細胞死亡，細胞還存有很大的活力，有利于下一步的實驗，見圖4。

A

B

注：A圖中，Control為對照組；A1～A4為50μmol/L在H2O2作用1、3、6、12h情況；B1～B4為150μmol/L在H2O2作用1、3、6、12h情況；C1～C4為300μmol/L在H2O2作用1、3、6、12h情況；D1～D4為500μmol/L在H2O2作用1、3、6、12h情況。B圖為各組細胞內(nèi)超氧化物陰離子定量分析。

圖4DHE熒光探針檢測H2O2對HTR-8/SVneo細胞內(nèi)ROS水平的影響

Fig.4EffectofH2O2onintracellularROSlevelofHTR-8/SVneocellusingDHEfluorescenceprobe

2.5 H2O2對HTR-8/SVneo細胞內(nèi)SOD、MDA、CAT活力的影響及上清液中LDH活力的影響

與SOD為31.32、LDH為355、MDA為1.20、CAT為16.87相比，50、150μmol/L在H2O2作用1、3、6h的HTR-8/SVneo細胞分別為1.21、1.35、2.68、1.38、2.36、3.54(P值分別為1.00、0.22、0.13、0.99、0.21、0.06，均P>0.05)和LDH分別為401、475、505、546、566、637水平升高不顯著(P值分別為1.00、0.29、0.19、0.99、0.24、0.10，均P>0.05)，抗氧化SOD分別為30.78、27.33、25.27、23.57、23.27、20.34(P值分別為0.99、0.21、0.06、0.97、0.93、0.31，均P>0.05)，CAT含量為17.21、16.34、14.25、13.24、10.01、9.87降低不明顯(P值分別為0.55、0.64、0.78、0.37、0.19、0.07，均P>0.05)；與對照組相比，300μmol/L H2O2作用3、6、12h，500μmol/L H2O2作用3、6、12h均明顯降低了細胞培養(yǎng)上清液中SOD、CAT的活性，同時升高了MDA和LDH水平的表達(SOD分別為14.34、10.01、9.88、9.55、7.22、5.87；LDH分別為628、688、715、742、809、880；MDA分別為4.30、4.55、5.27、5.25、5.83、6.10；CAT分別為5.68、5.01、4.33、6.00、4.01、3.21)(SOD：F=12.210，LDH：F=11.830，MDA：F=12.730，CAT：F=17.720，均**P=0.00<0.01)，其中300μmol/L H2O2組作用3h，細胞中LDH為628.00、MDA為4.30，含量升高明顯，細胞培養(yǎng)上清液中SOD活性為14.37、CAT活性為5.68，但與6、12h及500μmol/L作用3、6、12h相比，其嚴重損傷水平較低，見圖5。

注：A為H2O2對HTR-8/SVneo細胞內(nèi)SOD活性的影響；B為H2O2對HTR-8/SVneo細胞內(nèi)LDH含量的影響；C為H2O2對 HTR-8/SVneo細胞內(nèi)MDA水平的影響；D為H2O2對HTR-8/SVneo細胞內(nèi)CAT水平的影響。

圖5H2O2對HTR-8/SVneo細胞內(nèi)SOD活性、LDH含量及MDA和CAT水平的影響

Fig.5EffectofH2O2onintracellularSOD,LDH,MDAandCATlevelsinHTR8-SVneocell

3討論

成功妊娠是一個非常復(fù)雜的過程，不僅需要母體免疫系統(tǒng)不排斥作為同種移植物的胎兒，還需要早孕期滋養(yǎng)細胞具有尤為重要的生理學(xué)功能，其中滋養(yǎng)細胞增殖與侵襲功能的正常發(fā)揮對于囊胚植入、胎盤的形成并建立合適的母-胎關(guān)系至關(guān)重要。氧化應(yīng)激在各種妊娠生殖疾病的發(fā)病機制中起著重要作用。氧化應(yīng)激損傷時滋養(yǎng)細胞凋亡常與過量的ROS產(chǎn)生[7-9]有關(guān)。因此，抑制氧化應(yīng)激所致的氧化損傷和凋亡是妊娠疾病的重要干預(yù)策略。由于H2O2作用于細胞會產(chǎn)生高度活性的自由基，導(dǎo)致細胞氧化，因此H2O2被廣泛應(yīng)用于建立細胞氧化應(yīng)激模型中[10]。故本研究利用HTR-8/SVneo人胎盤滋養(yǎng)細胞與H2O2共同孵育，以期建立氧化應(yīng)激損傷模型。

3.1ROS在氧化應(yīng)激中的作用

ROS作為有氧能量代謝的產(chǎn)物，其生理濃度的維持主要受SOD、CAT、LDH、MDA活性及谷胱甘肽、維生素C和維生素E濃度的影響[11-12]。當(dāng)這個系統(tǒng)失去平衡時，產(chǎn)生的不完全對立的ROS會導(dǎo)致線粒體功能的改變、蛋白質(zhì)活性的降低、核酸損傷及誘導(dǎo)凋亡。隨后不同的器官系統(tǒng)表現(xiàn)出組織損傷等一系列病理過程[13-15]。近年的研究結(jié)果顯示，缺乏充分調(diào)控的ROS被認為是導(dǎo)致胎盤病理、妊娠紊亂和早產(chǎn)的主要原因[16-21]。本研究結(jié)果顯示，300、500μmol/L H2O2組明顯提高了細胞ROS的水平，其中300μmol/L H2O2作用3h不僅在一定程度上增加了ROS水平(P<0.01)，且保證了細胞的活力；而300μmol/L H2O2在6、12h及500μmol/L H2O2在1、3、6、12h雖明顯增加了ROS的水平，但同時造成了細胞的大量死亡。此外，細胞內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)可以對抗氧化應(yīng)激，其中包括不同的自由基清除抗氧化酶和非酶抗氧化劑。SOD和CAT被認為是最重要的抗活性氧酶。SOD將超氧轉(zhuǎn)化為H2O2，然后CAT將H2O2分解為水和氧氣。SOD、CAT等細胞抗氧化酶可降低細胞內(nèi)ROS含量[22-23]，而脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物可間接反映氧化應(yīng)激下ROS的生成[24]。MDA作為細胞脂質(zhì)氧化最重要的產(chǎn)物，可加重細胞膜的損傷，反映細胞膜系統(tǒng)的損傷程度。LDH是一種糖酵解酶，是細胞質(zhì)膜完整性的指標，存在于機體所有組織細胞的胞質(zhì)內(nèi)，在生理狀態(tài)下不能穿透細胞膜，但當(dāng)細胞膜發(fā)生損傷時，LDH從細胞內(nèi)漏入細胞外基質(zhì)[25]，其含量是評價有機抗氧化能力的重要因素。本研究結(jié)果表明，經(jīng)H2O2作用后的實驗組，其細胞SOD及CAT水平較對照組均有明顯的減少，而LDH、MDA含量較對照組均有明顯的提高(均P<0.01)。由此表明，這些細胞抗氧化劑在清除自由基和維持氧化還原平衡方面亦發(fā)揮著關(guān)鍵作用。同時，經(jīng)比較分析各實驗組后顯示，300μmol/L H2O2組3h既能增加細胞MDA和ROS的生成，降低抗氧化酶活性，同時還出現(xiàn)SOD和CAT含量明顯下降，提示H2O2有改變細胞內(nèi)自由基水平的能力，造成細胞氧化應(yīng)激損傷，符合細胞氧化應(yīng)激模型條件的要求。

3.2細胞凋亡參與氧化應(yīng)激損傷

細胞凋亡是細胞死亡途徑的一種程序化和活躍的模式，在正常的生理或病理環(huán)境中受自身基因的調(diào)控[26]。由于氧化應(yīng)激損傷和細胞凋亡存在潛在相關(guān)性，故觀察了H2O2作用后的HTR-8/SVneo細胞是否也具有細胞凋亡增加的現(xiàn)象。本研究結(jié)果表明，300μmol/L H2O2作用于人胎盤滋養(yǎng)細胞后，細胞凋亡率相比對照組明顯增加，且隨著作用時間及濃度的增加，細胞凋亡率明顯上升，故表明H2O2對人胎盤滋養(yǎng)細胞有明顯的損傷作用(P<0.01)，其參與了細胞凋亡的過程。

綜上所述，H2O2可以通過增加細胞ROS和MDA的生成，降低細胞SOD、CAT和LDH水平，抑制抗氧化酶的活性，導(dǎo)致HTR-8/SVneo胎盤滋養(yǎng)細胞發(fā)生氧化應(yīng)激及細胞凋亡。比較H2O2不同作用時間及濃度后，明確300μmol/L H2O2在3h條件下HTR-8/SVneo人胎盤滋養(yǎng)細胞既可以發(fā)生明顯的氧化應(yīng)激及細胞凋亡，同時細胞仍具有一定的存活率，故可作為人胎盤滋養(yǎng)細胞氧化應(yīng)激模型應(yīng)用于各種妊娠病理疾病的研究中。