段學(xué)偉，于晶，張昭，徐碩，范永芳

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所/中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點(diǎn)試驗(yàn)室，北京 100193

黃檗PhellodendronamurenseRupr.為蕓香科黃檗屬落葉喬木，樹皮作為中藥關(guān)黃柏使用，具瀉火除蒸、消炎殺菌、清熱燥濕的功效[1]。黃檗為國(guó)家二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生植物，野生資源匱乏[2]。課題組發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地黃檗種子特性差異很大，尤其是休眠程度，所需低溫解除休眠天數(shù)可相差幾十乃至百天[3]，這種現(xiàn)象的存在對(duì)黃檗的人工種植造成諸多的困難。目前對(duì)種子休眠的研究大多集中在對(duì)種子休眠的解除上，而對(duì)黃檗種子休眠的原因很少涉及。本研究通過比較同一觀察點(diǎn)相同植株不同年份種子的性狀，控制其他變量，分析溫度因子對(duì)種子性狀的影響，以期為黃檗種子休眠的形成機(jī)制研究提供理論依據(jù)以及為人工種植提供指導(dǎo)意見。

1 材料

黃檗種子采集于北京藥用植物園，依據(jù)在園內(nèi)的不同位置，分別標(biāo)記為Y1、Y2、Y3、Y4和Y5，五個(gè)觀察點(diǎn)的氣候條件基本相同，樹齡略有不同。固定植株采集種子，每個(gè)觀察點(diǎn)不少于兩棵樹，于每年的10月中旬采收黃檗果實(shí)。由于每年結(jié)果數(shù)量不同，Y1和Y2采集了2015、2016和2017連續(xù)三年的果實(shí)，Y3和Y4采集到了2015和2016年的果實(shí)，Y5采集到了2016和2017年的果實(shí)。采集到的果實(shí)曬干后，放置于陰涼干燥處保存，實(shí)驗(yàn)前去除果肉，洗凈晾干后得到黃檗種子。樣品經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所張昭研究員鑒定為黃檗PhellodendronamurenseRupr.的種子，憑證標(biāo)本保存于藥用植物研究所。

2 方法

2.1 種子長(zhǎng)度、厚度及重量的測(cè)定

每個(gè)處理隨機(jī)選取60粒種子，隨機(jī)分成3組，每組20粒，游標(biāo)卡尺測(cè)量種子長(zhǎng)度及厚度；采用千粒法，3個(gè)重復(fù)測(cè)量種子重量。

2.2 種子休眠程度檢測(cè)

2.2.1 種子發(fā)芽率測(cè)定 取種子經(jīng)蒸餾水浸泡24 h后，放入4 ℃冰箱分別低溫層積0、15、30、45、60、75、90、105、120、135 d。從冰箱取出后置于光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行萌發(fā)實(shí)驗(yàn)，萌發(fā)條件為：24 ℃，14 h，光照3000 lx；15 ℃，10 h，無(wú)光。每個(gè)處理設(shè)置5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)50粒種子。

2.2.2 種子休眠程度指標(biāo)選擇 選取種子發(fā)芽率首次達(dá)到50%所需低溫層積天數(shù)和經(jīng)低溫層積后的最高發(fā)芽率作為種子休眠程度的衡量指標(biāo)。

2.3 溫度數(shù)據(jù)的獲取

樣點(diǎn)溫度通過HOBO U23-001溫度記錄儀獲取，將溫度記錄儀放置于觀察點(diǎn)附近避光通風(fēng)處，記錄儀每2 h記錄1次。通過物候觀察，得到黃檗萌芽期為每年的4月3日至11日；花期為每年的4月21日至27日；果期為每年的5月9日至8月26日；生長(zhǎng)期為每年的4月3日至10月18日。各物候期的日均溫度總和為各物候期積溫；各物候期的日均溫平均值為各物候期均溫；各物候期日最高溫與日最低溫差值的平均值為各物候期的平均溫差；一年中日平均氣溫大于20 ℃日平均氣溫的總和為大于20 ℃積溫。溫度數(shù)據(jù)見表1。

表1 2015年至2017年溫度數(shù)據(jù) ℃

2.4 數(shù)據(jù)分析方法

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS V21.0。差異性分析采用單因素方差分析法；相關(guān)性分析采用speraman法。

3 結(jié)果

3.1 不同年份種子長(zhǎng)度、厚度及重量比較

在本研究中，通過長(zhǎng)度表征種子大小、厚度表征子葉厚度。由于只有Y1和Y2連續(xù)三年采集到種子，種子年度間性狀的比較只選取Y1和Y2兩個(gè)觀察點(diǎn)數(shù)據(jù)。測(cè)量2015、2016和2017年Y1和Y2的種子長(zhǎng)度、厚度和重量，數(shù)據(jù)見表2。

表2 不同年份黃檗種子性狀比較

注：同一列不同字母表示差異顯著，大小寫字母分別代表P<0.01，P<0.05。

三年間種子性狀具有顯著性差異：Y1和Y2的種子長(zhǎng)度均為2016年>2017年>2015年，差異最大為0.32 mm；Y1和Y2的種子厚度均為2017年>2015年>2016年，差異最大為0.19 mm；Y1和Y2種子重量均為2017年>2015年>2016年，差異最大為0.192 9 g。

3.2 不同年份種子休眠程度比較

不同年份種子休眠程度結(jié)果見圖1、表3。由圖1可以看出，兩個(gè)觀察點(diǎn)不同年份間的種子休眠程度總體趨勢(shì)相同，均為在低溫層積0～60 d內(nèi)，發(fā)芽率排序?yàn)?017年>2016年>2015年；在低溫層積120、135 d時(shí)，發(fā)芽率排序?yàn)?016年>2017年>2015年。

三年間Y1和Y2的休眠程度均具有顯著性差異(表3)。在觀察點(diǎn)Y1中，2015年種子休眠程度最深，三年間發(fā)芽率達(dá)到50%所需低溫天數(shù)最大差異可達(dá)61 d，最高發(fā)芽率差異可達(dá)25%；觀察點(diǎn)Y2與Y1結(jié)果相似，2015年種子休眠程度最深，三年間發(fā)芽率達(dá)到50%所需低溫天數(shù)最大差異可達(dá)60 d，最高發(fā)芽率差異可達(dá)30%。

圖1 不同年份黃檗種子發(fā)芽率比較

年份達(dá)到50%所需低溫天數(shù)/d最高發(fā)芽率/%Y1Y2Y1Y22015年91Aa71Aa64Bc66Bc2016年45Bb15Bb89Aa96Aa2017年30Bc11Bc78Ab93Ab

注：同一列不同字母表示差異顯著，大小寫字母分別代表P<0.01，P<0.05。

3.3 相關(guān)性分析結(jié)果

3.3.1 種子長(zhǎng)度、厚度和重量與溫度的相關(guān)性 在研究溫度對(duì)黃檗種子性狀的影響時(shí)，考慮到萌芽期、花期時(shí)，種子尚未長(zhǎng)出，所以只考察了果期、生長(zhǎng)期的年度溫度數(shù)據(jù)對(duì)種子性狀的影響。種子長(zhǎng)度、厚度和重量與溫度的相關(guān)性見表4。

表4 種子長(zhǎng)度、厚度和重量與溫度的相關(guān)性

注：**表示P<0.01。

由表4可以看出，溫度對(duì)種子長(zhǎng)度、厚度和重量均有影響。除果期平均溫差、生長(zhǎng)期平均溫差和年平均最低溫外，各物候期溫度均與種子長(zhǎng)度呈正相關(guān)，其中影響最大的溫度因素是果期平均最低溫與生長(zhǎng)期平均最低溫，相關(guān)系數(shù)均達(dá)到了0.701。結(jié)果顯示年均溫度與種子長(zhǎng)度呈正相關(guān)，這與童應(yīng)鵬、胡梟劍對(duì)薏苡[4]、車前[5]的研究結(jié)果相同。果期平均最低溫與生長(zhǎng)期平均最低溫對(duì)種子厚度影響呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.612，果期平均溫差，生長(zhǎng)期平均溫差和年平均最低溫對(duì)種子厚度的影響呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.583。影響種子重量的溫度因子只有生長(zhǎng)期平均溫差與年平均最低溫，均為正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.435。

3.3.2 休眠程度與溫度的相關(guān)性 在休眠程度與溫度的相關(guān)性分析中，包含5個(gè)觀察點(diǎn)的全部數(shù)據(jù)，Y1與Y2觀察點(diǎn)的種子休眠程度見表3，Y3、Y4、Y5觀察點(diǎn)的種子休眠程度見表5。種子休眠程度與溫度的相關(guān)系數(shù)見表6。

表5 Y3、Y4、Y5觀察點(diǎn)黃檗種子休眠程度

表6 休眠程度與溫度的相關(guān)性

注：**表示P<0.01。

對(duì)種子達(dá)到50%發(fā)芽率所需低溫天數(shù)影響最大的溫度因子是萌芽期均溫、果期均溫、生長(zhǎng)期均溫、年均溫、年平均溫差和大于20 ℃積溫，相關(guān)系數(shù)為-0.743；對(duì)黃檗種子最高發(fā)芽率影響最大的是花期積溫，相關(guān)系數(shù)為0.84，與最高發(fā)芽率呈負(fù)相關(guān)的溫度因子有花期平均溫差、果期平均溫差，生長(zhǎng)期平均溫差和年平均最低溫。

種子達(dá)到50%發(fā)芽率所需低溫天數(shù)和最高發(fā)芽率從不同側(cè)面反映了種子的休眠程度，由表6可以看出，溫度與兩者相關(guān)系數(shù)的正負(fù)值均為相反，除溫差外，溫度因子均與休眠程度均呈顯著性負(fù)相關(guān)，這與擬南芥、紫花苜宿種子休眠程度對(duì)溫度的響應(yīng)一致[6-7]。在具有顯著相關(guān)的因子中，只有花期、果期和生長(zhǎng)期的溫差與休眠程度呈正相關(guān)，說明在溫暖的氣候條件下，種子休眠程度較淺，各物候期的溫差存在較大差異時(shí)，種子的休眠程度較深。

4 結(jié)論

除果期平均溫差、生長(zhǎng)期平均溫差和年平均低溫外，其余溫度因子均對(duì)種子長(zhǎng)度均有顯著性影響，說明全年溫度均對(duì)種子大小產(chǎn)生影響；對(duì)厚度和重量有顯著性影響的溫度因子分別只有5個(gè)和2個(gè)，且全為最低溫和溫差，說明子葉厚度與種子重量主要與最低溫和溫差有關(guān)。

Y1和Y2兩個(gè)觀察點(diǎn)中，三年間的休眠程度趨勢(shì)基本相同，溫度與休眠程度的相關(guān)性數(shù)據(jù)表明，各物候期積溫和均溫均與休眠程度呈負(fù)相關(guān)，說明積溫和均溫越高，休眠程度越低，在溫暖和溫差較小的氣候條件下生長(zhǎng)的黃檗，其種子休眠程度較淺；寒冷和溫差較大的氣候條件下生長(zhǎng)的黃檗，其種子的休眠程度較深。

5 討論

本研究選取同一觀察點(diǎn)不同年份的黃檗種子作為分析對(duì)象，可以單純考察不同年份間氣候因子對(duì)黃檗種子性狀的影響。課題組之前研究表明，氣候?qū)S檗的影響主要體現(xiàn)在溫度因子上[8]，現(xiàn)在的大多數(shù)研究中溫度數(shù)據(jù)都較為粗糙，多為年均數(shù)據(jù)或月均數(shù)據(jù)，本研究通過在樣點(diǎn)放置溫度檢測(cè)器，記錄樣點(diǎn)每日溫度，可以將年均數(shù)據(jù)細(xì)分為各物候期溫度，這樣得出的數(shù)據(jù)更具有針對(duì)性。在評(píng)價(jià)黃檗種子休眠程度時(shí)，采用了種子達(dá)到50%發(fā)芽率所需低溫層積天數(shù)和種子能達(dá)到的最高發(fā)芽率兩個(gè)指標(biāo)，這兩個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)比大多數(shù)研究中評(píng)價(jià)休眠程度時(shí)采用的相同低溫天數(shù)處理下達(dá)到的發(fā)芽率更能客觀的反映種子的休眠程度。

目前黃檗育苗主要有春播和秋播兩種方式，春播需要沙藏低溫處理[9]。本研究表明不同年份間的黃檗種子休眠程度具有差異，生產(chǎn)所用種子可能取自不同地點(diǎn)，休眠程度差別更大，沙藏低溫處理的時(shí)間很難把握，因此建議育苗時(shí)選擇秋播。

全球氣候的變化會(huì)對(duì)不同物種的種子產(chǎn)生不同的影響[10]，全球變暖有利于輪葉馬先蒿種子的萌發(fā)和擴(kuò)散[11]，不利于華北落葉松種群的更新[12]。黃檗產(chǎn)區(qū)的溫度隨著全球變暖會(huì)變得更高，這將有利于黃檗的物種繁殖，對(duì)緩解黃檗資源衰竭的狀況有利。