彭文婷，王雯染，楊航宇，陳為凱，楊 哲，何 非，王 軍,*

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，葡萄與葡萄酒研究中心，北京 100083；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部葡萄酒加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083）

‘黑珍珠’（Pearl Noir，暫定名）是杜喜山在2008年于‘貝達(dá)’砧木園中發(fā)現(xiàn)的植物學(xué)性狀明顯區(qū)別于‘貝達(dá)’的葡萄新品系（代號(hào)為DXS-08），其親本信息未知。該品系早熟、抗病性強(qiáng)，其單品種葡萄酒顏色深。

釀酒葡萄果實(shí)的品質(zhì)（包括漿果質(zhì)量、體積、糖和酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)等）在很大程度上決定了葡萄酒的質(zhì)量。而酚類物質(zhì)與葡萄酒的色澤、澄清度、風(fēng)味直接相關(guān)，花色苷作為葡萄果實(shí)中普遍存在的類黃酮化合物之一，能夠?yàn)槠咸鸭捌咸丫铺峁┹p微的澀味，而且還能與一些香氣化合物相互作用?；ㄉ沼删哂蠧6-C3-C6骨架的類黃酮花色素和糖配體組成[1]，其中B環(huán)上R1和R2的取代基不同，則所形成的花色素不同，各類花色苷會(huì)呈現(xiàn)不同色調(diào)，這對(duì)葡萄和葡萄酒的顏色起到至關(guān)重要的作用[2]。比較常見的花色素有花葵素、花青素、花翠素、甲基花青素、甲基花翠素和二甲基花翠素。研究發(fā)現(xiàn)，歐亞種葡萄（Vitis vinifera）一般都只含有單糖苷化的花青素、花翠素、甲基花青素、甲基花翠素和二甲基花翠素的3-葡萄糖苷、3-乙酰化葡萄糖苷、3-p-香豆酰葡萄糖苷和3-p-咖啡酰化葡萄糖苷衍生物，其中二甲基花翠素類花色苷含量較高，一般不含有花葵素類花色苷[3]。葡萄果實(shí)作為葡萄酒香氣的重要來源之一，對(duì)葡萄酒的品種典型性和產(chǎn)地風(fēng)格起決定性作用。在葡萄果實(shí)中，香氣物質(zhì)以游離態(tài)和糖苷結(jié)合態(tài)兩種形式存在。游離態(tài)的香氣物質(zhì)能揮發(fā)從而被人感知，對(duì)構(gòu)成葡萄果實(shí)和葡萄酒香氣有重要的作用；而糖苷結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)是沒有氣味、不揮發(fā)的香氣前體物，但在葡萄酒的釀造過程中能經(jīng)過酶促或非酶促反應(yīng)將其變成相應(yīng)的游離態(tài)物質(zhì)進(jìn)而影響葡萄酒的香氣[4]。簡單序列重復(fù)（simple sequence repeats，SSR）由于具有含量豐富、多態(tài)性高、共顯性遺傳、技術(shù)操作簡單等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于葡萄品種的鑒定、親緣關(guān)系及起源分析和遺傳圖譜的構(gòu)建中。SSR廣泛分布于整個(gè)植物基因組內(nèi)，表現(xiàn)出豐富的多態(tài)性，且親緣關(guān)系越近，SSR片段長度差異越小，因此SSR標(biāo)記可應(yīng)用于親緣關(guān)系分析。

為了研究‘黑珍珠’葡萄果實(shí)的釀酒特性，探究其親本信息，本實(shí)驗(yàn)利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatographymass spectrometer，GC-MS）技術(shù)分析‘黑珍珠’葡萄果實(shí)的果皮花色苷和香氣化合物的組成及含量，并利用SSR標(biāo)記分析其遺傳信息，以期為‘黑珍珠’作為調(diào)色品種的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘黑珍珠’葡萄果實(shí)于2015年采自北京市大興區(qū)采育鎮(zhèn)‘喜山葡萄合作社’（39°39′ N、116°42′ E），葡萄園栽植密度為2.5 m×1.0 m，葉幕形為改良的垂直葉幕形[5]，南北行向，留梢量為12～15 支／延長米（行）。在葡萄采收期，隨機(jī)采集葡萄果穗的頂端、中間和底部的各2～3 粒漿果，每次重復(fù)采集300 粒漿果，重復(fù)3 次，裝入冰盒運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室的葡萄漿果液氮速凍后保存于-40 ℃冰箱中，用于理化指標(biāo)、花色苷和香氣化合物分析。采集5～10 片生長良好的幼葉裝入冰盒中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，液氮速凍后置于-80 ℃冰箱中保存，用于基因組DNA提取。同時(shí)，在中國農(nóng)業(yè)大學(xué)上莊實(shí)驗(yàn)站葡萄資源圃（40°08′ N、116°10′ E）采集‘貝達(dá)’、‘Kolor’和‘煙73’的幼葉5～10 片，作為參考品種，用于SSR指紋分析。

氫氧化鈉（分析純）、鄰苯二甲酸氫鉀（分析純）北京化工廠；酚酞 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；花色苷標(biāo)準(zhǔn)品、二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷 美國Sigma公司；乙腈、甲酸和甲醇（均為色譜純） 美國Thermo Fisher公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PAL-1手持糖度計(jì) 日本Atago公司；PB-10 pH計(jì)德國Sartorius公司；FD-1C-50冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；SHK-99-II臺(tái)式空氣恒溫?fù)u床 北京北方同正生物技術(shù)發(fā)展有限公司；GL-20G-Ⅱ離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；1100系列配有二極管陣列檢測(cè)器的LC/MSD Trap-VL HPLC-離子阱MS儀、1200系列LC/MSD Trap-VL HPLC-三重四極桿MS儀、6890 GC儀、5975 MS儀 美國Agilent公司；Prime G02聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymeras chain reaction，PCR）儀 英國Bibby Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 ‘黑珍珠’植物學(xué)性狀和果實(shí)性狀觀測(cè)

根據(jù)國際葡萄與葡萄酒組織（International Organisation of Vine and Wine，OIV）標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)新梢、幼葉、成齡葉和果實(shí)的部分性狀進(jìn)行描述[6-7]。取10 片成齡葉分別測(cè)量主脈長（即葉長）、葉寬、葉緣鋸齒長、葉緣鋸齒寬和葉柄長，并計(jì)算成齡葉的長寬比和鋸齒的長寬比。隨機(jī)取10 個(gè)果穗，分別稱量其質(zhì)量并計(jì)算果穗平均質(zhì)量。取100 粒漿果稱質(zhì)量，解凍24 h后破碎取汁，取上清液用于pH值、可溶性固形物含量以及可滴定酸質(zhì)量濃度的測(cè)定。pH值用pH計(jì)測(cè)定，果汁可溶性固形物含量用手持糖度儀測(cè)定[8]，果汁可滴定酸質(zhì)量濃度用NaOH滴定法測(cè)定[9]，并以每升葡萄酒中酒石酸質(zhì)量計(jì)。

1.3.2 ‘黑珍珠’葡萄果皮花色苷提取和測(cè)定

花色苷提取參照He Jianjun等[10]的方法，準(zhǔn)確稱取0.499 5～0.500 5 g冷凍干燥后的葡萄果皮粉，加入含體積分?jǐn)?shù)2%甲酸的甲醇溶液10 mL，溶液在室溫下避光超聲10 min，在搖床萃取30 min（25 ℃下140 r/min避光）后，4 ℃下8 000 r/min離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至100 mL圓底燒瓶中，以上步驟重復(fù)提取5 次后，合并上清液至燒瓶中。上清液于25 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用花色苷定容劑（體積分?jǐn)?shù)2%（后同）甲酸、10.8%乙腈水溶液）定容至10 mL后，0.22 μm水系膜過濾，用于HPLC-MS檢測(cè)，每個(gè)樣品重復(fù)提取2 次?；ㄉ蘸扛鶕?jù)二甲花翠素標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行半定量，表示為mg/kg mf。

HPLC-MS條件：使用帶有二極管陣列檢測(cè)器的1100 LC/MSD Trap-VL HPLC-離子阱MS，色譜柱為Kromasil 100-5-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫為50 ℃，進(jìn)樣量為30 μL，檢測(cè)波長為525 nm，流速為1 mL/min。流動(dòng)相A：V（水）∶V（甲酸）∶V（乙腈）=92∶2∶6；流動(dòng)相B：V（水）∶V（甲酸）∶V（乙腈）=44∶2∶54。洗脫程序：0～1 min，0～10% B；1～18 min，10%～25% B；18～20 min，25% B；20～30 min，25%～40% B；30～35 min，40%～70% B；35～40 min，70%～100% B。離子阱MS檢測(cè)器的采集參數(shù)為電噴霧離子源，正離子模式，離子掃描范圍為m/z 100～1 500，霧化器壓力為207 kPa，干燥氣流速為10 L/min，干燥氣溫度為325 ℃。

1.3.3 ‘黑珍珠’葡萄香氣化合物的提取和測(cè)定

取保存于低溫（-40 ℃）冰箱的葡萄果實(shí)50 g，去除果柄和種子，依次加入抑制內(nèi)源糖苷酶活性的0.5 g D-葡萄糖酸內(nèi)酯和1 g交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮（防止氧化），并且破碎至粉末狀；在4 ℃條件下靜置浸漬 4 h；在4 ℃、12 000 r/min條件下離心10 min，并且收集上層澄清葡萄汁，參照Lan Yibin等[11]的頂空固相微萃取（head space-solid phase microextraction，HS-SPME）條件萃取游離態(tài)香氣物質(zhì)。

結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)的提取參照Lan Yibin等[11]的方法：在活化后的SPME柱中加入2 mL葡萄汁，然后依次加入2 mL能夠去除低分子質(zhì)量糖、酸等極性化合物的水和5 mL去除游離態(tài)非極性香味化合物的二氯甲烷，最后糖苷態(tài)香氣物質(zhì)用20 mL甲醇溶液洗脫。收集洗脫后的甲醇溶液，在30 ℃真空條件下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，使用含0.1 g糖苷酶AR2000 的檸檬酸/磷酸氫二鉀緩沖液（0.2 mol/L、pH 5）10 mL重新溶解，隨后轉(zhuǎn)移至密閉離心管，37 ℃恒溫酶解16 h，每個(gè)樣品重復(fù)提取2 次。釋放的結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)經(jīng)HS-SPME后進(jìn)樣至GC-MS檢測(cè)。

HS-SPME條件：CTC CombiPAL自動(dòng)進(jìn)樣器自動(dòng)萃取樣品中香氣化合物，自動(dòng)進(jìn)樣器配備2 cm聚二甲基硅氧烷/碳篩/二乙烯苯萃取頭，萃取頭使用前先在250 ℃條件下活化60 min。稱取1.0 g NaCl放入15 mL進(jìn)樣小瓶，加入5 mL葡萄汁或糖苷水解液和10 μL作為內(nèi)標(biāo)的4-甲基-2-戊醇（1.038 8 g/L），迅速將進(jìn)樣小瓶用帶有聚四氟乙烯隔墊的蓋子密封。樣品瓶在加熱攪拌設(shè)備中在40 ℃條件下加熱攪拌30 min，然后將萃取頭插入樣品瓶頂空部分，40 ℃繼續(xù)加熱攪拌30 min，加熱攪拌設(shè)備的轉(zhuǎn)速為500 r/min。萃取頭在GC進(jìn)樣口（250 ℃）解吸8 min完成進(jìn)樣。

GC-MS條件參考Wu Yuwen等[12]的方法。香氣化合物定性采用自動(dòng)解卷積技術(shù)對(duì)GC-MS全掃描數(shù)據(jù)文件進(jìn)行解卷積分析，根據(jù)各物質(zhì)的保留時(shí)間以及C7～C24正構(gòu)烷烴在相同GC條件下的保留時(shí)間計(jì)算其相應(yīng)的保留指數(shù)，與標(biāo)準(zhǔn)品保留指數(shù)、MS譜圖以及NIST Chemical WebBook中收錄的極性柱條件下所測(cè)保留指數(shù)比較，差值絕對(duì)值小于50的組分可定性為該化合物。定量方法參考Wu Yuwen等[12]的方法，利用標(biāo)準(zhǔn)品香氣物質(zhì)在模擬葡萄汁溶液中的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)已有標(biāo)準(zhǔn)品的物質(zhì)定量；利用化學(xué)結(jié)構(gòu)和官能團(tuán)相似、碳原子數(shù)相近的標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)沒有標(biāo)準(zhǔn)品的物質(zhì)進(jìn)行半定量。樣品及標(biāo)準(zhǔn)曲線均通過相同濃度的4-甲基-2-戊醇作為內(nèi)標(biāo)對(duì)儀器的響應(yīng)狀態(tài)進(jìn)行校正。香氣物質(zhì)的含量表示為μg/kg mf。

1.3.4 ‘黑珍珠’SSR指紋分析

葡萄葉片樣品基因組DNA提取采用王軍等[13]改良的十六烷基三甲基溴化銨法。選用6 對(duì)（VVS2、VVMD5、VVMD7、VVMD27、Vrzag62、Vrzag79）葡萄種植資源數(shù)據(jù)庫（http：//www.vitis-vea.de/）提供的引物用于SSR擴(kuò)增，引物序列見表1。PCR體系為20 μL，包括2 μL 10×PCR buffer、1 U Taq酶、0.2 mmol/L dNTP、1.5 mmol/L Mg2＋、0.4 μmol/L引物、DNA模板50 ng，其余為dd H2O。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，50～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。相同模板重復(fù)擴(kuò)增兩次，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。擴(kuò)增后產(chǎn)物送至蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行毛細(xì)管電泳，利用Genemapper V3.2軟件進(jìn)行條帶分析，確定每個(gè)位點(diǎn)的片段長度。

表1 6 對(duì)SSR引物序列、退火溫度和目標(biāo)片段長度Table 1 Six pairs of SSR primer sequence, annealing temperature and target size

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果測(cè)定3 次，使用Excel 2010、SPSS 19.0和Origin 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘黑珍珠’的植物形態(tài)學(xué)與果實(shí)性狀

‘黑珍珠’嫩梢為淺綠色，稍尖絨毛著色極淺，幼葉為綠色，上表皮顏色為淺紅棕色（圖1）。成齡葉為綠色，近五角形，全緣。葉表面有光澤，微具泡狀突起，葉背光滑無絨毛。主脈無花青素著色。葉緣鋸齒雙側(cè)直，葉柄洼半開張，呈V形。葉長11.23 cm、寬13.58 cm、長寬比0.83。鋸齒長1.25 cm、寬1.73 cm、長寬比為0.72、葉柄長5.67 cm?！谡渲椤肷纤袧{果成熟度相對(duì)一致，果穗緊、呈圓錐形、有歧肩，每新稍果穗數(shù)為1.73。漿果呈圓形，果皮為紫黑色（圖1）。植株形態(tài)學(xué)和果實(shí)性狀描述如表2所示。

圖1 ‘黑珍珠’葡萄嫩稍、典型果穗和成熟葉片F(xiàn)ig. 1 Shoot, typical cluster and ripening leaves of ‘Pearl Noir’ grapes

表2 ‘黑珍珠’植株形態(tài)學(xué)和果實(shí)性狀描述Table 2 Descriptive morphological and biological traits of‘Pearl Noir’ grapes

2.2 ‘黑珍珠’的果實(shí)品質(zhì)分析

釀酒葡萄理化指標(biāo)是決定葡萄酒品質(zhì)的關(guān)鍵因素[14]，其最適的可溶性固形物含量因酒類型的要求而異，一般為20～25 °Brix[15]。pH值是與酸密切相關(guān)的一個(gè)指標(biāo)，成熟期適宜的葡萄其果汁pH值應(yīng)在3.00～3.60之間[15]?？傻味ㄋ豳|(zhì)量濃度能夠反映溶液中H＋的總量，其在6.5～8.5 g/L被認(rèn)為是生產(chǎn)協(xié)調(diào)性好的葡萄酒的最佳質(zhì)量濃度[16]?！谡渲椤咸阎奶撬岜葹?0.10±0.11，葡萄品質(zhì)較好?！谡渲椤咸阎目扇苄怨绦挝锖俊H值均在適宜的釀酒葡萄理化指標(biāo)要求范圍內(nèi)，而可滴定酸質(zhì)量濃度偏高（表3）。其單品種酒顏色深，同時(shí)期顏色明顯優(yōu)于‘美樂’與‘赤霞珠’等釀造的葡萄酒，適合用于顏色較淺葡萄酒的調(diào)色[17-18]。

表3 ‘黑珍珠’葡萄果實(shí)理化指標(biāo)Table 3 Physiochemical parameters of ‘Pearl Noir’ grapes

2.3 ‘黑珍珠’葡萄果皮中花色苷組成分析

花色苷組成及其含量是評(píng)價(jià)葡萄品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)[1]，而且‘黑珍珠’葡萄果皮顏色較深，花色苷含量較高。在‘黑珍珠’葡萄果皮中共檢測(cè)到14 種花色苷（表4），其中花色素雙葡萄糖苷9 種，分別是二甲花翠素-3,5-雙葡萄糖苷、甲基花翠素-3,5-雙葡萄糖苷、花翠素-3,5-雙葡萄糖苷、花翠素-3-乙?；咸烟擒?5-葡萄糖苷、甲基花青素-3,5-雙葡萄糖苷、花翠素-3-香豆?；咸烟擒?5-葡萄糖苷、二甲花翠素-3-乙?；咸烟擒?5-葡萄糖苷、二甲花翠素-3-香豆酰化葡萄糖苷-5-葡萄糖苷、甲基花翠素-3-香豆?；咸烟擒?5-葡萄糖苷。這9 種花色素雙葡萄糖苷的含量依次降低。‘黑珍珠’葡萄果皮中檢測(cè)到5 種花色素單葡萄糖苷，分別是花翠素-3-香豆?；咸烟擒?、甲基花翠素-3-葡萄糖苷、二甲花翠素-3-葡萄糖苷、二甲花翠素-3-香豆酰化葡萄糖苷、甲基花翠素-3-香豆酰化葡萄糖苷。‘黑珍珠’葡萄果皮中的14 種花色苷按化學(xué)結(jié)構(gòu)可以分為二甲花翠素衍生物（5 種）、花翠素衍生物（3 種）、甲基花翠素衍生物（5 種）、甲基花青素衍生物（1 種），其中不含有花青素衍生物?！谡渲椤咸训幕ㄉ找远谆ù渌匮苌锏暮孔罡撸蓟ㄉ湛偭康?2.7%，其中以二甲花翠素-3,5-雙葡萄糖苷的含量最高，其次是甲基花翠素-3-葡萄糖苷。花翠素、甲基花翠素和甲基花青素分別占花色苷總量的17.7%、25.9%、3.6%（圖2），而甲基花青素衍生物只以雙葡萄糖苷形式存在。

表4 ‘黑珍珠’葡萄果皮花色苷組成和含量Table 4 Profile and content of anthocyanins in the skin of‘Pearl Noir’ grapes

研究表明，單糖苷化的花青素、花翠素、甲基花翠素、甲基花青素和二甲花翠素的3-葡萄糖苷衍生物是歐亞種葡萄（Vitis vinifera）常見的花色苷種類[19-24]，花色苷的主要成分是二甲花翠素-3-葡萄糖苷。而含有花色素雙糖苷是非歐亞種葡萄的重要特征，有報(bào)道稱非歐亞種葡萄花色苷的主要成分是二甲花翠素-3,5-雙葡萄糖苷[25]。典型的非歐亞種葡萄如中國野生葡萄種均含有花色素雙糖苷[26]，圓葉葡萄（Vitis rotundifolia）既含有花色素單葡萄糖苷也含有雙葡萄糖苷，但其種類和含量均較花色素雙葡萄糖苷少，少數(shù)圓葉葡萄可能不含有單葡萄糖苷[27]。在本研究中，‘黑珍珠’葡萄果皮的花色苷組成均是非歐亞種葡萄中常見的花色苷，主要以雙糖苷為主。此外，‘黑珍珠’葡萄果皮花色苷含量明顯高于‘赤霞珠’（526.93 mg/kg mf）和‘美樂’（277.33 mg/kg mf）等歐亞種葡萄[28]。因此，推測(cè)‘黑珍珠’葡萄含有非歐亞種葡萄的血緣。‘黑珍珠’花色苷含量高，但與‘煙73’和‘紫北塞’等染色葡萄不同[10,29-30]，‘黑珍珠’主要以雙糖苷為主，而‘煙73’和‘紫北塞’的花色苷主要為單糖苷，僅存在一種雙糖苷，故而‘黑珍珠’可能不是染色葡萄。

圖2 各類花色苷組成比例Fig. 2 Percentages of different types of anthocyanins

2.4 ‘黑珍珠’葡萄果實(shí)中香氣成分分析

‘黑珍珠’葡萄果實(shí)中共檢測(cè)到123 種香氣化合物，這些香氣化合物根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為C6/C9類（13 種）、醇類（40 種）、羰基化合物（16 種）、酸類（3 種）、揮發(fā)酚類（5 種）、酯類（5 種）、降異戊二烯類（12 種）、苯類（14 種）、萜烯（13 種）（表5）。

表5 ‘黑珍珠’葡萄果實(shí)中香氣物質(zhì)組成及含量Table 5 Volatile aroma composition of ‘Pearl Noir’ grapes

續(xù)表5

續(xù)表5

揮發(fā)性香氣成分在葡萄風(fēng)味物質(zhì)中有舉足輕重的地位，種類繁多。這些成分的種類、含量、感覺閾值及相互作用決定著葡萄的風(fēng)味，同時(shí)也決定著所釀葡萄酒的風(fēng)味和典型性。‘黑珍珠’葡萄果實(shí)中共檢測(cè)到93 種游離態(tài)揮發(fā)性香氣化合物，其中C6/C9類是第一大類游離態(tài)香氣化合物，占游離態(tài)揮發(fā)性香氣物質(zhì)總量的66.85%，其中己醛、(E)-2-己烯醛的含量較高，這兩種化合物決定了‘黑珍珠’葡萄果實(shí)游離態(tài)C6/C9類香氣物質(zhì)的含量，也對(duì)‘黑珍珠’葡萄果實(shí)總游離態(tài)揮發(fā)性香氣化合物起決定的作用。C6/C9類化合物能夠提供青草香，對(duì)酒的香氣有重要的作用。醇類是第二大類游離態(tài)香氣化合物，占總游離態(tài)揮發(fā)性香氣化合物的15.95%，其中苯乙醇、苯甲醇的含量較高，而酯類、酸類、揮發(fā)酚類以及其他含量低，所占比例在0.049 7%～4.07%之間。

‘黑珍珠’葡萄果實(shí)中共檢測(cè)到81 種結(jié)合態(tài)揮發(fā)性香氣化合物，醇類是最主要的結(jié)合態(tài)香氣化合物，占總結(jié)合態(tài)揮發(fā)性香氣化合物的38.44%，其中苯乙醇、苯甲醇、1-苯乙醇的含量較高，占結(jié)合態(tài)醇類香氣化合物的68.09%，并且醇類的結(jié)合態(tài)香氣化合物多達(dá)34 種。羰基化合物是第二大類結(jié)合態(tài)揮發(fā)性化合物，其中3,4-二甲基-苯甲醛、癸醛的含量占羰基化合物的81.75%，而酯類、萜烯的含量低，所占比例在0.49%～0.70%之間。

由此可以看出，己醛和(E)-2-己烯醛在游離態(tài)的香氣物質(zhì)中含量較高，決定了‘黑珍珠’葡萄青草味濃重，苯甲醇、苯乙醇含量也為葡萄果實(shí)提供了花香的氣味。結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)中，苯乙醇和己烯醛含量較高，也賦予葡萄花香和青草味。

2.5 ‘黑珍珠’的SSR指紋分析

表6 6 對(duì)SSR引物對(duì)‘貝達(dá)’、‘煙73’、‘Kolor’和‘黑珍珠’的擴(kuò)增結(jié)果Table 6 Amplification results of ‘Beta’, ‘Yan 73’, ‘Kolor’ and‘Pearl Noir’ with 6 different pairs of SSR primers

檢索發(fā)現(xiàn)，未知親本信息的葡萄新品系‘黑珍珠’的SSR指紋不存在于葡萄標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫中（http：//www.vitisvea.de/）。比較SSR指紋發(fā)現(xiàn)，‘黑珍珠’和‘貝達(dá)’在引物VVS2、VVMD7和Vrzag79各有一個(gè)等位基因相同，‘黑珍珠’與‘煙73’在引物VVS2和Vrzag79各有一個(gè)等位基因相同，‘黑珍珠’與‘Kolor’在引物VVMD7有一個(gè)等位基因相同（表6）。雜交后代在每個(gè)SSR位點(diǎn)的兩個(gè)等位基因一個(gè)來自父本，而另一個(gè)來自母本[31-34]。因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)用于SSR標(biāo)記的葡萄品種較少，根據(jù)6 對(duì)SSR引物的擴(kuò)增的結(jié)果尚不能確定‘黑珍珠’的親本信息，其親本信息有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié) 論

有研究表明，葡萄花色苷的組成及比例受到許多因素的影響，而遺傳因素是影響葡萄品種花色苷組成的決定性因素，特定的品種花色苷組成穩(wěn)定，決定其品種的顏色[35]，而有無花色素雙糖苷是區(qū)別歐亞種葡萄與其他種葡萄的重要特征[36]。‘黑珍珠’葡萄果皮紫黑色，花色苷含量豐富，且以雙葡萄糖苷為主，占花色苷總量的71.2%，推測(cè)其含有非歐亞種葡萄的血緣?！谡渲椤咸严銡饣衔锝M成復(fù)雜，這些香氣化合物以游離態(tài)與糖苷結(jié)合態(tài)形式存在，共檢測(cè)到123 種揮發(fā)性香氣化合物，主要以游離態(tài)為主。由于供試品種較少，本研究并未找到其親本。因?yàn)椤谡渲椤咸压せㄉ盏姆N類與含量豐富，且單品種酒顏色深，未來可以作為釀造具有地區(qū)特色的紅葡萄酒的新品種或調(diào)色新品種。