王磊，張然然，王洪亮，李洋，胡鵬飛，帕爾哈提，邢秀梅

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所特種經(jīng)濟(jì)動物分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長春 130112）

鹿茸是現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)的唯一一種可以完全周期性脫落再生的哺乳動物器官，每年春天鹿角脫落，鹿茸開始生長，春末夏初進(jìn)入快速生長階段，生長速度可達(dá)2cm/d，入秋后骨沉積速度明顯增加，茸皮逐漸脫水收緊失去光澤，最終脫落成為干角，至下一年春天鹿角脫落，完成一次生長周期。鹿角為硬骨組織，加之9月茸皮脫落后已經(jīng)徹底骨化成為死組織，直至來年3月才開始脫落，DNA含量少且降解嚴(yán)重，提取難度大。目前，骨、牙齒以及古DNA主要提取方法有Chelex-100法、酚仿抽提法、堿裂解法、二氧化硅（硅粒）法、試劑盒法[1-2]。賈東濤等[3]以1～16年骨骼為材料，用高溫進(jìn)行脫鈣處理，經(jīng)SDS-PK、GUSCN裂解后，用硅珠純化得到高質(zhì)量DNA，STR分型成功率高達(dá)95.5%。劉冉冉等[4]采用改進(jìn)異丙酮沉淀法提取4300～3900年前豬牙DNA，經(jīng)尿嘧啶糖苷酶（UNG）清除損傷DNA，得到優(yōu)質(zhì)DNA模板。吳微微等[5]用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）提取23例骨骼DNA，獲得14個(gè)STR分型。宋振等[6]用Handy-EcoKingfsher法、Freeze-millKingfsher法分別提取345例和32例骨、牙齒DNA，獲得優(yōu)質(zhì)DNA，成功率99.42%、96.97%。試劑盒法主要有Identifilerplus試劑盒、MiniFiler試劑盒、GodeneyeTM20A試劑盒[7]、TissueLyser-II組織破碎儀和PreFilerExpress BTATM法醫(yī)DNA提取試劑盒[8]、QIAampDNA Mini Kit[9]，均有較高的DNA提取率，并且DNA模板質(zhì)量大多符合后續(xù)試驗(yàn)要求。

本實(shí)驗(yàn)旨在通過化學(xué)試劑提取法（酚-氯仿、改良酚-氯仿）、試劑盒提取法〔DNeasyBlood & Tissue Kit（50）、QIAampDNA Investigator Kit（50）〕提取鹿角不同部位DNA，以DNA電泳條帶優(yōu)劣為依據(jù)，確定鹿角DNA取樣部位以及最適提取方法，為鹿角DNA的提取工作提出合理化建議。

1 材料與方法

1.1 材料

2018年8月，自吉林省遼源市東豐縣采購鹿角，共計(jì)63支。清水刷凈表面污垢，75%乙醇擦拭后置于陰涼通風(fēng)處，編號備用。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 主要試劑 Tris飽和酚、50 TAE緩沖液（Sangon Biotech公司）；氯仿、異丙醇（北京試劑公司）；無水乙醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；組織試劑盒〔DNeasyBlood & Tissue Kit（50），NO.69504〕、骨試劑盒〔QIAampDNA Investigator Ki（t 50）,NO.56504〕（Qiagen公司）；Marker 15000bp（TaKaRa公司）；Agarose（Transgen Biotech 公司）。

1.2.2 主要儀器 離心機(jī)（Sigma公司）；電泳儀（Junyi公司）；恒溫混勻儀（Eppendorf公司）。

1.3 方法

1.3.1 取樣 用鋼鋸從YC 1～17、YC 19～25號鹿角基部取樣，分別編號為 YC基1～17、YC基19～25；從YC1～17、YC19～25，D1、3、4，D6～10，L2～7，TH，W1、2、7，Z1～5，Z7～14，Z18～24，Z27號鹿角中部取樣，分別編號為YC中1～17，YC中19～25，D1、3、4，D6～10，L2～7，TH，W1、2、7，Z1～5，Z7～14，Z18～24，Z27。所有樣品用液氮研磨后備用。

1.3.2 化學(xué)試劑提取法 酚-氯仿法：分別取 YC基1～17，YC基19～25，YC中1～17，C中19～25，D1、D 3、D 4、D 6～10，L2～7，TH，W1、W 2、W 7，Z 1～5 樣品70 mg于1.5 mL離心管中，加入600L細(xì)胞裂解液、20L20 mg/mL蛋白酶K，900 r/min 56℃過夜消化。加入等體積酚∶氯仿（1∶1），混勻，室溫12 000 r/min離心5min，取上清于新1.5mL離心管中，重復(fù)操作2次。加入1倍體積異丙醇，混勻，室溫12 000 r/min離心2 min，棄上清。加入1 000L冰浴70%乙醇，顛倒混勻，室溫12000r/min離心1min，棄上清。開蓋，65℃干燥5min，加入60L去離子水，65℃溶解15min，取4L進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳（120V，30min），剩余樣品 20℃保存。

改良酚-氯仿法：分別取YC中1～17、YC中19～25號樣品70 mg于1.5 mL離心管中，加入600L細(xì)胞裂解液、20L 20 mg/mL蛋白酶K，900 r/min 56℃過夜消化。室溫12 000 r/min離心10 min，取上清于新離心管中，加入等體積Tris-飽和酚，混勻10 min，12 000 r/min離心10 min。取上清于新離心管中，加入等體積酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1），顛倒混勻10 min，12 000 r/min離心10 min，取上清于新離心管中，重復(fù) 1次。上清中加入等體積氯仿∶異戊醇（24∶1），顛倒混勻，10 min，12000r/min離心10min，取上清于新離心管。上清中加入0.6～1.0倍體積的異丙醇，顛倒混勻至出現(xiàn)白色絮狀沉淀，12000r/min離心5min，棄上清。加入1000L預(yù)冷75%乙醇洗滌沉淀，12 000 r/min離心3 min，棄上清，65℃干燥5 min，加入60L去離子水，65℃水化15min，取4L進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳（120V，30min），剩余樣品 20℃保存。

1.3.3 試劑盒法 DNeasyBlood & Tissue Kit法：分別稱取 YC中1～17、YC中19～25、Z 1～5、Z 7～14、Z 18～24、Z 27、D6、D 7、W2 號樣品 70 mg 于 2 mL 離心管中，加入500LATL、20L蛋白酶K，900r/min56℃過夜消化。加入556LAL，混勻，900r/min56℃30min。12000r/min離心5min，上清轉(zhuǎn)移至新2mL離心管中，加入556L無水乙醇，顛倒混勻，轉(zhuǎn)入試劑盒中自帶吸附柱內(nèi)，吸附柱置于收集管中，8000r/min離心2min，吸附柱轉(zhuǎn)入新收集管。加入700LAW1，8000r/min離心2 min，吸附柱轉(zhuǎn)入新收集管。加入700L AW2，8 000 r/min離心2 min，吸附柱轉(zhuǎn)入新收集管，12000r/min離心5min。吸附柱轉(zhuǎn)入自備1.5mL離心管，開蓋，室溫干燥10 min。加入60L去離子水，水化10 min，12 000 r/min離心5 min，取4L進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳（120 V，30 min），剩余樣品 20℃保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹿角取樣部位分析

由圖1 可知，YC基1、3、4、19、21、22、23、25 共 8個(gè)樣品有明顯條帶，輕微膠孔雜質(zhì)。由圖2可知，除YC中5、9、11、13、14、17外，共18 個(gè)樣品均有DNA條帶，存在輕微膠孔雜質(zhì)。由此表明，鹿角中部較基部DNA含量更高，適合作為鹿角DNA提取的取樣部位。

圖1 酚-氯仿法提取YC基DNA電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis results of extracting YC-based DNA by phenol-chloroform method

圖2 酚-氯仿法提取YC中DNA電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoresisresults of extracting YC-middle DNA by phenol-chloroform method

2.2 鹿角DNA提取方法分析

圖2～3顯示，酚-氯仿法和改良酚-氯仿法進(jìn)行鹿角DNA提取，膠孔都有雜質(zhì)污染，提出率相仿，但酚-氯仿方法除去過夜消化時(shí)間，40min完成DNA提取，改良酚-氯仿方法提取時(shí)間是酚-氯仿方法的3倍，即120min。圖2條帶不如圖3整齊，但酚-氯仿方法得到的圖1、4條帶均優(yōu)于圖3。圖1～4總體情況表明，酚-氯仿方法較改良酚-氯仿方法更適合用于鹿角DNA提取。

圖3 改良酚-氯仿法提取YC中DNA電泳結(jié)果Fig.3 Electrophoresis results of extracting YC-middle DNA by modified phenol-chloroform method

圖4 酚-氯仿法提取鹿角中部DNA電泳結(jié)果Fig.4 Electrophoresis results of extracting antler-middle DNA by phenol-chloroform method

D1、D3、D4、D6～10、L2～7、TH、W1、W2、W7、Z1～5共24個(gè)樣品，通過酚-氯仿方法提取DNA（圖4），24個(gè)樣品擁有清晰大片段條帶，耗時(shí)40min。用骨試劑盒進(jìn)行提取，75min得到16個(gè)能看清擁有大片段條帶的DNA樣品（圖5），雖然條帶干凈，泳道底端基本沒有降解小片段，但大部分條帶模糊，DNA含量低，加之骨提取試劑盒價(jià)格昂貴（＞2 000元），所以酚-氯仿方法較骨試劑盒更適合用于鹿角DNA提取。

圖5 QIAamp DNA Investigator Kit法提取鹿角中部DNA電泳結(jié)果Fig.5 Electrophoresis results of extracting antler-middle DNA by QIAamp DNA Investigator Kit

YC中1～17、YC中19～25，先后采用酚-氯仿（圖2）、改良酚-氯仿（圖3）、組織試劑盒（圖6）3種方法提取DNA，圖2、3中的膠孔雜質(zhì)亮度均高于圖6。圖2中5、9、11、13、14、17共6個(gè)樣品電泳條帶質(zhì)量差，圖3中5、11、17 共 3 個(gè)樣品電泳條帶質(zhì)量差，圖 6 中 5、9、11、16共4個(gè)樣品電泳條帶質(zhì)量差，提取DNA耗時(shí)分別為40、120、60min，結(jié)合圖6以及圖7電泳條帶均比圖2～3干凈工整，推斷組織試劑盒更適合提取鹿角DNA。

圖6 DNeasy Blood & Tissue Kit法提取YC中DNA電泳結(jié)果Fig.6 Electrophoresis results of extracting YC-middle DNA by DNeasy Blood & Tissue Kit

圖7 DNeasy Blood & Tissue Kit提取鹿角中部DNA電泳結(jié)果Fig.7 Electrophoresisresults of extracting antler-middle DNA by DNeasy Blood & Tissue Kit

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過對63支鹿角不同取樣部位以及不同DNA提取方法進(jìn)行研究。結(jié)果表明，鹿角中部DNA含量高于基部，更適合作為提取DNA的取樣部位；從DNA提取時(shí)間以及電泳條帶方面考慮，酚-氯仿法優(yōu)于改良后方法；在鹿角DNA提取中組織試劑盒比其他3種方法更適合用于提取鹿角DNA。綜上，以鹿角為原材料進(jìn)行DNA提取中，建議從鹿角中部取樣，液氮研磨后，用組織試劑盒（QIAGEN NO.69504）進(jìn)行DNA提取。