黃敏，朱慶曦，田霞，韓崢，譚潔

（武漢市第三醫(yī)院 消化內(nèi)科，湖北 武漢 430060）

家兔近端結(jié)腸特有的結(jié)腸袋與人結(jié)腸相似，家兔微觀層面結(jié)腸運(yùn)動(dòng)與功能的關(guān)系報(bào)道較多，家兔結(jié)腸運(yùn)動(dòng)模式具有肌源性和神經(jīng)源性特征[1-2]。人結(jié)腸高振幅壓力波（high amplitude propagating pressure wave,HAPW）與家兔結(jié)腸中長距離收縮運(yùn)動(dòng)（long distance contraction,LDCs）相似[3]。本課題組前期對家兔結(jié)腸運(yùn)動(dòng)模式有一定認(rèn)識[4]，深入研究結(jié)腸袋在人和家兔結(jié)腸運(yùn)動(dòng)模式中的作用有利于診療結(jié)腸功能紊亂。本實(shí)驗(yàn)擬研究比沙可啶對家兔近端結(jié)腸運(yùn)動(dòng)模式影響的神經(jīng)源性機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性家兔34 只，體重1.83 kg，購于武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，在武漢大學(xué)人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心統(tǒng)一常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑

比沙可啶粉劑（美國Selleck 公司），河豚毒素（Tetrodotoxin,TTX）（上海寶曼生物科技有限公司），配置生理鹽水、PBS 及Krebs 緩沖液所用試劑購自上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 基礎(chǔ)組、PBS 組（每組6 只）：以生理鹽水或PBS 迅速充盈家兔近端結(jié)腸，待運(yùn)動(dòng)模式穩(wěn)定約30 min 后，以1 ml/min 的速度持續(xù)腔內(nèi)灌注生理鹽水或PBS，預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該速度不影響遠(yuǎn)端量筒中的液平面。比沙可啶組（每組6 只）：用不同濃度比沙可啶混懸液（0.05、0.15 和0.25 mg/ml）以同樣速度（1 ml/min）持續(xù)灌注家兔近端結(jié)腸（給藥間隔＞ 30 min），且不斷用玻璃棒輕輕攪拌，以防比沙可啶沉淀。TTX 組（4 只）：PBS 持續(xù)腔內(nèi)灌注家兔近端結(jié)腸后，在浴槽內(nèi)加入2×105mol/L TTX 模擬結(jié)腸神經(jīng)受損，再持續(xù)灌注不同濃度比沙可啶混懸液，觀察運(yùn)動(dòng)模式變化。

1.3.2 恒溫浴槽試驗(yàn) 所有家兔禁食12～15 h 后，經(jīng)耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉（1 ml/kg）麻醉，分離出具有3 條結(jié)腸帶部分的近端結(jié)腸后，注入少量空氣將其處死。盡量去除結(jié)腸表面的黏膜和血管，以防影響時(shí)空圖制作。兩端分別連接液體灌注管和流出管，置于含37℃固定通氣（95%氧氣O2和5%二氧化碳CO2）Krebs 液的恒溫浴槽中（pH 7.3～7.4）。將帶有輸液泵的近端液體灌注管（內(nèi)徑3 mm，外徑4 mm）連接到50 ml 注射器上，置于浴槽上方10 cm，容器內(nèi)充滿PBS 溶液；遠(yuǎn)端流出管（內(nèi)徑5 mm，外徑6 mm）插入含PBS 溶液的量筒中，且將量筒置于1 000 ml 燒瓶中，腸腔內(nèi)壓力大小與PBS 液面水平相關(guān)，其液面距浴槽底部約4 cm。

1.3.3 時(shí)空圖 攝像頭在浴槽正上方的以錄像方式記錄整個(gè)結(jié)腸運(yùn)動(dòng)，數(shù)據(jù)采集通過Microsoft Lifecam Software 軟件，影像記錄經(jīng)改良Image J 軟件分析成時(shí)空圖。具有不同灰度圖像的時(shí)空圖Y 軸代表結(jié)腸直徑的變化，X 軸代表記錄的時(shí)間[5]。圖像越白代表結(jié)腸舒張?jiān)酵耆?，?nèi)徑越大；顏色越黑代表結(jié)腸收縮程度越劇烈，內(nèi)徑越小。時(shí)空圖中LDCs 表現(xiàn)為倒三角形黑色波，縱軸代表結(jié)腸收縮的節(jié)段，橫軸代表結(jié)腸收縮的持續(xù)時(shí)間，長度單位以浴槽底部的刻度（每小格代表1cm）進(jìn)行校準(zhǔn)，量化結(jié)腸直徑的變化。結(jié)腸運(yùn)動(dòng)模式的參數(shù)包括頻率（次/min，以每10 min 計(jì)算）、傳播長度（%，即傳播距離占整段近端結(jié)腸長度的百分比，由Image J 軟件中的Analyze 測量）、持續(xù)時(shí)間（s，由Image J 軟件中的Analyze 測量）、傳播速度（cm/s）及振幅指數(shù)（由Image J 軟件中的Dynamic Profile 插件讀出）等。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件及時(shí)空圖相關(guān)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成比（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基礎(chǔ)狀態(tài)下運(yùn)動(dòng)模式

基礎(chǔ)狀態(tài)下運(yùn)動(dòng)模式主要有：①高度節(jié)律性的袋狀收縮頻率為（0.58±0.08）次/min，推進(jìn)速度（0.015±0.003）cm/s；②快速收縮頻率為（5.0±1.26）次/min；③微小波頻率較恒定，為（8.3± 1.4）次/min，可單向傳播，也可雙向傳播，通常伴隨快速收縮或袋狀收縮；④LDCs 頻率為（0.6± 0.3）次/min，振幅指數(shù)為（0.86±0.14）。

2.2 比沙可啶結(jié)腸腔內(nèi)灌注引發(fā)節(jié)律性LDCs

在基礎(chǔ)或PBS 液持續(xù)灌注狀態(tài)下，每組僅1 只兔發(fā)生LDCs，而0.05、0.15 和0.25 mg/ml 比沙可啶組LDCs 發(fā)生率分別為44%（4/9）、67%（6/9）和89%（8/9），經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=17.100，P=0.001），比沙可啶組高于基礎(chǔ)組和PBS 組，持續(xù)腔內(nèi)灌注比沙可啶可引發(fā)LDCs?；A(chǔ)組和PBS 組LDCs頻率分別為0.5 和0.3 次/min，持續(xù)灌注0.05、0.15和0.25 mg/ml比沙可啶（31.67±6.23）min 后，各組LDCs 頻率比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=11.312，P=0.000），比沙可啶組高于基礎(chǔ)組和PBS組，比沙可啶組節(jié)律性LDCs 增加。見圖1和表1。

圖1 家兔近端結(jié)腸腔內(nèi)灌注比沙可啶引發(fā)LDCs

不同濃度比沙可啶組的LDCs頻率比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），0.15 和0.25 mg/ml 比沙可啶組引發(fā)LDCs 頻率高于0.05 mg/ml 比沙可啶組。不同濃度比沙可啶組的LDCs 持續(xù)時(shí)間、推進(jìn)速度及振幅指數(shù)比較，經(jīng)方差分析，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.3 比沙可啶對近端結(jié)腸袋狀收縮和快速收縮運(yùn)動(dòng)的影響

基礎(chǔ)組、PBS 組、比沙可啶組的袋狀收縮和快速收縮發(fā)生率比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），比沙可啶組低于基礎(chǔ)組和PBS 組。當(dāng)LDCs 規(guī)律出現(xiàn)時(shí)，袋狀收縮和快速收縮運(yùn)動(dòng)減弱或消失，提示比沙可啶通過引發(fā)LDCs 促進(jìn)家兔近端結(jié)腸的傳輸。見表2、3。

2.4 比沙可啶增強(qiáng)LDCs 的神經(jīng)源性機(jī)制

0.05、0.15和0.25 mg/ml 比沙可啶組持續(xù)腔內(nèi)灌注引發(fā)LDCs，在浴槽內(nèi)加入2×105mol/L TTX 后LDCs 消失。見圖2A、B。

表1 不同濃度比沙可啶組家兔近端結(jié)腸LDCs 比較 （n=6）

表2 各組家兔近端結(jié)腸快速收縮運(yùn)動(dòng)比較 （n=6）

表3 各組家兔近端結(jié)腸袋狀收縮運(yùn)動(dòng)比較 （n=6）

TTX 組給予TTX 約1 min 后除了微小波，其他運(yùn)動(dòng)模式均消失，再以0.05、0.15 和0.25 mg/ml 比沙可啶持續(xù)腔內(nèi)灌注不能恢復(fù)上述運(yùn)動(dòng)模式，提示比沙可啶通過神經(jīng)源性機(jī)制對家兔近端結(jié)腸發(fā)揮促動(dòng)力作用。見圖2C～E。

圖2 比沙可啶引發(fā)的家兔結(jié)腸LDCs 被TTX 抑制

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)腔內(nèi)灌注比沙可啶引發(fā)的LDCs 可被TTX 阻斷。當(dāng)TTX 致結(jié)腸神經(jīng)系統(tǒng)嚴(yán)重?fù)p害時(shí)，比沙可啶不再引發(fā)LDCs，提示比沙可啶通過神經(jīng)源性機(jī)制對家兔近端結(jié)腸發(fā)揮促動(dòng)力作用。

在家兔結(jié)腸中，LDCs 運(yùn)動(dòng)與強(qiáng)有力推進(jìn)性腔內(nèi)壓力波改變有關(guān)[3]，且自發(fā)性LDCs 較少。許多學(xué)者通過高清人結(jié)腸測壓研究發(fā)現(xiàn)，家兔運(yùn)動(dòng)模式與人結(jié)腸運(yùn)動(dòng)模式基本相似[6-8]。因此，筆者認(rèn)為家兔結(jié)腸LDCs 等同于人結(jié)腸HAPW，或稱為高振幅推進(jìn)性收縮（high amplitude propulsive contractions,HAPCs）[9-11]、高振幅推進(jìn)性序列[7]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)有力的LDCs常造成伴隨其他運(yùn)動(dòng)模式（除了微小波）減弱，甚至消失[2，4，12]。人結(jié)腸HAPW 運(yùn)動(dòng)亦引起其他正在進(jìn)行的運(yùn)動(dòng)模式，如同步壓力波、袋狀運(yùn)動(dòng)等被抑制，當(dāng)然這并不是絕對的[11]。這可能是因?yàn)椴皇撬羞\(yùn)動(dòng)模式可以共存，其使用的可能是部分相同的腸神經(jīng)元電路。在本實(shí)驗(yàn)條件下，比沙可啶可快速充滿近端結(jié)腸腸腔，然而運(yùn)動(dòng)模式卻起源于近端結(jié)腸，這可能是因?yàn)楸壬晨舌ぎa(chǎn)生LDCs 的信號傳導(dǎo)機(jī)制存在于整段近端結(jié)腸中。加入TTX 后，僅微小波未被阻斷，家兔結(jié)腸中的微小波活動(dòng)與在小鼠結(jié)腸非常相似，都具有很強(qiáng)的節(jié)律性，以及向口端和肛端傳播間切換的混亂方式，表明微小波通過黏膜下神經(jīng)叢相關(guān)的Cajal 間質(zhì)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)（the interstitial cells of Cajal associated with the submuscular plexus,ICC-SMP）起搏[13-15]。微小波存在多個(gè)起搏點(diǎn)，使慢波在2 個(gè)方向上傳播，但這并不是ICC-SMP 任意起搏活動(dòng)造成的結(jié)果，而是振蕩器輸出的自然表達(dá)，改變細(xì)胞與細(xì)胞的耦合程度，極大地改變方向[13-15]。

在目前實(shí)驗(yàn)條件下，比沙可啶作用下的LDCs 可被非選擇性神經(jīng)阻斷劑——TTX 抑制，但在人離體平滑肌條早期實(shí)驗(yàn)中，比沙可啶或其活性代謝產(chǎn)物4，4-（2-吡啶亞甲基）二苯酚醋酸酯引發(fā)的尖峰樣或張力性收縮不能被TTX 阻斷[16-17]，這可能是因?yàn)榧l實(shí)驗(yàn)條件下不能獨(dú)立分析各運(yùn)動(dòng)模式，如微小波的運(yùn)動(dòng)也會干預(yù)肌條收縮張力。通過預(yù)處理TTX，模擬結(jié)腸神經(jīng)受損，比沙可啶不再引發(fā)LDCs，表明腸神經(jīng)系統(tǒng)是其產(chǎn)生的必要條件之一。前期研究發(fā)現(xiàn)，肌間神經(jīng)叢相關(guān)性Cajal 間質(zhì)細(xì)胞（ICC associated with the myenteric plexus,ICC-MP）是大鼠結(jié)腸產(chǎn)生刺激依賴性的低頻率收縮的起搏器，另外ICC-MP 與小鼠[18-19]（0.3～2.0 次/min）和離體人結(jié)腸[20]（0.3～0.6 次/min）低頻收縮活性相關(guān)，擴(kuò)張和神經(jīng)活動(dòng)可能是其刺激源。近期有研究發(fā)現(xiàn)，比沙可啶可使慢性傳輸型便秘（chronic transit constipation,STC）患者的Cajal 間質(zhì)細(xì)胞數(shù)增加[21]，因此比沙可啶引發(fā)LDCs 可能與ICC-MP 有關(guān)。

BORRELLI 等[22]發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸腔內(nèi)給高劑量比沙可啶（40 mg）與低劑量比沙可啶（20 mg）相比，高劑量組可提高完整HAPCs 和平均HAPCs 的比例。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，0.15 和0.25 mg/ml 比沙可啶組引發(fā)LDCs 頻率高于0.05 mg/ml 比沙可啶組，因此適度高劑量比沙可啶可以提高STC 患者人結(jié)腸測壓的診斷率，但最合適的劑量及其安全性需進(jìn)一步研究。MITZNEGG 等[16]發(fā)現(xiàn)，比沙可啶引起結(jié)腸收縮需較長的潛伏期。本實(shí)驗(yàn)中，需持續(xù)腔內(nèi)灌注（27.33±4.76）min 比沙可啶才能引發(fā)LDCs，表明比沙可啶不是直接作用于結(jié)腸，而是通過分解為活性代謝產(chǎn)物發(fā)揮作用。

近幾年高分辨率人結(jié)腸測壓技術(shù)進(jìn)展迅速，讓大家更好地了解結(jié)腸動(dòng)力功能障礙性疾病的病理生理改變。GIORGIO 等[11]發(fā)現(xiàn)，慢性難治性便秘患者對比沙可啶和進(jìn)食的反應(yīng)減弱。CORSETTI 等[23]發(fā)現(xiàn),難治性便秘患者同時(shí)存在壓力波減少。CHEN 等[24]發(fā)現(xiàn)，在依賴瀉藥的慢性便秘患者中，多種運(yùn)動(dòng)模式對刺激的正常反應(yīng)性減弱，因此測試人結(jié)腸功能異常的一個(gè)挑戰(zhàn)是需要最佳的刺激參數(shù)來評估患者是否能正常反應(yīng)。通過觀察刺激的反應(yīng)性，預(yù)測結(jié)腸病理生理 改變。

總之，比沙可啶通過神經(jīng)源性機(jī)制引發(fā)家兔近端結(jié)腸LDCs，促進(jìn)結(jié)腸傳輸。當(dāng)規(guī)律的LDCs 發(fā)生時(shí)，同步發(fā)生的其他運(yùn)動(dòng)模式，如袋狀收縮和快速收縮運(yùn)動(dòng)被抑制；0.15 和0.25 mg/ml 比沙可啶引發(fā)的LDCs頻率高于0.05 mg/ml 比沙可啶。本實(shí)驗(yàn)在指導(dǎo)比沙可啶的臨床應(yīng)用方面具有重要價(jià)值。