劉琳玲，叢波，劉宗岳，王桂武，宋興超，楊福合

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物分子生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長春 130112）

DAZ（Deleted in Azoospermia）基因家族在精子形成過程中起著非常重要的作用[1]。DAZ基因家族包括DAZ基因、DAZL基因和BOULE基因3個(gè)成員[2]。DAZ家族的共同特征是編碼一個(gè)保守的RNA識(shí)別基序（RNA recognition motif RRM）和不同數(shù)量的24個(gè)氨基酸DAZ重復(fù)基序[3]。在人、果蠅、老鼠、蠑螈、斑馬魚和青鳉等研究中表明，DAZL基因?qū)p數(shù)分裂和生殖細(xì)胞發(fā)育中起到重要作用[4]。DAZL基因影響著PGC細(xì)胞的生成和卵母細(xì)胞的配子形成。人的DAZL基因多態(tài)性與精子生成或者精子數(shù)量下降具有相關(guān)性。Reynolds[5]發(fā)現(xiàn)，DAZL基因缺失會(huì)引起小鼠Mvh蛋白表達(dá)量下降。

目前，DAZL基因在水貂上的研究還沒有報(bào)道。本研究選取短毛黑、銀蘭、紅眼白3個(gè)品種的公水貂為研究對(duì)象，構(gòu)建品種DNA池，采用PCR技術(shù)擴(kuò)增后直接測(cè)序來分析DAZL基因。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所毛皮動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基地的短毛黑、銀蘭、紅眼白公水貂各20只。水貂打處死針以后，真空采血管心臟采血5 mL，20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

用血液基因組提取試劑盒提取基因組DNA，提取基因組放在 80℃保存。用紫外分光光度計(jì)測(cè)量每個(gè)DNA樣品濃度，再稀釋為100ng/L。每個(gè)品種20個(gè)樣品，各取5L，分別構(gòu)建短毛黑、銀蘭、紅眼白品種DNA池。

1.2 引物設(shè)計(jì)

在Genebank中找到豬、牛、羊等DAZL基因，利用DNAman軟件找出保守區(qū)域，采用引物分析軟件Primer Premier5.0分析設(shè)計(jì)特異性 DAZL基因部分CDS區(qū)引物。引物為：

D1:5′-CAAACCTCCTGGAAGAAT-3′

D2:5′-CTTGTCTAAACCCAGTAAAA-3′

引物由吉林省庫美生物科技有限公司合成。

1.3 PCR反應(yīng)

PCR 反應(yīng)條件：94℃5 min；94℃30 s，52℃30 s，72℃30s，共 30 個(gè)循環(huán)；72℃5 min；4℃保存。取 5L PCR產(chǎn)物，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.4 擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序

經(jīng)PCR擴(kuò)增，瓊脂糖電泳檢測(cè)合格，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.5 數(shù)據(jù)分析

測(cè)序結(jié)果進(jìn)行人工校正后，利用MEG5.0軟件和DNAMAN軟件，BLAST分析確定SNPs和同源性分析。序列比對(duì)后，用MEGA6軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 3個(gè)品種水貂的PCR擴(kuò)增結(jié)果

利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，擴(kuò)增片段大小與預(yù)測(cè)大小一致，特異性好，可以進(jìn)行直接測(cè)序分析，結(jié)果見圖1。

圖1 DAZL基因部分CDS區(qū)PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Electrophoresisof theproductsof sequencein partsof CDS of DAZL gene in mink

2.2 DAZL基因部分CDS區(qū)序列分析和同源性分析

以短毛黑、銀蘭、紅眼白3個(gè)品種水貂構(gòu)建DNA池，通過PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果如圖2，BLAST未發(fā)現(xiàn)SNPs。將所測(cè)序列與GenBank中的雪貂、豬、犀牛、駱駝、牛、河豚進(jìn)行同源性分析，結(jié)果見表1。水貂與雪貂同源性很高（94.2%），與豬、犀牛、駱駝、江豚同源性較高（80.8%～81.8%），與牛的同源性較低（77.4%）。

2.3 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹

在Genebank中下載不同物種的序列，進(jìn)行序列對(duì)比分析，并用MEGA6軟件分析進(jìn)化關(guān)系，構(gòu)建不同物種的系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果見圖3。系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，水貂與雪貂屬同一分支。

圖2 DAZL基因部分CDS區(qū)測(cè)序結(jié)果Fig.2 Sequencing result of sequence in partsof CDSof DAZL gene in mink.

圖3 系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenic tree

表1 同源性分析Table 1 Nucleotide homology analysis （%）

3 討論

DNA池是將具有一共同特征群體的部分個(gè)體DNA提取以后，經(jīng)過定量稀釋成一定濃度，按比例或者等量混合構(gòu)成一個(gè)池[6]。DNA池技術(shù)用來快速研究品種間的遺傳差異，快速、簡便、效率高、成本低，縮短了研究周期。初芹等[7]利用DNA池測(cè)序法，根據(jù)測(cè)序峰圖中不同堿基信號(hào)峰高的比值確定了牛的92個(gè)SNP為高信息量標(biāo)記。宋桃偉等[8]利用DNA池技術(shù)研究豬GH基因啟動(dòng)子序列的多態(tài)性。楊永強(qiáng)等[9]利用DNA池快速篩查牛SOCS2、SOCS3和CIS基因SNPs。陳志等[10]利用DNA池研究了3個(gè)品種山羊的CXCL10基因多態(tài)性，篩查到了2個(gè)與繁殖性能相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性。喬冬雨等[10]利用DNA池技術(shù)分析8個(gè)品種牛的大理石花紋評(píng)分相關(guān)基因變異的微衛(wèi)星分析。劉文博等[11]利用混合樣本池檢測(cè)了雞顯性白羽基因PMEL17的突變位點(diǎn)。趙冰茹等[12]基于DNA池重測(cè)序技術(shù)，研究分析了細(xì)毛羊 LAMB1基因的SNPs。李敬瑞等[13]對(duì)豬DAZ基因的DNA池進(jìn)行了測(cè)序分析。

短毛黑、銀蘭、眼白3個(gè)品種水貂的毛絨品質(zhì)和體型特征都有差異。3個(gè)品種的公水貂都來源于健康的純種貂群。從測(cè)序和分析結(jié)果可以看出，不同品種水貂間DAZL核苷酸序列完全一致；同源性分析表明，水貂與雪貂同源性很高（94.2%），與豬、犀牛、駱駝、江豚同源性較高（80.8%～81.8%），與牛的同源性較低（77.4%）。系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，水貂與雪貂屬同一分支。