秦 燕，趙永康，周華安2，郭泓鋆2，楊 洪，李 蘭

(1.成都市農(nóng)林科學(xué)院，四川 成都 611130； 2.四川天宇種業(yè)有限責(zé)任公司，四川 成都 610101)

單倍體自然發(fā)生機(jī)率極低，一般不超過(guò)0.01%[1]，要獲得大量的單倍體必須依靠人工誘導(dǎo)。1929年首次發(fā)現(xiàn)玉米單倍體[2]，1950年發(fā)現(xiàn)玉米單倍體誘導(dǎo)系Stock 6材料，使玉米單倍體育種技術(shù)由設(shè)想變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)[3]。采用常規(guī)育種方法選育品種，周期長(zhǎng)，效率低，財(cái)力物力人力花費(fèi)很大。通過(guò)誘導(dǎo)獲得單倍體，進(jìn)行單倍體染色體加倍，只需2個(gè)世代就可以獲得純系(DH系)，縮短了自交系選育年限，加速了品種改良的進(jìn)程[4]。單倍體育種技術(shù)在普通玉米育種中得到廣泛應(yīng)用[5-7]，也正逐漸應(yīng)用于糯玉米育種中[8-11]，大大提高了糯玉米雜交組合的配制效率，縮短了優(yōu)良糯玉米雜交種的選育年限。因此，本研究以2個(gè)糯玉米地方品種群體、2個(gè)人工合成糯玉米群體和2個(gè)糯玉米單交種為基礎(chǔ)材料，利用單倍體誘導(dǎo)系進(jìn)行雜交誘導(dǎo)、單倍體鑒定和染色體化學(xué)加倍，探討單倍體技術(shù)在糯玉米育種中應(yīng)用，加快糯玉米育種進(jìn)程。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為四川農(nóng)業(yè)大學(xué)引進(jìn)的改良誘導(dǎo)系YD 1、YD 2、YD 3，3個(gè)誘導(dǎo)系均具有籽粒Navajo標(biāo)記。6份誘導(dǎo)基礎(chǔ)材料分別為從長(zhǎng)江師范大學(xué)引進(jìn)的糯玉米地方品種N 1、N 2及成都市農(nóng)林科學(xué)院合成的糯玉米群體N 3、N 4及糯玉米雜交種N 5(蘇玉糯202)、N 6(京科糯2000) (表1)。

1.2 試驗(yàn)方法

2016年春季在崇州羊馬科技試驗(yàn)園區(qū)進(jìn)行6個(gè)誘導(dǎo)基礎(chǔ)材料的單倍體誘導(dǎo)雜交，每個(gè)基礎(chǔ)材料種植300株，3個(gè)父本誘導(dǎo)系分期播種，使其父母本花期相遇。每個(gè)群體材料與誘導(dǎo)系各做20個(gè)雜交果穗，對(duì)得到的雜交果穗進(jìn)行單穗單粒鑒定。

1.3 單倍體鑒定

在雜交果穗上逐粒鑒別: 紫色粒頂、無(wú)色胚芽尖的籽粒為擬單倍體，紫頂紫胚及無(wú)色粒頂、紫色胚芽尖的籽粒為非單倍體。在苗期依據(jù)植株生長(zhǎng)勢(shì)、株型以及紫色植株標(biāo)記進(jìn)一步鑒定，植株生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)、植株高大、葉片寬大株型披散、莖干或葉片出現(xiàn)紫色的植株均為雜合植株，全部去除，保留生長(zhǎng)發(fā)育慢、植株較矮、葉片上沖、葉色較淺的單倍體植株。

統(tǒng)計(jì)雜交籽粒數(shù)、擬單倍體籽粒數(shù)、出苗數(shù)、去除雜株數(shù)后，計(jì)算擬單倍體誘導(dǎo)率、標(biāo)記鑒定準(zhǔn)確率、校正單倍體誘導(dǎo)率。在計(jì)算標(biāo)記鑒定準(zhǔn)確率時(shí)，假設(shè)沒(méi)出苗的均為單倍體籽粒，因?yàn)閱伪扼w籽粒的生長(zhǎng)勢(shì)弱。

擬單倍體誘導(dǎo)率(%)=(擬單倍體籽粒數(shù)/雜交籽粒數(shù))×100%；

標(biāo)記鑒定準(zhǔn)確率(%)=[(擬單倍體籽粒數(shù)-去除雜株數(shù))/擬單倍體籽粒數(shù)]×100%；

表1 供試材料來(lái)源

供試材料系譜來(lái)源YD1(GY-1×ZY-1)×ZY-1BC3F1-4四川農(nóng)業(yè)大學(xué)YD2(ZY-1×STOCK6)×ZY-1BC2F2-19四川農(nóng)業(yè)大學(xué)YD3二倍體雜株×ZY-1F5-8四川農(nóng)業(yè)大學(xué)N1重慶石柱白糯(地方品種)長(zhǎng)江師范大學(xué)N2重慶秀山白糯(地方品種)長(zhǎng)江師范大學(xué)N3白糯人工合成群體1成都市農(nóng)林科學(xué)院N4黃糯人工合成群體2成都市農(nóng)林科學(xué)院N5蘇玉糯202白糯(N0201×N006)江蘇南通志飛玉米研究所N6京科糯2000白糯(京糯6×BN2)北京農(nóng)林科學(xué)院玉米研究中心

表2 糯玉米單倍體籽粒鑒定及田間鑒定結(jié)果

單倍體材料雜交籽粒數(shù)擬單倍體粒數(shù)擬單倍體率/%出苗株雜合株數(shù)出苗率/%標(biāo)記鑒定準(zhǔn)確率/%校正單倍誘導(dǎo)率/%N1×YD11356876.4681578.282.85.0N1×YD220141095.4861378.988.14.3N1×YD31546684.4561282.482.43.6N2×YD124091586.61262679.783.55.2N2×YD21398835.9561267.585.54.0N2×YD31876764.1651285.584.23.5N3×YD120051567.81341885.988.56.7N3×YD225121977.81483675.181.75.9N3×YD327131485.51122675.782.44.1N4×YD116431026.2742872.572.54.5N4×YD217031589.31023364.679.16.0N4×YD315471026.6742172.579.44.8N5×YD11679965.7771580.284.44.6N5×YD221631054.9722468.677.13.3N5×YD31835673.7481071.685.12.6N6×YD120791135.4772868.175.23.7N6×YD21834955.2741477.985.34.0N6×YD320131015.0682167.379.23.4

校正單倍體誘導(dǎo)率(%)=[(擬單倍體籽粒數(shù)-去除雜株數(shù))/雜交籽粒數(shù)]×100%；

出苗率(%)=(出苗數(shù)/擬單倍體籽粒數(shù))×100%。

1.4 染色體人工加倍

待擬單倍體植株長(zhǎng)到6～7葉1心時(shí)，利用0.2 mL的0.06%秋水仙素+2%二甲基亞砜對(duì)單倍體植株進(jìn)行注射加倍處理，待到散粉吐絲期進(jìn)行單株掛牌和套袋自交。

統(tǒng)計(jì)化學(xué)加倍株數(shù)、散粉株數(shù)、結(jié)實(shí)株數(shù)，計(jì)算散粉株率、結(jié)實(shí)株率。

散粉株率(%)=(散粉株數(shù)/化學(xué)加倍株數(shù))×100%；

結(jié)實(shí)株率(%)=(結(jié)實(shí)株數(shù)/化學(xué)加倍株數(shù))×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用Excel軟件和DPS 7.05軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 糯玉米單倍體籽粒鑒定及田間鑒定

以引進(jìn)的誘導(dǎo)系YD 1、YD 2、YD 3為父本，糯玉米基礎(chǔ)材料N 1～N 6做母本，籽粒鑒定結(jié)果見(jiàn)表2。從表2可知，糯玉米材料的雜交誘導(dǎo)籽粒數(shù)為1 356～2 713粒，平均數(shù)為1 906.9粒，獲得的擬單倍體籽粒為67～197粒，平均數(shù)為112.3粒，擬單倍體率的變化幅度為3.7%～9.3%，變化幅度較大，平均擬單倍體率為5.9%。

將擬單倍體籽粒進(jìn)行田間鑒定(表2)。從表2可知，糯玉米材料單倍體籽粒的出苗率為67.4%～85.9%，平均出苗率為75.0%，表明單倍體籽粒由于生長(zhǎng)勢(shì)較弱不能全部出苗，在實(shí)際應(yīng)用中可適當(dāng)加大基礎(chǔ)材料與誘導(dǎo)系的雜交穗數(shù)。

從雜合株數(shù)及標(biāo)記鑒定準(zhǔn)確率來(lái)看，糯玉米材料的擬單倍體中均含有雜株，標(biāo)記鑒定準(zhǔn)確率為72.5%～85.5%，平均數(shù)為81.6%，表明由于不同基礎(chǔ)材料遺傳背景影響Navajo標(biāo)記的表達(dá)，進(jìn)而影響標(biāo)記鑒定的準(zhǔn)確度。糯玉米材料經(jīng)過(guò)校正后的單倍體誘導(dǎo)率為2.6%～6.7%，平均誘導(dǎo)率為4.3%，變化幅度較大。

表4 各性狀方差分析表

變異來(lái)源自由度出苗率/%標(biāo)記鑒定準(zhǔn)確率/%擬單倍體率/%校正單倍體誘導(dǎo)率/%散粉株率/%結(jié)實(shí)株率/%誘導(dǎo)系21.500.096.05?6.17?2.551.04基礎(chǔ)材料51.461.584.37?4.46?4.62?5.80?誤差100.00340.00150.00010.000050.00020.0001

注：“*”表示在0.05水平上顯著。

2.2 糯玉米單倍體籽粒化學(xué)加倍分析

用秋水仙素對(duì)單倍體植株進(jìn)行化學(xué)加倍處理，結(jié)果見(jiàn)表3?；瘜W(xué)加倍后單倍體的散粉株率幅度為7.4%～15.5%，平均散粉株率為11.4%，化學(xué)加倍后單倍體的結(jié)實(shí)率幅度為2.6%～7.1%，平均結(jié)實(shí)率為5.1%，散粉株率和結(jié)實(shí)率的變化幅度均較大。

表3糯玉米單倍體化學(xué)加倍結(jié)果

單倍體材料化學(xué)加倍株數(shù)散粉株數(shù)結(jié)實(shí)株數(shù)散粉株率/%結(jié)實(shí)株率/%N1×YD1688411.85.9N1×YD28413515.56.0N1×YD3568314.35.4N2×YD11261269.54.8N2×YD2567412.57.1N2×YD36510415.46.2N3×YD113416711.95.2N3×YD214818812.25.4N3×YD3112958.04.5N4×YD1749512.26.8N4×YD210212611.85.9N4×YD3748410.85.4N5×YD1778310.43.9N5×YD272739.74.2N5×YD3486212.54.2N6×YD1778210.42.6N6×YD274739.54.1N6×YD368537.44.4

2.3 不同基礎(chǔ)材料各性狀差異顯著性分析

將各基礎(chǔ)材料與3個(gè)誘導(dǎo)系雜交所得單倍體的出苗率、標(biāo)記鑒定準(zhǔn)確率、擬單倍體率、校正單倍體誘導(dǎo)率、散粉株率、結(jié)實(shí)株率進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，出苗率、標(biāo)記鑒定準(zhǔn)確率在誘導(dǎo)系間和基礎(chǔ)材料間的差異均不顯著，而擬單倍體率、校正單倍體誘導(dǎo)率在誘導(dǎo)系間和基礎(chǔ)材料間差異均達(dá)顯著水平，基礎(chǔ)材料間散粉株率、結(jié)實(shí)率差異也達(dá)顯著水平。結(jié)果表明，單倍體誘導(dǎo)率受母本基礎(chǔ)材料和父本誘導(dǎo)系影響均較大，而散粉株率、結(jié)實(shí)株率則主要受母本基礎(chǔ)材料影響。

對(duì)差異達(dá)顯著水平的性狀按材料計(jì)算均數(shù)并做多重比較，結(jié)果見(jiàn)表5。從基礎(chǔ)來(lái)料的擬單倍體率、校正單倍體誘導(dǎo)率來(lái)看，人工合成群體N 3、N 4的均值最高，高于地方品種N 1、N 2，顯著高于單交種N 5、N 6。從基礎(chǔ)材料的散粉株率和結(jié)實(shí)株率來(lái)看，地方品種N 1、N 2的均值較高，高于或等于人工合成群體N 3、N 4，顯著高于單交種N 5、N 6。

從誘導(dǎo)系的擬單倍體率、校正單倍體誘導(dǎo)率來(lái)看，YD 2最高，顯著高于YD 1和YD 3。誘導(dǎo)系的散粉株率和結(jié)實(shí)株率差異均不顯著。

3 結(jié)論與討論

單倍體誘導(dǎo)率受基礎(chǔ)材料和誘導(dǎo)系影響均較大，而散粉株率、結(jié)實(shí)株率則主要受基礎(chǔ)材料影響，與祁志云[6]等研究結(jié)果基本一致。因而在單倍體育種中，根據(jù)育種目標(biāo)選擇合適的基礎(chǔ)材料和誘導(dǎo)系能大幅度提高單倍體育種效率。

基礎(chǔ)材料的單倍體被誘導(dǎo)率從高到低依次是人工合成群體、地方品種、單交種，散粉株率和結(jié)實(shí)株率從高到低依次是地方品種、人工合成群體、高于單交種。分析其原因可能是因?yàn)楸狙芯坑玫?個(gè)人工合成群體是選用10個(gè)糯玉米單交種經(jīng)多年多代混粉合成，遺傳基礎(chǔ)最復(fù)雜，因而誘導(dǎo)率偏高，與李高科[12]等研究結(jié)果基本一致。而地方品種的散粉株率和結(jié)實(shí)株率最高則可能因?yàn)榈胤狡贩N經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的自然選擇，適應(yīng)性較人工合成群體和單交種強(qiáng)，因而在育性恢復(fù)上偏高。

表5 糯玉米單倍體各性狀差異顯著性分析

基礎(chǔ)材料 擬單倍體率/% 校正單倍體誘導(dǎo)率/% 散粉株率/% 結(jié)實(shí)株率/% 均值5%顯著水平均值5%顯著水平均值5%顯著水平均值5%顯著水平N15.4c4.3bc12.5a5.7aN25.5bc4.2bc12.6a6.0aN37.0ab5.6a10.6abc5.0abN47.4a5.1ab12.0ab6.0aN54.7c3.5c9.3bc4.1bcN65.2c3.7c7.8c3.7cYD15.5b4.3b9.7a4.9aYD27.2a5.3a11.7a5.4aYD35.0b3.6b11.0a5.0a

注：小寫(xiě)字母不同表示差異顯著，相同小寫(xiě)表示差異不顯著。

本研究所選用的3個(gè)誘導(dǎo)系中，YD 2的誘導(dǎo)率顯著高于YD 1和YD 3，表明在糯玉米單倍體誘導(dǎo)育種中，可加大對(duì)誘導(dǎo)系YD 2的利用。