李鉑，唐志書*，王楠，黃文靜，孫曉春，宋忠興，王二歡，劉峰，王益民

1.陜西中醫(yī)藥大學 陜西省中藥資源產業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 咸陽 712083；2.陜西步長制藥有限公司，陜西 西安 710075

當歸為傘形科當歸屬植物Angelicasinensis(Oliv.)Diels的干燥根，是我國常用的大宗藥材之一[1]。當歸又稱岷歸、云歸、秦歸，主要分布于甘肅、云南、四川、陜西等地[2]。甘肅岷縣、宕昌縣等地當歸栽培歷史悠久，種植面積廣，種植技術成熟，藥材品質上乘[3]。水楊酸(salicylic acid，SA)作為參與脅迫應答的一種信號分子，不僅可以誘導植物體內病程相關蛋白(pathogenesis-related proteins)基因表達，使機體產生抗病性，同時能提高植物對多種逆境脅迫的抗性，適度促進植物的生長[4]。外源噴施水楊酸對植物生理特性影響的研究多見于小麥[5]、番茄[6]、黃瓜[7]等農作物，也用于促進黃芪[8]、丹參[9]、蒼術[10]等藥用植物種子萌發(fā)、植株生長和有效成分次生代謝調控等研究。植物體內由超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化物酶(peroxidase，POD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)等構成的保護酶系統(tǒng)，是植物應對逆境脅迫的重要防御體系之一，能有效地保護植物，減輕環(huán)境脅迫對植物的傷害。本研究通過采用葉面噴施SA處理基質栽培的當歸幼苗，考察當歸幼苗生長、保護酶活性對不同濃度SA的響應水平，為提高當歸藥材的品質、指導藥材生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

當歸種子采自甘肅省宕昌縣阿塢鄉(xiāng)麻界村陜西步長制藥當歸規(guī)范化種植基地。GPS信息：104°09′41.84" E，34°16′56.21" N，海拔2406 m。選取顆粒飽滿、大小均一的當歸種子，經除雜、消毒后，用蒸餾水沖洗三次，取出，吸干種子表面水分，備用。

取30 cm×25 cm塑料盆，裝入適量基質(PindStrup，Denmark，粒徑0～6 mm，pH 6.0)，將處理好的當歸種子播撒于盆中，置于人工氣候箱(20 ℃，2 000 lux，相對濕度50%～60%)；待真葉展開后，每盆留苗20株，每個處理3盆，共15盆。

1.2 儀器與試劑

儀器：LB-350HPY-2型人工氣候箱(上海龍躍儀器設備有限公司)；Multiskan GO全波長酶標儀(Thermo Scientific，USA)；UV-2600紫外可見分光光度計(Shimadzu，Japan)。

試劑：水楊酸(北京索萊寶科技有限公司)；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、無水乙醇(天津市大茂化學試劑廠)；水為蒸餾水。

1.3 試驗方法

1.3.1 水楊酸濃度梯度及噴施方法 配制濃度分別為0.1、0.5、1.0、2.0 mmol·L-1的水楊酸溶液，以蒸餾水為對照(CK，0 mmol·L-1)，待基質栽培的當歸幼苗生長至60 d時開始葉面噴施，以液滴欲滴為準，每天噴施一次；分別于處理3、5、7 d取樣，新鮮樣品用于酶活測定，第7天采樣的同時測定幼苗長度和鮮質量。每個處理設3個生物學重復[11]。

1.3.2 酶活性測定 取新鮮當歸幼苗，洗凈雜質，吸干水分，精確稱取0.3 g，加入2.7 mL磷酸緩沖液(0.05 mol·L-1，pH 7.8)，冰上迅速研磨成勻漿，4 ℃、10 000 r·min-1離心10 min，上清液用于酶活性測定[12]。

當歸幼苗蛋白含量采用BCA蛋白濃度檢測試劑盒測定(P0010S，上海碧云天生物技術有限公司)；超氧化物歧化酶活性采用總SOD活性檢測試劑盒測定(S0101，上海碧云天生物技術有限公司)；過氧化物酶活性采用POD活性檢測試劑盒測定(A084-3，南京建成生物工程研究所)；過氧化氫酶活性采用CAT活性檢測試劑盒測定(A007-1，南京建成生物工程研究所)。酶活力單位以U·mgprot-1蛋白含量表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2013和SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，運用單因素方差分析結合多重比較進行多組樣本間差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 水楊酸處理對當歸幼苗生長的影響

低濃度的SA可以促進當歸幼苗的生長，株高、鮮質量增加明顯，葉片呈現(xiàn)深綠色(圖1)。0.5 mmol·L-1SA處理當歸幼苗7 d，株高為12.40 cm，是對照組的135.2%，此時鮮質量為0.193 4 g，是對照組的224.6%，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖2)。隨著SA處理濃度增加，株高逐漸下降，葉片發(fā)黃，當歸幼苗生長受到明顯抑制。當濃度達到2.0 mmol·L-1時(處理7 d)，當歸幼苗葉片發(fā)生卷曲，植株弱小，此時鮮質量僅為對照組的72.7%。

圖1 不同濃度水楊酸處理的當歸幼苗形態(tài)變化(7 d)

注：*P<0.05。圖2 不同濃度水楊酸處理的當歸幼苗生長指標比較(7 d)

2.2 水楊酸處理對當歸幼苗保護酶活性的影響

2.2.1 超氧化物歧化酶(SOD)活性變化 不同濃度SA處理當歸幼苗3、5 d后，各處理組之間SOD活性相比對照組略有增加，不同組別間差異不明顯。隨著外源SA處理時間的延長和處理濃度的增加，SOD活性表現(xiàn)出逐漸升高的趨勢，處理后期(7 d)增加幅度明顯。1.0、2.0 mmol·L-1SA噴施當歸幼苗7 d后，SOD活性增加顯著，分別達到1.192 U·mgprot-1和1.092 U·mgprot-1，分別為對照組的149.1%(P<0.01)和136.6%(P<0.05)(圖3)。說明1.0 mmol·L-1的水楊酸為提高當歸幼苗SOD活性的最佳濃度。

注：*P<0.05，**P<0.01。圖3 不同濃度水楊酸處理當歸幼苗SOD酶活性比較

2.2.2 過氧化物酶(POD)活性變化 由圖4可知，POD活性隨水楊酸處理濃度和處理時間的增加，呈現(xiàn)逐漸增高的趨勢。不同濃度SA處理當歸幼苗3 d，POD活性以0.5 mmol·L-1處理的提高幅度為最大，達到26.26 U·mgprot-1，是對照組的116.5%。1.0 mmol·L-1和2.0 mmol·L-1水楊酸處理當歸幼苗5 d，POD活性增加幅度明顯，分別達到26.47 U·mgprot-1和28.33 U·mgprot-1，相比對照組分別提高35.54%和45.06%，達到顯著差異水平(P<0.01)。低濃度SA處理7 d，POD活性相比對照組有所下降，1.0 mmol·L-1和2.0 mmol·L-1水楊酸處理的當歸幼苗，POD活性顯著增加，分別為對照組的138.2%(P<0.01)和146.6%(P<0.01)，但高濃度的水楊酸處理對當歸幼苗生長的抑制作用明顯(圖1)。綜合多項指標，噴施1.0 mmol·L-1水楊酸為提高當歸幼苗體內過氧化物酶活性的適宜處理方式。

注：*P<0.05，**P<0.01。圖4 不同濃度水楊酸處理當歸幼苗POD酶活性比較

2.2.3 過氧化氫酶(CAT)活性變化 外源SA處理當歸幼苗，對照組和處理組CAT活性保持總體下降的趨勢(圖5)。1.0 mmol·L-1水楊酸處理當歸幼苗，CAT活性在處理3 d時達到最高15.46 U·mgprot-1，相比對照組提高45.6%。不同濃度水楊酸處理5 d時，當歸幼苗中CAT活性在7.75～10.88 U·mgprot-1之間，均顯著高于對照組(5.42 U·mgprot-1)；噴施

注：*P<0.05，**P<0.01。圖5 不同濃度水楊酸處理當歸幼苗CAT酶活性比較

1.0 mmol·L-1水楊酸5 d，CAT活性亦增加顯著，為對照組的194.7%。SA處理后期，當歸幼苗中CAT活性增加不明顯，僅1.0 mmol·L-1水楊酸處理7 d時，CAT活性為10.84 U·mgprot-1，相比對照組提高36.35%(P<0.01)。由此可看出，1.0 mmol·L-1水楊酸處理當歸幼苗，能夠顯著增加CAT活性。

3 討論

水楊酸作為一種植物生長調節(jié)劑和信號分子，能夠促進植物細胞分裂和伸長，誘導一系列與抗逆有關的基因表達，提高植物體內保護酶活性，以緩解環(huán)境脅迫對植物造成的傷害。葉面噴施是促進植物生長和次生代謝物積累的有效手段。薛建平等[13]利用0.5 mmol·L-1SA噴施半夏植株，葉綠素含量和胞間CO2濃度顯著增加，使得半夏同化更多的有機物，表現(xiàn)為塊莖鮮質量的增加；同時，SA處理后植株MDA含量降低，SOD保護酶活性提高。Giménez等[11]利用0.5 mmol·L-1水楊酸對采收期甜櫻桃進行處理，果實的色澤、硬度、可溶性固形物、總酚酸含量，以及保護酶活性顯著提高。韓鳳等[14]對管萼山豆根進行葉面施肥，植株的年生長高度及年增長率顯著提高。說明合理濃度范圍的SA處理對藥用植物的生長具有一定的促進作用。本研究中，噴施0.5 mmol·L-1SA對當歸幼苗株高和鮮質量的增加具有促進作用，而較高濃度的水楊酸明顯抑制了當歸幼苗的生長，表現(xiàn)出輕微的毒害作用，這與前人的研究報道基本一致。

同時，葉面持續(xù)噴施1.0 mmol·L-1的水楊酸能夠適度提高當歸幼苗SOD、POD、CAT活性，且酶活性的最大值多出現(xiàn)于處理的中后期，即當歸幼苗對水楊酸的響應存在明顯的濃度依賴性和滯后性。這可能是由于葉面噴施水楊酸處理當歸幼苗后，植物體內防御機制被啟動，導致參與防御反應的相關酶活性升高。

本研究以當歸這一傳統(tǒng)大宗藥材作為研究材料，采用葉面噴施的手段，考察基質栽培的當歸幼苗生理特性和保護酶活性對外源水楊酸的響應情況，并在此基礎上篩選出適宜的水楊酸處理濃度，對當歸種子種苗選育和大田生產具有一定的指導意義，可為提升當歸藥材產量和品質提供參考。在此研究基礎上，后續(xù)將進一步開展外源噴施水楊酸對當歸有效成分積累和次生代謝途徑關鍵基因表達調控等研究，結合生理生化指標的變化，以期為SA在當歸生產中的合理應用提供一定的理論和實踐依據(jù)。