王 亮，陳 勇，郭衍銀*，員麗蘋(píng)，劉莎莎，張玉笑，張新華

（山東理工大學(xué)農(nóng)業(yè)工程與食品科學(xué)學(xué)院，山東 淄博 255049）

西蘭花因其低熱量、高膳食纖維及豐富的抗氧化物質(zhì)，深受消費(fèi)者喜愛(ài)[1]。然而，西蘭花屬典型的呼吸躍變型蔬菜，采后代謝十分旺盛，極不耐藏，常溫下2～3 d即發(fā)生褪綠、花蕾開(kāi)放及黃化，導(dǎo)致花球營(yíng)養(yǎng)成分含量急劇下降，同時(shí)，西蘭花組織鮮嫩多汁，花球部分基本無(wú)保護(hù)層，這使得西蘭花在貯藏過(guò)程中極易失水萎蔫、耐貯性差，嚴(yán)重影響其使用價(jià)值和市場(chǎng)價(jià)值[2]。為此，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)西蘭花保鮮做了大量研究，如郭香鳳等[3]研究表明低溫冷藏（4 ℃）可顯著抑制西蘭花凈菜組織的褪綠黃化和褐變，減緩組織中蛋白質(zhì)、抗壞血酸及可溶性固形物等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量的下降，較好地保持細(xì)胞膜的完整性，有效地抑制西蘭花組織的衰老和品質(zhì)劣變。Xu Chaojiong等[4]研究發(fā)現(xiàn)5 ℃、體積分?jǐn)?shù)21% O2＋10% CO2氣調(diào)有利于西蘭花保持較高的蘿卜硫苷和醌還原酶活性，維持西蘭花感官品質(zhì)。Ma Gang等[5]研究表明5 μL/L 1-甲基環(huán)丙烯處理可延緩西蘭花黃化并且抑制乙烯的產(chǎn)生，從而有效延緩西蘭花的衰老。Alvarez等[6]研究發(fā)現(xiàn)對(duì)西蘭花殼聚糖涂膜可有效抑制微生物的繁殖，達(dá)到較好的保鮮效果。本課題組前期研究表明，相較于一般氣調(diào)，O2/CO2氣調(diào)表現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[7-8]，西蘭花在0、10、20 ℃條件下分別保鮮49、31、14 d，保鮮期均比同溫度下的其他氣調(diào)處理組長(zhǎng)[9]，但具體機(jī)理特別是O2/CO2氣調(diào)對(duì)西蘭花能量代謝的影響尚缺乏深入探討。ATP作為細(xì)胞的能量貨幣，是細(xì)胞功能代謝和生存能力的主要決定因素。研究表明，采后果蔬的衰老與果蔬體內(nèi)能量狀況有關(guān)[10]。如較高的能量水平可維持南果梨細(xì)胞膜穩(wěn)定性、減少衰老過(guò)程中冷害和褐變的產(chǎn)生[11]；桃果實(shí)組織的能量狀態(tài)在維持細(xì)胞膜的完整性中起重要作用[12]；荔枝果皮褐變與ATP水平較高和電導(dǎo)率較低有關(guān)[13]。

為此，本實(shí)驗(yàn)以西蘭花為材料，研究不同比例O2/CO2氣調(diào)對(duì)西蘭花能量、關(guān)鍵酶活力及品質(zhì)指標(biāo)的影響，探討O2/CO2氣調(diào)環(huán)境下西蘭花能量代謝和保鮮品質(zhì)的關(guān)系，以期從能量代謝角度闡明O2/CO2氣調(diào)對(duì)西蘭花的保鮮機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試的西蘭花采自山東省壽光市劉家茅坨村，采收后立即運(yùn)到山東理工大學(xué)農(nóng)業(yè)工程與食品科學(xué)學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏實(shí)驗(yàn)室冷庫(kù)內(nèi)，3 ℃預(yù)冷12 h后，選取花球直徑13～15 cm、花球緊密、色澤相似、沒(méi)有病蟲(chóng)害和機(jī)械傷的西蘭花進(jìn)行氣調(diào)處理。

2,4-二硝基苯肼 上海展云化工試劑有限公司；偏磷酸、冰醋酸、氯化鎂 天津致遠(yuǎn)化學(xué)藥劑有限公司；濃硫酸、琥珀酸鈉 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；2,6-二氯酚靛鈉、甲硫酚嗪、還原型細(xì)胞色素c、丙酮酸鈉、二硫蘇糖醇、三磷酸腺苷 上海索萊寶生物科技有限公司；高氯酸 上海桃浦化工廠；甲醇（色譜純）煙臺(tái)市雙雙化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1750型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津國(guó)際貿(mào)易有限公司；600e型高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀（配有紫外檢測(cè)器）美國(guó)Waters公司；HP-2132便攜式色差儀 深圳漢譜光彩科技有限公司；PHS-25型pH計(jì) 上海存聯(lián)工貿(mào)有限公司；DW-FW351型低溫冰箱 中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司；DHG-9070A型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；AL-1D4型精密分析天平 德國(guó)梅特勒-托利多儀器有限公司；GL-20G-2型臺(tái)式多功能高速冷凍離心機(jī) 上海安亭儀器制造廠。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

將預(yù)冷后的西蘭花分為4 組，每組30 個(gè)。將4 組西蘭花分別放入氣調(diào)箱中，并放入（10.0±0.5）℃冷庫(kù)中，然后分別通入不同比例的O2、CO2，4 組氣體的比例（均以體積分?jǐn)?shù)計(jì)）分別為：20% O2＋80% CO2、50% O2＋50% CO2、80% O2＋20% CO2和自然空氣（CK）。具體通氣操作參照郭衍銀等[8]的方法進(jìn)行。每個(gè)處理組3 次重復(fù)，即每個(gè)氣調(diào)箱放10 個(gè)西蘭花。貯藏過(guò)程中，每4 d取樣1 次，進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)的測(cè)定，當(dāng)西蘭花30%出現(xiàn)黃化或腐爛或異味時(shí)，即終止貯藏[14]。

1.3.2 指標(biāo)測(cè)定

1.3.2.1 pH值的測(cè)定

pH值采用pH計(jì)法[15]測(cè)定。

1.3.2.2 琥珀酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶、細(xì)胞色素c氧化酶活力的測(cè)定

琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH）活力參照Ackrell等[16]的方法，通過(guò)分光光度法測(cè)定；丙酮酸脫氫酶（pyruvate dehydrogenase，PDH活力參照Nemeria等[17]的方法測(cè)定；細(xì)胞色素c氧化酶（cytochrome c oxidase，CCO）活力參照熊杰等[18]的方法測(cè)定。

1.3.2.3 能荷的測(cè)定

ATP、二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）和單磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）含量參照Z(yǔ)hou Qian等[19]的方法測(cè)定。樣品先用10 mL 0.6 mol/L高氯酸在冰浴中提取，采用HPLC儀測(cè)定ATP、ADP和AMP的含量。色譜柱為ODS柱（250 mm×4.60 mm，5 μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。流動(dòng)相A為由0.06 mol/L磷酸氫二鉀和0.04 mol/L磷酸二氫鉀配成的磷酸鹽緩沖液（pH 7.0），流動(dòng)相B為100%甲醇（色譜純），洗脫程序?yàn)椋?～7 min，100%（體積分?jǐn)?shù)，下同）流動(dòng)相A；7～9 min，80%流動(dòng)相A；9 ～10 min，75%流動(dòng)相A；10 min，100%流動(dòng)相A。流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為20 μL。重復(fù)3 次，結(jié)果以鮮質(zhì)量計(jì)。能荷按照下式進(jìn)行計(jì)算。

式中：ATP、ADP及AMP分別表示各自的含量/（μg/g）。

1.3.2.4 VC含量的測(cè)定

VC含量采用2,4-二硝基苯肼法比色法[20]測(cè)定，結(jié)果以鮮質(zhì)量計(jì)。

1.3.2.5 色調(diào)的測(cè)定

西蘭花色調(diào)的測(cè)定參考Li Dong等[21]的方法，使用便攜式色差計(jì)測(cè)定a、b值。當(dāng)a＞0且b＞0時(shí)，H=tan-1（b/a）；當(dāng)a＜0且b＞0時(shí)，H=180°＋tan-1（b/a）。

1.3.2.6 水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用干燥法進(jìn)行測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所得數(shù)據(jù)使用SPSS 13.0軟件進(jìn)行最小顯著性差異法分析及Pearson法進(jìn)行相關(guān)性分析，P＜0.05表示差異顯著；采用Excel軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 O2/CO2氣調(diào)對(duì)西蘭花貯藏過(guò)程中pH值的影響

圖1 O2/CO2氣調(diào)對(duì)西蘭花貯藏過(guò)程中pH值的影響Fig. 1 Effect of O2/CO2 controlled atmospheres on pH of broccoli during storage

細(xì)胞內(nèi)pH值是影響細(xì)胞生理代謝的重要因素[22]。如圖1所示，CK組在貯藏期間pH值基本維持平穩(wěn)狀態(tài)，但不同O2/CO2氣調(diào)處理的西蘭花pH值呈現(xiàn)出不同的變化趨勢(shì)。80% O2＋20% CO2處理組的pH值在貯藏期間整體低于CK組，但也基本處于穩(wěn)定水平；隨著CO2比例的升高，西蘭花pH值呈現(xiàn)逐漸降低趨勢(shì)，如80% O2＋20% CO2、50% O2＋50% CO2和20% O2＋80% CO2處理組的西蘭花在整個(gè)貯藏期間平均pH值分別為6.54、6.19和6.04，分別比CK組（6.62）低1.21%、6.50%和8.76%。

2.2 O2/CO2氣調(diào)對(duì)西蘭花貯藏過(guò)程中PDH、SDH和CCO活力的影響

圖2 O2/CO2氣調(diào)對(duì)西蘭花貯藏過(guò)程中PDH（A）、SDH（B）及CCO（C）活力的影響Fig. 2 Effect of O2/CO2 controlled atmospheres on PDH (A), SDH (B)and CCO (C) activities of broccoli during storage

PDH是呼吸代謝過(guò)程中丙酮酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶，是催化丙酮酸氧化脫羧的重要酶之一，在新陳代謝調(diào)節(jié)中起著極其重要的作用[23]。由圖2A可知，各組PDH活力在貯藏過(guò)程中均呈先上升后下降的趨勢(shì)，但其峰值出現(xiàn)的時(shí)間不同，CK組和80% O2＋20% CO2、50% O2＋50% CO2、20% O2＋80% CO2處理組的PDH活力峰值分別出現(xiàn)在第8、12、16、12天，說(shuō)明適宜的O2/CO2氣調(diào)處理能延緩PDH活力峰值的出現(xiàn)。同時(shí)，8 d之后各組PDH活力在相同貯藏時(shí)間時(shí)均存在顯著差異（P＜0.05），整個(gè)貯藏期間CK、20% O2＋80% CO2、50% O2＋50% CO2和80% O2＋20% CO24 個(gè)處理組PDH活力平均值分別為15.70、8.38、16.90、15.89 U/（g·min）。

SDH是三羧酸循環(huán)中一種重要的酶，其催化琥珀酸脫氫轉(zhuǎn)化成延胡索酸，促使黃素腺嘌呤二核苷酸接受脫下的H＋，最終氧化黃素腺嘌呤二核苷酸遞氫體產(chǎn)生ATP，為生命活動(dòng)提供能量。CCO是呼吸鏈的末端酶，能夠?qū)㈦娮觽鬟f給O2，與能量的產(chǎn)生密切相關(guān)[23]。由圖2B、C可知，各組西蘭花在貯藏過(guò)程中SDH、CCO活力變化趨勢(shì)相似，均是先上升后降低，只是兩者活力峰值出現(xiàn)的時(shí)間稍有差異，SDH活力的峰值主要出現(xiàn)在第12天，而CCO則主要出現(xiàn)在第8天。就貯藏期間SDH和CCO活力的平均值而言，20% O2＋80% CO2處理組最低，分別為0.015、1.4 U/（g·min），低于CK組（分別為0.016、1.7 U/（g·min））；50% O2＋50% CO2處理組最高，分別為0.018、1.9 U/（g·min），分別比CK組高12.5%和11.76%。

對(duì)于PDH、SDH和CCO活力，80% O2＋20% CO2處理組在貯藏前期均高于50% O2＋50% CO2處理組，但貯藏后期則顯著低于50% O2＋50% CO2處理組（P＜0.05），表明高比例O2雖可促進(jìn)西蘭花貯藏前期PDH、SDH和CCO活力升高，但缺乏持續(xù)性和穩(wěn)定性，造成貯藏后期酶活力迅速下降。

2.3 O2/CO2氣調(diào)對(duì)西蘭花貯藏過(guò)程中能荷的影響

圖3 O2/CO2氣調(diào)對(duì)西蘭花貯藏過(guò)程中能荷的影響Fig. 3 Effect of O2/CO2 controlled atmospheres on energy charge of broccoli during storage

植物體內(nèi)的能荷大小可反映其體內(nèi)的能量水平和產(chǎn)生狀況[24]。如圖3所示，各組西蘭花體內(nèi)能荷在貯藏過(guò)程中均呈下降趨勢(shì)，其中CK組與20% O2＋80% CO2處理組能荷下降最為迅速，16 d內(nèi)分別下降了56.08%與46.57%。相比而言，50% O2＋50% CO2與80% O2＋20% CO2處理組的西蘭花能荷下降較為緩慢，16 d內(nèi)下降了19.32%和30.68%，這兩組的能荷在0～12 d下降緩慢，從0 d時(shí)的0.81分別下降到0.73和0.75，僅分別下降了9.9%和7.4%，之后（12～28 d）能荷迅速下降，分別下降了53.34%和63.90%。

2.4 O2/CO2氣調(diào)對(duì)西蘭花貯藏過(guò)程中VC含量的影響及與能荷的相關(guān)性分析

圖4 O2/CO2氣調(diào)對(duì)西蘭花貯藏過(guò)程中VC含量的影響Fig. 4 Effect of modified O2/CO2 controlled atmospheres on ascorbic acid content of broccoli during storage

西蘭花體內(nèi)VC含量的高低可作為評(píng)價(jià)其貯藏品質(zhì)的有效指標(biāo)[25]。如圖4所示，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，各組西蘭花VC含量均呈下降趨勢(shì)，但下降速率不同。其中，CK組VC含量呈線性下降趨勢(shì)，16 d內(nèi)下降了72.7%；50%O2＋50% CO2和80% O2＋20% CO2處理組在貯藏前期下降較慢，0～16 d時(shí)分別下降了23.5%和28.9%，16～28 d時(shí)則分別下降了39.9%和42.8%。

表1 西蘭花VC含量與能荷的相關(guān)性分析（以貯藏16 d內(nèi)的數(shù)據(jù)計(jì)算）Table 1 Correlation analysis of ascorbic acid and energy charge in broccoli (according to data over a 16 d storage period)

相關(guān)性分析表明，貯藏期間各處理組VC含量與能荷之間存在明顯的正相關(guān)性（表1），除80% O2＋20% CO2處理組的相關(guān)系數(shù)為0.732外，其余處理組的相關(guān)系數(shù)范圍為0.96～0.98，表明貯藏期間西蘭花能荷水平與VC含量密切相關(guān)。

2.5 O2/CO2氣調(diào)對(duì)西蘭花貯藏過(guò)程中色調(diào)的影響及與能荷的相關(guān)性分析

H值由高到低的變化反映了西蘭花逐漸黃化的過(guò)程[26]。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，各處理的H值均呈下降趨勢(shì)（圖5），其中CK組下降最快，16 d內(nèi)下降了20.87%。氣調(diào)處理減緩了西蘭花H值的降低，20% O2＋80% CO2、50% O2＋50% CO2和80% O2＋20% CO2處理組在16 d內(nèi)分別下降了12.11%、11.05%和12.54%，表明合適的CO2比例對(duì)葉綠素降解具有很好的抑制作用。

圖5 O2/CO2氣調(diào)對(duì)西蘭花色調(diào)的影響Fig. 5 Effect of O2/CO2 controlled atmospheres on H value of broccoliduring storage

表2 西蘭花色調(diào)與能荷的相關(guān)性分析（以貯藏16 d內(nèi)的數(shù)據(jù)計(jì)算）Table 2 Correlation analysis of color value and energy charge in broccoli (according to data over a 16 d storage period)

由表2可知，除80% O2＋20% CO2處理組的西蘭花色調(diào)與能荷相關(guān)系數(shù)為0.799外，其余組均高于0.80，CK組的相關(guān)系數(shù)高達(dá)0.986，表明能荷與西蘭花色調(diào)存在很高的相關(guān)性。

2.6 O2/CO2氣調(diào)對(duì)西蘭花貯藏過(guò)程中水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響及與能荷的相關(guān)性分析

圖6 O2/CO2氣調(diào)對(duì)西蘭花水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig. 6 Effect of O2/CO2 controlled atmospheres on water content of broccoli during storage

西蘭花組織鮮嫩多汁，在貯藏期間極易失水導(dǎo)致品質(zhì)惡化，水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)可作為評(píng)價(jià)西蘭花品質(zhì)的重要指標(biāo)。如圖6所示，貯藏期間各組西蘭花的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈下降趨勢(shì)，其中CK組下降最快，16 d內(nèi)下降了6.71%，高于20% O2＋80% CO2、50% O2＋50% CO2和80% O2＋20% CO2處理組（分別為5.64%、2.76%和4.55%）。相比較而言，50% O2＋50% CO2處理組水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降最慢，0～20 d范圍內(nèi)僅下降了4.17%，明顯低于80% O2＋20%和20% O2＋80% CO2處理組（分別為5.84%和7.84%）。相關(guān)性分析（表3）表明，各處理組水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)與能荷之間存在顯著或極顯著的相關(guān)性（P＜0.05，P＜0.01），除80% O2＋20% CO2處理組相關(guān)系數(shù)為0.888外，其余組均高于0.90。

表3 西蘭花水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)與能荷的相關(guān)性分析（以貯藏16 d內(nèi)的數(shù)據(jù)計(jì)算）Table 3 Correlation analysis of water content and energy charge in broccoli (according to data over a 16 d storage period)

3 討 論

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，10 ℃下，50% O2＋50% CO2處理能很好地保鮮西蘭花[9]，為了探討和對(duì)比O2/CO2氣調(diào)對(duì)西蘭花貯藏期間能量代謝和貯藏品質(zhì)的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)除設(shè)置50% O2＋50% CO2處理組外，還設(shè)置了20% O2＋80% CO2、80% O2＋20% CO2兩個(gè)極限條件，目的在于探究O2/CO2氣調(diào)下保鮮效果與能量水平之間的關(guān)系。

pH值是細(xì)胞生理活動(dòng)的重要調(diào)節(jié)因素，它不僅能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的一些酶活性，也調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)一些生理活動(dòng)和代謝過(guò)程[27]，同時(shí)，植物體內(nèi)的呼吸代謝相關(guān)酶活性決定著能荷水平。Mathooko[28]認(rèn)為，高濃度CO2可引起細(xì)胞pH值下降，進(jìn)而使得整個(gè)呼吸途徑出現(xiàn)紊亂，如較低pH值可造成SDH活性降低，造成琥珀酸和蘋(píng)果酸的積累，致使三羧酸循環(huán)難以持續(xù)。Blanch等[29]指出，高濃度CO2處理可增加草莓細(xì)胞膜通透性、加速細(xì)胞膜降解，并降低ATP含量及能量的利用效率。本研究結(jié)果表明，與50% O2＋50% CO2處理組相比，過(guò)高比例的CO2如20% O2＋80% CO2處理引起西蘭花貯藏過(guò)程中pH值降低（圖1），進(jìn)而造成PDH、SDH和CCO活力的下降（圖2）和能荷水平的降低（圖3），與Mathooko[28]的研究結(jié)果一致。過(guò)高比例的O2如80% O2＋20% CO2處理雖在貯藏前期使PDH、SDH和CCO活力提高，但使其后期迅速下降，降低了貯藏期間西蘭花后期的能量產(chǎn)生效率，同樣不利于維持平穩(wěn)而持續(xù)的能量供應(yīng)。

郭衍銀[8]、孫志文[7]等研究指出，高濃度O2不利于西蘭花葉綠素的保持，而適當(dāng)濃度的CO2則利于綠色維持，本實(shí)驗(yàn)西蘭花色調(diào)變化結(jié)果與以上研究一致。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，CK組西蘭花的色調(diào)迅速降低，而另外3 個(gè)處理組西蘭花的色調(diào)雖有降低，但均高于CK組，進(jìn)一步證實(shí)了CO2抑制葉綠素降解的作用。

Pan Yonggui等[30]研究表明，冷藏后木瓜體內(nèi)能荷的降低導(dǎo)致冷害發(fā)生，且冷害指數(shù)與能量水平存在密切的相關(guān)性。劉亭等[31]研究結(jié)果表明，荔枝貯藏期間能荷水平與細(xì)胞膜通透性和果皮褐變指數(shù)呈明顯的負(fù)相關(guān)。VC含量、色調(diào)以及水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)作為西蘭花品質(zhì)指標(biāo)，可直觀評(píng)價(jià)西蘭花貯藏條件的優(yōu)劣。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，能荷水平與西蘭花VC含量、色調(diào)及水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間存在顯著或極顯著的正相關(guān)關(guān)系，CK、20% O2＋80% CO2、50% O2＋50% CO2、80% O2＋20% CO2處理組的能荷水平與VC含量之間相關(guān)系數(shù)分別為0.732～0.996，與色調(diào)之間的相關(guān)系數(shù)分別為0.799～0.986，與水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間的相關(guān)系數(shù)分別為0.888～0.983。說(shuō)明能荷水平可作為主要指標(biāo)，綜合評(píng)價(jià)西蘭花貯藏條件的適宜性。

綜上所述，50% O2＋50% CO2處理可調(diào)節(jié)西蘭花體內(nèi)pH值和呼吸關(guān)鍵酶活性，建立持續(xù)穩(wěn)定的能量供應(yīng)系統(tǒng)，并很好地維持西蘭花貯藏品質(zhì)；CO2過(guò)高或過(guò)低均影響貯藏期間西蘭花能量的持續(xù)供應(yīng)，并降低貯藏品質(zhì)。相關(guān)性分析表明，西蘭花能荷水平和VC含量、色調(diào)及水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)具有很高的相關(guān)性，可作為優(yōu)化西蘭花貯藏條件的衡量指標(biāo)。