曾誠(chéng)，曾建國(guó)*

1.中獸藥湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410007

博落回Macleayacordata(willd.)R.Br系罌粟科博落回屬多年生草本植物。主要分布于長(zhǎng)江中下游各省，最早記載于《本草拾遺》，此外李時(shí)珍所著《本草綱目》、2006版《中藥大辭典》等中藥典籍均有載入，全草皆可入藥，在中國(guó)已有1000多年的用藥歷史。

研究表明，博落回植物中活性成分除生物堿以外，還有其他非生物堿皂苷[2]、香豆素類內(nèi)酯、苯丙酰胺類等。近年來(lái)大多數(shù)研究對(duì)象均是博落回中的生物堿，鮮有研究博落回中的非生物堿。博落回提取物具有調(diào)節(jié)腸道菌群[3]、抗菌[4]、抗炎[5-6]等作用，通過(guò)查閱文獻(xiàn)，證實(shí)N-對(duì)香豆酰酪胺同樣具有較好的抗炎、抑菌作用[7-9]。孫晶[10]利用LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞炎癥模型實(shí)驗(yàn)中，證明N-對(duì)香豆酰酪胺在IC50為13.7 μmol·L-1時(shí)能有效抑制LPS細(xì)胞釋放一氧化氮，同時(shí)N-對(duì)香豆酰酪胺對(duì)宮頸癌等腫瘤細(xì)胞也有良好的抑制作用[11-13]。為實(shí)現(xiàn)博落回植物資源的綜合利用，本實(shí)驗(yàn)選取非生物堿N-對(duì)香豆酰酪胺為指標(biāo)，首次對(duì)貴州凱里、河南盧氏縣、安徽岳西等10個(gè)產(chǎn)地博落回莖葉樣本進(jìn)行含量測(cè)定，為博落回莖葉微粉相關(guān)獸藥產(chǎn)品提供新的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料

1.1 儀器

1525高效液相色譜儀，包括2707自動(dòng)進(jìn)樣器和2998 PAD檢測(cè)器(美國(guó)Waters公司)，十萬(wàn)分之一分析天平[梅特勒-托利多(上海)儀器有限公司]；KQ-250B型超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)；DZKW-D-2型水浴鍋(上海醫(yī)療器械廠)。

1.2 試藥

N-對(duì)香豆酰酪胺對(duì)照品(成都普思生物科技股份有限公司，純度≥98.0%)；甲醇(色譜純)；乙酸乙酯(分析純)；重蒸水；其他試劑均為分析純。

博落回莖葉樣本采集自安徽岳西、貴州凱里、河南盧氏縣、湖北英山、江西新余、陜西西安、湖北通山、婁底漣源、河南洛陽(yáng)、廣西桂林，樣本由湖南中醫(yī)藥大學(xué)楊廣民教授鑒定為罌粟科博落回屬植物博落回Macleayacordata(Willd.)R.Br.的莖葉。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為資生堂MG3 C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為甲醇-水(40∶60)；梯度洗脫，洗脫時(shí)間為35 min；檢測(cè)波長(zhǎng)為290 nm；流速為1.0 mL·min-1；柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量為10 μL，見(jiàn)圖1。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

對(duì)照品母液：準(zhǔn)確稱取適量N-對(duì)香豆酰酪胺對(duì)照品，加甲醇制成質(zhì)量濃度為0.196 2 mg·mL-1的溶液。

對(duì)照品溶液：準(zhǔn)確吸取對(duì)照品母液3.0 mL，用甲醇定容至10.0 mL，制成質(zhì)量濃度為0.023 5 mg·mL-1的溶液。

注：A.對(duì)照品；B.樣品；1.N-對(duì)香豆酰酪胺。圖1 N-對(duì)香豆酰酪胺對(duì)照品和博落回莖葉樣品的HPLC圖

2.3 供試品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取博落回莖葉微粉樣品10.0 g，用濾紙包好，置索氏提取器中，加入乙酸乙酯150 mL，稱質(zhì)量，浸泡12 h，水浴(90 ℃)提取至管內(nèi)液體無(wú)色，放冷，稱質(zhì)量，加乙酸乙酯補(bǔ)足質(zhì)量，經(jīng)硅膠柱色譜，以二氯甲烷-甲醇(25∶1)洗脫，收集所需洗脫液，經(jīng)減壓濃縮至流浸膏狀，加5.0 mL甲醇懸浮，超聲15 min，濾過(guò)，續(xù)濾液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.4 線性關(guān)系考察

分別吸取N-對(duì)香豆酰酪胺對(duì)照品母液，進(jìn)樣量依次為10、8、6、4、2 μL，注入高效液相色譜儀，按2.1項(xiàng)條件下測(cè)定峰面積，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，N-對(duì)香豆酰酪胺濃度為橫坐標(biāo)，經(jīng)線性回歸處理，得回歸方程Y=43 589 644.47X-5 951.833(r=0.999 6)。N-對(duì)香豆酰酪胺含量在0.077 5～0.470 4 mg呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

準(zhǔn)確吸取N-對(duì)香豆酰酪胺對(duì)照品溶液，同一天內(nèi)，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄N-對(duì)香豆酰酪胺對(duì)照品的峰面積和保留時(shí)間，其RSD分別為0.52%和0.10%。結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取同一產(chǎn)地(湖北通山)博落回莖葉粉末10.0 g，按2.3項(xiàng)方法制備樣品溶液，分別于配制后0、2、4、8、16、24 h進(jìn)行測(cè)定，RSD 為2.03%，表明供試樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取湖北通山博落回莖葉粉末6份，按2.3項(xiàng)方法制備供試樣品溶液，按2.1項(xiàng)下條件測(cè)定，經(jīng)計(jì)算得N-對(duì)香豆酰酪胺峰面積均值為322 128，RSD為0.566%，結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

分別準(zhǔn)確稱取已知含量的江西新余博落回莖葉粉末(0.001 5%)6份，每份10.0 g，按2.3項(xiàng)制備供試品溶液，分別吸取每份供試品溶液2.5 mL置于5 mL容量瓶中，每瓶中分別準(zhǔn)確加入1.30 mL對(duì)照品溶液，用甲醇溶液定容至5 mL，按2.1項(xiàng)條件下測(cè)定并計(jì)算回收率，平均回收率為98.7%，RSD為2.40%，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 N-對(duì)香豆酰酪回收率

2.9 樣品含量測(cè)定

準(zhǔn)確稱取10個(gè)不同產(chǎn)地的博落回莖葉微粉各10.0 g，按2.3項(xiàng)方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)條件下測(cè)定含量，記錄峰面積，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同產(chǎn)地博落回莖葉中N-對(duì)香豆酰酪胺含量測(cè)定(n=3)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟诮⒎巧飰AN-對(duì)香豆酰酪胺的含量測(cè)定方法，為博落回莖葉微粉相關(guān)獸藥開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)，并提供新的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。

在提取工藝的考察上，先對(duì)比了水、乙酸乙酯、甲醇分別作為提取溶劑時(shí)對(duì)N-對(duì)香豆酰酪胺提取率的影響，結(jié)果顯示，乙酸乙酯提取的效果優(yōu)于其他兩種溶劑，再用乙酸乙酯為提取溶劑，對(duì)比冷凝回流法、索氏提取法、超聲提取法對(duì)提取率的影響，結(jié)果表明，用索氏提取法得到的N-香豆酰酪胺含量最高，提取終點(diǎn)為提取至管內(nèi)液體無(wú)色。故本實(shí)驗(yàn)選取乙酸乙酯為提取溶劑，提取方式為索氏提取法。

因?yàn)樵摲巧飰A含量低，為了進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)需求，對(duì)提取后的溶液經(jīng)硅膠柱層析純化，以二氯甲烷-甲醇(25∶1)洗脫，收集所需洗脫液，經(jīng)減壓濃縮至流浸膏狀，加5.0 mL甲醇懸浮，超聲15 min。

全波長(zhǎng)掃描結(jié)果及查閱的文獻(xiàn)，均表明在290 nm波長(zhǎng)處，N-對(duì)香豆酰酪胺有最大吸收，從而選取290 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC對(duì)10個(gè)不同產(chǎn)地的博落回莖葉樣本中非生物堿N-對(duì)香豆酰酪胺的含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，RSD均小于5%，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)方法是穩(wěn)定的、可行的，能用于檢測(cè)博落回其他部位中N-對(duì)香豆酰酪胺的含量，鄧安珺等[14]從博落回根中分離純化得到150 mgN-對(duì)香豆酰酪胺純品，表明博落回其他部位中也含該非生物堿，其中各部位的含量值得我們進(jìn)一步研究，從而達(dá)到博落回資源的綜合利用開(kāi)發(fā)。